一種可提高飼料青貯品質(zhì)的布氏乳桿菌及其應(yīng)用的制作方法

本發(fā)明涉及一種可提高飼料青貯品質(zhì)的布氏乳桿菌及其應(yīng)用，屬于青貯飼料制備
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：未經(jīng)處理的粳稻秸稈是一種劣質(zhì)粗飼料，粗纖維含量高，可消化利用營養(yǎng)成分低，質(zhì)地粗硬，適口性差，很難被家畜有效利用。青貯可改善適口性，提高飼料營養(yǎng)價(jià)值，擴(kuò)大飼料來源，是低質(zhì)粗飼料成功貯存的有效途徑。多年來，人們已經(jīng)進(jìn)行了大量的嘗試來完善作物的發(fā)酵過程，改善青貯品質(zhì)，使更多不適于青貯的牧草或作物可以調(diào)制成優(yōu)質(zhì)青貯。其中最為生產(chǎn)者所接受的就是通過加入青貯添加劑來提高發(fā)酵品質(zhì)，抑制高水分牧草或作物青貯中真菌的生長，降低丁酸的產(chǎn)生，降低青貯原料干物質(zhì)(DM)的損失量，減少發(fā)酵過程中以及發(fā)酵完成后營養(yǎng)物質(zhì)的損失。維持青貯低pH值及嚴(yán)格厭氧環(huán)境，可以避免由丁酸菌或腸細(xì)菌所引起的二次發(fā)酵(Seconderyfermentation)。在開窖飼喂過程中，由于空氣的進(jìn)入，這類細(xì)菌在有氧或微氧狀態(tài)下可將乳酸和殘留的水溶性碳水化合物發(fā)酵為丁酸，導(dǎo)致pH值上升。從而導(dǎo)致不耐酸的可水解蛋白質(zhì)的梭狀芽孢桿菌及其它好氧微生物開始活動(dòng)，使青貯溫度升高，同時(shí)產(chǎn)生的氨使青貯的pH值進(jìn)一步升高。二次發(fā)酵不僅會(huì)導(dǎo)致能量和DM的損失，而且產(chǎn)生的丁酸及梭菌孢子會(huì)嚴(yán)重影響家畜采食量、生產(chǎn)性能甚至?xí)绊懶螽a(chǎn)品質(zhì)量。因此，抑制青貯二次發(fā)酵具有非常重要的意義。生產(chǎn)實(shí)踐中二次發(fā)酵可以通過加入使pH值迅速降低的青貯添加劑來避免。有研究表明，向青貯中加入含有heLABLactobacillusbuchneri的添加劑，可以增強(qiáng)多種牧草青貯的有氧穩(wěn)定性，降低厭氧儲(chǔ)藏階段及開窖飼喂時(shí)酵母菌的生長與存活。2013年，農(nóng)業(yè)部發(fā)布的《飼料添加劑品種目錄(2013)》中規(guī)定布氏乳桿菌可用于青貯飼料。但現(xiàn)有用于飼料青貯的乳酸菌制劑絕大多數(shù)都是多種菌組成的復(fù)合菌制劑，這類菌制劑具有制備成本高，不同菌種的最佳生長條件存在差異，青貯效果有限等問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述問題，本發(fā)明提供了一種提高飼料青貯品質(zhì)的乳酸菌制劑及其制備方法與應(yīng)用，所采取的技術(shù)方案如下：本發(fā)明的目的在于提供一種可提高飼料青貯品質(zhì)的布氏乳桿菌，其特征在于，保藏號(hào)為CGMCCNo.11078，于2015年7月15日保藏于位于北京市的中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心。保藏單位的地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。菌株的分類命名為：Lactobacillusbuchneri。含有所述布氏乳桿菌的制劑也在本發(fā)明保護(hù)范圍之內(nèi)。優(yōu)選地，所述含有布氏乳桿菌的制劑劑型為粉劑或液態(tài)制劑。優(yōu)選地，所述制劑為粉劑時(shí)，布氏乳桿菌的活菌數(shù)為1013～1014cfu/g。優(yōu)選地，所述制劑為液態(tài)制劑時(shí)，布氏乳桿菌的菌種濃度為105～107cfu/mL。更優(yōu)選地，所述液態(tài)制劑中布氏乳桿菌的菌種濃度為105cfu/mL。所述布氏乳桿菌在飼料青貯過程中的應(yīng)用。所述應(yīng)用的步驟如下：1)新鮮飼料萎蔫后粉碎，獲得飼料粉碎物；2)將含有布氏乳桿菌的制劑稀釋后配置成含有105～107cfu/mL活性布氏桿菌的菌懸液，再將菌懸液噴灑到步驟1)所得的飼料粉碎物上，混合均勻后獲得待青貯飼料；3)將步驟2)所得的待青貯飼料轉(zhuǎn)移到發(fā)酵容器中壓緊、密封，在15-25℃下，發(fā)酵55-65天獲得青貯飼料。優(yōu)選地，所述飼料為苜蓿或禾本科牧草。更優(yōu)選地，所述禾本科牧草為稻草秸稈、披堿草或老芒麥。所述布氏乳桿菌是從吉林省長春地區(qū)梅花鹿青貯飼料(以青貯玉米與柞樹枝葉等為主要原料)中分離得到的布氏乳桿菌。由申請(qǐng)人編號(hào)為布氏乳桿菌H4001。發(fā)明人取上述飼料30g，加入270ml無菌水中，227rpm/min充分震蕩1h，取上清液，梯度稀釋后，利用傾注分離方法，得到該乳酸菌。經(jīng)分離、純化，生理生化檢測(cè)，核酸檢測(cè)鑒定為布氏乳酸菌。本發(fā)明獲得的有益效果如下：本發(fā)明所提供的乳酸菌制劑，可提高青貯發(fā)酵品質(zhì)。迅速降低苜蓿、粳稻秸、老芒麥青貯pH值至4.0以下，降低老芒麥青貯干物質(zhì)損失量2.49％，降低苜蓿青貯蛋白質(zhì)損失量1％，，提高青貯中乳酸和乙酸含量，抑制丁酸產(chǎn)生，增加青貯飼料有氧穩(wěn)定性。附圖說明圖1為添加乳酸菌制劑對(duì)苜蓿貯藏穩(wěn)定性的影響。圖2為添加乳酸菌制劑對(duì)粳稻秸稈的貯藏穩(wěn)定性的影響。具體實(shí)施方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。以下實(shí)施例中所采用的試劑、材料、儀器和方法，未經(jīng)特殊說明，均為本領(lǐng)域常規(guī)試劑、材料、儀器和方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員均可通過商業(yè)渠道獲得。實(shí)施例1布氏乳桿菌的篩選和菌劑的制備從梅花鹿青貯飼料中分離得到一株優(yōu)良布氏乳桿菌H4001乳酸菌。取玉米牧草枝葉混合青貯30g，加入270ml無菌水中，227rpm/min搖床震蕩60min，攪拌器充分?jǐn)嚢?，梯度稀釋，利用傾注培養(yǎng)法進(jìn)行分離培養(yǎng)，37℃培養(yǎng)72h選擇具有溶鈣圈的菌落，采用平板劃線的方式純化5-6代，鏡檢，將純化后的乳酸菌接入改良MRS液體培養(yǎng)基中，檢測(cè)其微生物學(xué)特性，如形態(tài)學(xué)、生理學(xué)特性(表1)以及糖分解代謝(表2)的能力。以所分離菌株為核心物質(zhì)，經(jīng)過18～24h厭氧發(fā)酵，4℃，3000g/rpm離心濃縮，每100ml濃縮液添加100ml凍干保護(hù)劑(主要成分為12％無菌脫脂乳+0.2％甘油)，-45℃速凍后，利用Ella1100凍干機(jī)0.03mbar凍干24-36h，取出，無菌粉碎分裝，-4℃保存。檢測(cè)其對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)(表3)，水稻秸青貯發(fā)酵品質(zhì)(表4)的影響。1.形態(tài)學(xué)觀察、顯微鏡檢以及生理生化指標(biāo)檢測(cè)無菌條件下挑取該布氏乳桿菌H4001涂于干凈的載玻片上，制片，革蘭氏染色進(jìn)行形態(tài)學(xué)及染色結(jié)果觀察。無菌條件下將植物乳桿菌接種于相應(yīng)的培養(yǎng)基或培養(yǎng)條件下，進(jìn)行生理生化指標(biāo)的檢測(cè)觀察。表1形態(tài)學(xué)與理化試驗(yàn)結(jié)果檢測(cè)指標(biāo)特性形態(tài)學(xué)桿狀革蘭氏染色陽性形成芽孢否接觸酶-氧化酶-空氣中生長+65℃生長+45℃生長+15℃生長+pH值(培養(yǎng)24h)4.252.不同碳水化合物發(fā)酵活性檢測(cè)無菌條件下，用接種環(huán)挑取少許生長旺盛的，培養(yǎng)18-24h的布氏乳桿菌H4001，接種入北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)的不同糖發(fā)酵管內(nèi)，37℃恒溫培養(yǎng)18-24h，觀察發(fā)酵液顏色變化，以判斷對(duì)不同碳水化合物的發(fā)酵。表2不同碳水化合物發(fā)酵活性由表1,2可知，布氏乳桿菌H4001增殖迅速，可在較廣泛溫度范圍內(nèi)生長，可廣泛利用碳水化合物產(chǎn)生能量，是一株性狀優(yōu)良乳酸菌。實(shí)施例2乳酸菌制劑對(duì)苜蓿青貯發(fā)酵品質(zhì)影響2014年8月14日取內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗育草站，5年生，當(dāng)年第2次刈割的盛花期紫花苜蓿，陽光下萎蔫6h，切成3～4cm段，噴灑布氏乳桿菌H4001培養(yǎng)液，添加菌數(shù)約為每克混合牧草5×105cfu，對(duì)照組添加等量無菌水。將噴灑后的青貯原料充分混合，取900g左右裝入1000ml的青貯瓶中，壓緊，密封。發(fā)酵60d，檢測(cè)青貯發(fā)酵品質(zhì)。表3添加布氏乳桿菌H4001對(duì)苜蓿青貯pH值及有機(jī)酸含量影響由結(jié)果可知添加布氏乳桿菌可以有效降低青貯的pH值，但差異不顯著。試驗(yàn)期內(nèi)，添加組乳酸含量低于對(duì)照組，差異不顯著(p＞0.05)，但乙酸含量明顯高于對(duì)照組(p<0.05)，正丁酸含量明顯低于對(duì)照組(p<0.05)，這表明，布氏乳桿菌在一定程度上可以促進(jìn)乙酸的產(chǎn)生，減少丁酸的生成。表4添加布氏乳桿菌對(duì)苜蓿青貯營養(yǎng)成分含量影響結(jié)果表明，經(jīng)過發(fā)酵后，牧草的各成分均有不同程度的變化。對(duì)照組和添加組DM、Ash、EE、NDF、ADF變化差異均不顯著(p>0.05)。添加組可溶性糖(WCS)、CP含量明顯優(yōu)于對(duì)照組(p<0.05)。由此說明，添加布氏乳桿菌可以明顯抑制苜蓿蛋白質(zhì)降解，并保留可溶性碳水化合物含量。乳酸菌制劑對(duì)苜蓿貯藏穩(wěn)定性的影響如圖1所示。由圖1可知，隨有氧暴露時(shí)間延長，96h開始，對(duì)照組青貯中心溫度逐漸增加，至有氧暴露422h為止，對(duì)照組青貯中心溫度比添加組高2.6℃，由此表明添加布氏乳桿菌可有效提高苜蓿青貯有氧穩(wěn)定性。實(shí)施例3不同乳酸菌對(duì)粳稻秸發(fā)酵品質(zhì)的影響2015年9月30日取吉林省吉林市左家鎮(zhèn)小塘村收割去穗后粳稻秸，離地4-5cm刈割，陽光下萎蔫6h，用農(nóng)用牧草粉碎機(jī)切成3～4cm段，噴灑布氏乳桿菌培養(yǎng)液，添加菌數(shù)約為每克混合牧草5×105cfu，對(duì)照組添加等量無菌水。將噴灑后的青貯原料充分混合，取800-900g左右裝入1000ml的青貯瓶中，壓緊，密封。發(fā)酵60d，檢測(cè)青貯發(fā)酵品質(zhì)。結(jié)果如表5-6和圖2所示。表5添加布氏乳桿菌對(duì)粳稻秸青貯pH值及有機(jī)酸含量影響添加該乳酸菌制劑可明顯降低青貯pH值，增加乙酸含量(P<0.05)，降低乙醇含量(P<0.05)，同時(shí)戊酸、正丁酸、丙酸含量均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。這表明，布氏乳桿菌在一定程度上可以促進(jìn)發(fā)酵，增加乙酸的產(chǎn)生，降低乙醇、丙酸、丁酸和戊酸的生成，進(jìn)而降低青貯飼料能量損失。表6添加布氏乳桿菌對(duì)粳稻秸青貯營養(yǎng)成分含量影響與青干草相比，青貯可明顯降低DM損失量(P<0.05)。添加布氏乳桿菌組，可保存原料中WSC含量(P<0.05)，并使氨態(tài)氮含量顯著降低(P<0.05)，但中性洗滌纖維(NDF)，粗脂肪和灰分含量無顯著差異(P>0.05)，粗蛋白質(zhì)、干物質(zhì)、酸性洗滌纖維(ADF)含量明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。上述結(jié)果表明，添加該乳酸菌可以降低可溶性糖以及氨態(tài)氮的損失，但布氏乳桿菌是一種營養(yǎng)要求復(fù)雜的兼性厭氧菌，在寡營養(yǎng)狀態(tài)下將植物中蛋白質(zhì)作為氮源，以供自身的增殖生長，這一點(diǎn)可由表5和表6中明顯降低的青貯pH值和氨態(tài)氮含量可以確定，這完全有別于對(duì)照組中青貯微生物直接利用植物蛋白質(zhì)，將其降解為具有刺激性氣味的氨態(tài)氮。在苜蓿青貯中應(yīng)用該布氏乳桿菌可明顯抑制蛋白質(zhì)降解不同，出現(xiàn)這一現(xiàn)象主要與菌株本身特性有關(guān)，在不同蛋白質(zhì)含量情況下，菌株選擇不同的代謝途徑。實(shí)施例4不同布氏乳桿菌制劑對(duì)披堿草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響2014年8月14日取內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗育草站，3年生禾本科披堿草，開花期刈割，陽光下萎蔫6h，用小鍘刀切成3～4cm段，分別噴灑來源于鮮牧草附著的布氏乳桿菌Q4001稀釋液，梅花鹿青貯飼料中分離的布氏乳桿菌H4001(均于本實(shí)驗(yàn)室分離、保存)，添加菌數(shù)均為每克混合牧草5×105cfu，對(duì)照組添加等量無菌水。將噴灑后的青貯原料充分混合，取900g左右裝入1000ml的青貯瓶中，壓緊，密封。發(fā)酵60d，檢測(cè)青貯發(fā)酵品質(zhì)。表7.不同布氏乳桿菌對(duì)披堿草發(fā)酵品質(zhì)影響由結(jié)果可知，添加兩種布氏乳桿菌均可降低青貯pH值，提高青貯干物質(zhì)含量，與對(duì)照組相比，H4001對(duì)青貯pH的降低更有效，并且可明顯提高青貯干物質(zhì)含量(p<0.05)，降低青貯蛋白質(zhì)損失(p>0.05)，降低青貯中氨態(tài)氮含量，對(duì)粗脂肪、酸性以及中性洗滌纖維、粗灰分影響不顯著，可保存青貯原料中可溶性糖含量(p>0.01)，效果優(yōu)于其他來源布氏乳桿菌。表8.添加布氏乳桿菌對(duì)老芒麥青貯pH值及有機(jī)酸含量影響添加布氏乳酸菌制劑可改變青貯發(fā)酵品質(zhì)，降低青貯pH值，增加乙酸含量(P<0.05)，降低乙醇含量(P<0.05)，同時(shí)增加戊酸、丙酸含量(P<0.05)，而且添加本布氏乳酸菌與牧草來源乳酸菌相比，效果更優(yōu)。這表明，盡管布氏乳桿菌在一定程度上均可以促進(jìn)發(fā)酵，增加乙酸的產(chǎn)生，降低乙醇、丙酸、丁酸和戊酸的生成，進(jìn)而降低青貯飼料能量損失，但是不同菌株對(duì)發(fā)酵影響的最終效果不同，在相同青貯時(shí)間內(nèi)，本菌株能達(dá)到更好的青貯效果。雖然本發(fā)明已以較佳的實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可以做各種改動(dòng)和修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁1 2 3