本發(fā)明涉及屬于飼料領(lǐng)域，具體涉及一種膨化鯉魚(yú)飼料及其制備方法。
背景技術(shù)：
：微生態(tài)制劑是在微生態(tài)理論指導(dǎo)下，人工分離正常菌群，并通過(guò)特殊工藝制成的生物制劑，它具有補(bǔ)充、調(diào)整和維持動(dòng)物腸道微生態(tài)平衡的功能。從而達(dá)到防治疾病、促進(jìn)健康及提高生產(chǎn)性能的效果。它是一種綠色、環(huán)保、純生物制劑，無(wú)毒、無(wú)副作用，無(wú)殘留污染，不產(chǎn)生抗性，對(duì)水體不產(chǎn)生二次污染，因此近年來(lái)受到了廣泛的關(guān)注。以前的研究報(bào)道多見(jiàn)于普通顆粒飼料的添加，而在膨化飼料中添加微生態(tài)制劑的報(bào)道還沒(méi)有。主要是膨化制粒工藝需要經(jīng)過(guò)膨化腔的高溫高壓過(guò)程，一般的微生態(tài)菌種存活率太低，起不到有效作用。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供一種膨化鯉魚(yú)飼料。一種膨化鯉魚(yú)飼料，含有如下重量份的組分：魚(yú)粉5-10份、去皮豆粕20-40份、菜粕10-30份、面粉15-20份、米糠10-15份、豆油1-4份、膨潤(rùn)土1-3份、磷酸二氫鈣1-3份、氯化膽堿0.1-0.5份、復(fù)合維生素0.1-0.5份、復(fù)合微量元素0.1-0.5份、粉狀微生態(tài)制劑0.1-0.5份和液體微生態(tài)制劑0.5-2份。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施方案中，所述的膨化鯉魚(yú)飼料含有如下重量份的組分：魚(yú)粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨潤(rùn)土2.1份、磷酸二氫鈣2份、氯化膽堿0.3份、復(fù)合維生素0.3份、復(fù)合微量元素0.3份、粉狀微生態(tài)制劑 0.1-0.2份和液體微生態(tài)制劑1-1.5份。其中，所述的粉狀微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)優(yōu)選為80-120億cfu/g。其中，所述的粉狀微生態(tài)制劑含有枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)和短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可知，粉狀微生態(tài)制劑還可以含有本領(lǐng)域常規(guī)的保護(hù)劑、輔料、賦形劑等中的一種或多種。其中，所述的枯草芽孢桿菌優(yōu)選為枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356，所述地衣芽孢桿菌優(yōu)選為地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030，所述的短小芽孢桿菌優(yōu)選為短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756。其中，所述的液體微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)優(yōu)選為10-20億cfu/ml。其中，所述的液體微生態(tài)制劑含有屎腸球菌(Enterococcusfaecium)、約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)知曉，液體微生態(tài)制劑還可含有其它輔料，如培養(yǎng)基成分、發(fā)酵次生代謝物等。其中，所述的屎腸球菌優(yōu)選為屎腸球菌CGMCCNo.9134，所述的約氏乳桿菌優(yōu)選為約氏乳桿菌CGMCCNo.4926。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)為申請(qǐng)人從鴨腸道中分離得到。其營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞桿狀，其芽孢為橢圓或長(zhǎng)筒形，產(chǎn)生中生的橢圓形芽孢，孢囊膨大。革蘭氏染色為陽(yáng)性。在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上形成白色，不透明，不規(guī)則菌落，邊緣毛發(fā)狀，無(wú)褶皺。接觸酶陽(yáng)性，能利用丙酸鹽。能產(chǎn)生多種活性酶，如蛋白酶、纖維素酶等，提高飼料利用率，增強(qiáng)動(dòng)物消化酶的活性，促進(jìn)養(yǎng)殖動(dòng)物的生長(zhǎng)。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)申請(qǐng)人已于2012年12月25日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.7030。本發(fā)明的地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030,能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生高 活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進(jìn)動(dòng)物飼料中可以增加飼料中蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分利用率。本發(fā)明所用的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1，其顯著區(qū)別于現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌，為申請(qǐng)人從福建蝦高位池池水中分離得到，其生物學(xué)特征如下：菌落表面光滑，半透明，呈污白色，菌落圓形，邊緣成鋸齒狀；菌落形態(tài)為桿狀，大小為0.8～1.2×1.5～4.0um，芽孢形態(tài)為橢圓到柱狀，位于菌體中央或稍偏，芽孢形成后菌體不膨大。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌H8-1對(duì)濃度為2.5mg/L的氨氮、亞硝態(tài)氮降解率分別為81.72％、99.70％，能有效降解水體的氨氮和/或亞硝態(tài)氮水平。與現(xiàn)有的枯草芽孢桿菌區(qū)別于可以在0‰、3‰、15‰鹽濃度條件下均生長(zhǎng)良好，可以耐受10-15℃低溫生長(zhǎng)良好。本發(fā)明的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1已于2014年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9356。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)H8-1為養(yǎng)殖水體改良微生態(tài)制劑提供了種源，以無(wú)污染和無(wú)殘留的方式降低水中有害物質(zhì)如氨氮和亞硝態(tài)氮，提高養(yǎng)殖品質(zhì)，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)效益，具有推廣價(jià)值。本發(fā)明中的枯草芽孢桿菌H8-1對(duì)濃度為2.5mg/L的氨氮、亞硝態(tài)氮降解率分別為81.72％、99.70％。本發(fā)明屎腸球菌分離自豬腸道，并經(jīng)過(guò)紫外誘變篩選獲得。屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134的特征為：(1)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液80℃處理5min，存活率為0.18％，相對(duì)出發(fā)菌株提高22倍。(2)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.3％的豬膽鹽處理3h，存活率為20.80％，相對(duì)出發(fā)菌株提高3.04 倍。(3)屎腸球菌(Enterococcusfaecium)CGMCCNo.9134菌液用0.6％的豬膽鹽處理3h，存活率為21.6％，相對(duì)出發(fā)菌株提高27.69倍。將本發(fā)明的屎腸球菌新菌株于2014年5月8日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，登記號(hào)：CGMCCNo.9134。本發(fā)明的屎腸球菌新菌株經(jīng)過(guò)10次以上的傳代培養(yǎng)不退化，具有遺傳穩(wěn)定性，且抗逆性遠(yuǎn)遠(yuǎn)比出發(fā)菌株提高很多。本發(fā)明的約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)，是通過(guò)體外耐酸和耐膽鹽篩選得到的一株均有潛在益生功能的約氏乳桿菌，命名為約氏乳桿菌(Lactobacillusjohnsonii)YS-12，并于2011年6月8日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物保藏中心進(jìn)行了保藏，保藏號(hào)為CGMCCNo.4926。本發(fā)明的膨化鯉魚(yú)飼料含有的微生態(tài)制劑能凈化水體，降低水體的氨氮和亞硝酸鹽含量，能補(bǔ)充鯉魚(yú)內(nèi)源消化酶的不足，提高飼料轉(zhuǎn)化效率，增強(qiáng)鯉魚(yú)抗病能力，提高成活率。本發(fā)明制備的添加粉狀和液體微生態(tài)制劑的膨化鯉魚(yú)飼料，與對(duì)照組飼料相比，增長(zhǎng)率增加8％以上，餌料系數(shù)顯著降低，促生長(zhǎng)效果明顯。具體實(shí)施方式以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例1短小芽孢桿菌(Bacilluspumilus)CGMCCNo.4756菌粉制備短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756(公開(kāi)于CN201110140925.2)種子液的制備：將保藏菌種接種至裝有100mlMNB培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為225rpm；將制備好的枯草芽孢桿菌種子液按照1％的接種量接種至裝有100mLMNB培養(yǎng)基 的錐形瓶中，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為225rpm；所述的MNB培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸鎂，0.5g/L；硫酸錳，0.005g/L；pH7.0±0.2；通過(guò)發(fā)酵液的離心、濃縮、加入凍干保護(hù)劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數(shù)檢驗(yàn)等生產(chǎn)程序，最終制備出粉狀活菌制劑。實(shí)施例2地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030發(fā)酵液酶活的測(cè)定將供試菌接種于牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h后挑取菌種，懸于0.85％生理鹽水中，血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)調(diào)節(jié)濃度約5.0×107個(gè)/mL在裝有20mL產(chǎn)酶培養(yǎng)基的100mL三角瓶?jī)?nèi)接入菌懸液2mL，自然補(bǔ)給氧30℃，170r/min條件下發(fā)酵培養(yǎng)24h,液體發(fā)酵液在5000r/min條件下離心分離15min,取上清液，即為粗酶液。纖維素酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為：蛋白胨0.9％，酵母膏1.0％，CMC-Na0.5％,pH8.0.蛋白酶產(chǎn)酶培養(yǎng)基配方為：蛋白胨1.0％,酵母膏0.5％,葡萄糖1.0％,可溶性淀粉0.5％,KH2PO40.2％,MgSO4·7H2O0.05％,CaCl2·2H2O0.02％,pH7.2。(1)纖維素酶活力測(cè)定纖維素酶活力測(cè)定：按照國(guó)標(biāo)NY/T912-2004繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用DNS法測(cè)定發(fā)酵液中的纖維素酶活性。以1mL含1％(w/v)CMC-Na的pH8.0磷酸緩沖液為底物，加入0.2mL粗酶液，50℃保溫30min，然后加入2.5mLDNS試劑，沸水浴5min，冷卻至室溫后定容至5.0mL，利用分光光度計(jì)測(cè)定波長(zhǎng)540nm處的吸光度；以煮沸滅活粗酶液加入上述底物反應(yīng)液作為空白對(duì)照，以底物溶液作為陰性對(duì)照；將1mL酶液每分鐘產(chǎn)生1g葡萄糖量定義為1個(gè)酶活力單位，U/mL。經(jīng)測(cè)定，地衣芽孢桿菌CGMCC7030的發(fā)酵粗酶液的纖維素酶 活為：230.5U/mL。(2)蛋白酶活力測(cè)定蛋白酶活力的測(cè)定：采用國(guó)標(biāo)SB/T10317-1999蛋白酶活力測(cè)定法中的福林法繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。樣品測(cè)定：取15×100mm試管3支，編號(hào)1,2,3，每管內(nèi)加入粗酶液1mL，置于40℃水浴中預(yù)熱2min，再各加入經(jīng)同樣預(yù)熱的2％酪蛋白溶液(pH7.2)1mL,精確保溫l0min，時(shí)間到后，立即再各加入0.4mol三氯乙酸2mL，以終止反應(yīng),繼續(xù)置于水浴中保溫20min,使殘余蛋白質(zhì)沉淀后離心或過(guò)濾，然后另取15×150mm試管3支，編號(hào)l，2，3，每管內(nèi)加入濾液1mL，再加0.4mol碳酸鈉5mL，已稀釋的福林試劑1mL搖勻，40℃保溫發(fā)色20min后在540nm下測(cè)定OD值?？瞻自囼?yàn)也取試管3支，編號(hào)(1)，(2)，(3)，測(cè)定方法同上，唯在加2％酪蛋白之前先加0.4mol三氯乙酸2mL，使酶失活，再加入2％酪蛋白。蛋白酶活力單位定義為：1mL酶液在40℃，pH7的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μg酪氨酸的酶量為一個(gè)酶活力單位，以(U/ml)表示。福林試劑(Folin試劑)的配制方法:于200mL磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g,鉬酸鈉(Na2MO4·2H2O)25g,蒸餾水700mL，85％磷酸50mL,濃鹽酸100mL，文火回流10h。取去冷凝器，加入硫酸鋰(Li2SO4)50g，蒸餾水50mL,混勻，加人幾滴液體溴，再煮沸15min，以驅(qū)逐殘溴除去顏色，溶液應(yīng)呈黃色而非綠色。若溶液仍有綠色，需要再加幾滴澳液，再煮沸除去之。冷卻后，定容至1000mL,用細(xì)菌濾器(2.2μm)過(guò)濾，置于棕色瓶中保存。此溶液使用時(shí)加2倍蒸餾水稀釋。即成已稀釋的福林試劑。經(jīng)測(cè)定，每毫升地衣芽孢桿菌CGMCC7030發(fā)酵粗酶液的蛋白 酶活力為1500U/mL。產(chǎn)酶試驗(yàn)表明，本發(fā)明的地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030,能夠通過(guò)發(fā)酵產(chǎn)生高活性的纖維素酶與蛋白酶，添加進(jìn)動(dòng)物飼料中可以增加飼料中蛋白質(zhì)、纖維素和半纖維素等成分的分解，提高飼料營(yíng)養(yǎng)成分利用率，同時(shí)降低動(dòng)物糞便中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的含量，減輕對(duì)環(huán)境的污染，具有很高的飼用價(jià)值。實(shí)施例3地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030凍干粉的制備地衣芽孢桿菌菌粉的制備方法，包括如下的步驟(1)平板培養(yǎng)復(fù)壯：將地衣芽孢桿菌菌種接種于平板培養(yǎng)基上，于30℃培養(yǎng)18h，使地衣芽孢桿菌復(fù)壯，并形成單菌落，挑取單菌落于接種平板培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)24h；所述平板培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，瓊脂2％，pH7.0±0.2。(2)一級(jí)種子液的制備：將步驟(1)培養(yǎng)的地衣芽孢桿菌菌種轉(zhuǎn)接至裝有10mL培養(yǎng)基的試管中，30℃搖床培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速為170rpm,使處于對(duì)數(shù)后期，得一級(jí)種子液；(3)二級(jí)種子液的制備：將步驟(2)制備的一級(jí)種子液按1％接種量接種于裝有75ml培養(yǎng)基的容量為250ml的錐形瓶中，30℃恒溫?fù)u床培養(yǎng)16h，轉(zhuǎn)速為170rpm,得二級(jí)種子液；種子培養(yǎng)基配方為：胰蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化鈉1％，pH7.0±0.2。(4)地衣芽孢桿菌發(fā)酵液的制備：將步驟(3)中的種子液按接種量為1％接種到100L的發(fā)酵罐中，裝樣量20％，溫度30℃，轉(zhuǎn)速250rpm好氧培養(yǎng)至芽孢生成率80％以上，活菌數(shù)為1010CFU/ml以上,則放罐終止發(fā)酵，得地衣芽孢桿菌發(fā)酵液；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為：麩皮2％，玉米粉1％、豆粕2％,硫酸銨2％，硫酸鎂0.03％；檸檬酸銨0.5％，pH為7.0-7.4。(5)地衣芽孢桿菌凍干菌粉的制備：將步驟(4)制備的發(fā)酵液離心后，在菌泥中加入10％的凍干保護(hù)劑(凍干保護(hù)劑配方為：脫脂奶粉10％，乳糖10％，甘油0.5％，維生素C0.2％，蒸餾水79.3％)，混勻后冷凍干燥，得到水分含量＜5％的地衣芽孢桿菌菌粉，每克凍干菌粉中活菌數(shù)約為400億。實(shí)施例4枯草芽孢桿菌的篩選與鑒定取來(lái)自于天津武清、福建、江蘇魚(yú)塘和蝦塘的水樣和泥樣124個(gè)，取1mL水樣或泥樣1g于18ml試管的9mLLB液體培養(yǎng)基中，85℃水浴處理10min。將高溫處理后的試管放在溫度為30℃，180rpm的好氧條件下恒溫振蕩培養(yǎng)16h后得到富集培養(yǎng)液。采用倍比稀釋法將富集培養(yǎng)液進(jìn)行梯度稀釋，涂布于LB固體培養(yǎng)基上，放置于30℃恒溫箱中進(jìn)行培養(yǎng)20h，挑取平板上所生長(zhǎng)的不同單菌落進(jìn)行劃線，并純化兩次，獲得活的單菌落，共獲得275株菌。將純化兩次后的單菌落，用牙簽點(diǎn)種在新鮮的溶血板上，放置于30℃恒溫箱中觀察24h、48h、72h，是否出現(xiàn)溶血圈，根據(jù)使血細(xì)胞瓊脂溶血的能力分類：1)α溶血：草綠色溶血，菌落周圍培養(yǎng)基出現(xiàn)1～2mm的草綠色環(huán)，為高鐵血紅蛋白所致；2)β溶血：完全溶血，菌落周圍形成一個(gè)完全清晰透明的溶血環(huán)，是細(xì)菌產(chǎn)生的溶血素使紅細(xì)胞完全溶解所致；3)γ溶血：不溶血。將有溶血圈菌株淘汰。將無(wú)溶血性菌株在選擇性固體培養(yǎng)基上劃線，生長(zhǎng)良好的菌株用LB液體培養(yǎng)，在30℃恒溫?cái)U(kuò)大培養(yǎng)16h。固體選擇性培養(yǎng)基為兩種：以NH4+-N為唯一氮源的氨氮選擇性培養(yǎng)基和以NO2--N為唯一氮源的亞硝態(tài)氮培養(yǎng)基；氨氮選擇性固體培養(yǎng)基為每L由(NH4)2SO40.5g，琥珀酸鈉 2.17g，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20g和余量的水組成，pH7.0-7.2，115℃高壓滅菌20min，所述維氏鹽溶液為每L由K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O2.5g，NaCl2.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.05g，MnSO4·4H2O0.05g和余量的水組成；亞硝態(tài)氮選擇性固體培養(yǎng)基為每L由NaNO20.5g，琥珀酸鈉2.17g，維氏鹽溶液50mL，瓊脂20g和余量的水組成，pH7.0-7.2，115℃高壓滅菌20min，所述維氏鹽溶液為每L由K2HPO45.0g，MgSO4·7H2O2.5g，NaCl2.5g，F(xiàn)eSO4·7H2O0.05g，MnSO4·4H2O0.05g和余量的水組成。最終獲得無(wú)溶血圈且在氨氮和亞硝態(tài)氮選擇性固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)良好的63株芽孢桿菌。在超凈臺(tái)中，將63株待測(cè)菌株菌液接入相應(yīng)的篩選培養(yǎng)基中，接種終濃度為5×105CFU/mL，重復(fù)數(shù)為3；放入搖床中進(jìn)行培養(yǎng)30℃，180r/min，培養(yǎng)48h；均勻取樣到1.5mL離心管中，12000rpm離心3min，取上清200μL加入96孔板；測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，在96孔板中加入待測(cè)樣上清液200μL后，每孔先后加入格里斯試劑A、B各20μL，于550nm比色測(cè)定；測(cè)定銨態(tài)氮時(shí)，每孔加入納氏試劑20μL，于450nm比色測(cè)定；篩選培養(yǎng)基為兩種：氨氮篩選培養(yǎng)基和亞硝態(tài)氮篩選培養(yǎng)基；氨氮篩選培養(yǎng)基為每50mL由(NH4)2SO4母液50μl，市售粉碎蝦料0.05g和余量的水組成，銨態(tài)氮濃度為：2.5mg/l；亞硝態(tài)氮篩選培養(yǎng)基為每50mL由NaNO2母液50μl，市售粉碎蝦料0.05g和余量的水組成，亞硝態(tài)氮濃度為：2.5mg/l。硫酸銨母液為稱取9g(NH4)2SO4加入1L模擬蝦池水，此時(shí)銨態(tài)氮濃度約為：2.5g/l；亞硝酸鈉母液為稱取3.75gNaNO2加入1L模擬蝦池水，此時(shí)亞硝態(tài)氮濃度約為：2.5g/l。選取氨氮降解率高于30％的10株菌(編號(hào)為A1-A10)或亞硝酸氮降解率高于70％的10株菌(編號(hào)為Y1-Y10)，以不接種任何菌株為陰性對(duì)照(CK)，進(jìn)行重復(fù)測(cè)定。測(cè)定方法：在超凈臺(tái)中，將待測(cè)菌株菌液接入相應(yīng)篩選培養(yǎng)基中，接種終濃度為5×105CFU/mL，重復(fù)數(shù)為3；放入搖床中進(jìn)行培養(yǎng)30℃，180r/min，培養(yǎng)24h、48h；均勻取樣到1.5mL離心管中，12000r/min離心3min，取上清200μL加入96孔板。測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，在96孔板中加入待測(cè)樣上清液200μL后，每孔先后加入格里斯試劑A、B各20μL，于550nm比色測(cè)定；測(cè)定氨氮時(shí)每孔加入納氏試劑20μL，于450nm比色測(cè)定。定性測(cè)定：測(cè)定亞硝態(tài)氮時(shí)，溶液變?yōu)榉奂t色、玫瑰紅色、橙色或棕色等表示有亞硝酸鹽還原，反應(yīng)為陽(yáng)性，即顏色越淺說(shuō)明降解效果越佳；測(cè)定銨態(tài)氮時(shí)，溶液變?yōu)槌壬?、黃色等為陽(yáng)性反應(yīng)，淺為佳。定量測(cè)定：制定亞硝態(tài)氮濃度(Y1)與測(cè)定OD值(X1)之間參考標(biāo)準(zhǔn)曲線及氨氮濃度(Y2)與測(cè)定OD值(X2)之間參考標(biāo)準(zhǔn)曲線。篩選培養(yǎng)基包括氨氮篩選培養(yǎng)基和亞硝態(tài)氮篩選培養(yǎng)基；氨氮篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO4母液50μl，蝦料0.05g，蒸餾水50mL，氨氮濃度約為：2.5mg/L，121℃滅菌。硫酸銨母液：稱取9g(NH4)2SO4加入1L蒸餾水，此時(shí)銨態(tài)氮濃度約為：2.5g/l。亞硝氮篩選培養(yǎng)基：NaNO2母液50μl，蝦料0.05g，蒸餾水50mL，亞硝氮濃度約為：2.5mg/l，121℃滅菌。亞硝酸鈉母液：稱取3.75gNaNO2加入1L蒸餾水，此時(shí)亞硝態(tài)氮濃度約為：2.5g/l。格里斯氏試劑(Griess)A：對(duì)氨基苯磺酸0.5g，稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光，4℃保存。格里斯氏試劑B：α萘胺0.1g，蒸餾水20mL,稀醋酸(10％左右)150mL，棕色瓶避光4℃保存。納氏試劑：現(xiàn)購(gòu)即可，4℃保存。結(jié)果如表1和表2所示，H8-1的平均氨氮降解率為81.72％，平均亞硝降解率為99.70％，降氮能力最高。表110株優(yōu)選菌株氨氮降解率比較測(cè)定(A10號(hào)為H8-1)菌株號(hào)A1A2A3A4A5A6A7A8A9A10ck24h氨氮34.09630.00019.78945.70237.72839.98559.57421.27775.48779.5720.01148h氨氮45.89735.78638.93156.97140.30244.81831.40540.62661.07983.8730.441表210株優(yōu)選菌株亞硝態(tài)氮降解率比較測(cè)定(Y10號(hào)為H8-1)菌株號(hào)Y1Y2Y3Y4Y5Y6Y7Y8Y9Y10ck24h亞硝83.12174.37490.67192.33275.62974.50690.46795.71492.19699.6030.00248h亞硝83.01874.50890.12893.67175.45770.16592.46796.54194.46799.8062.443將篩選到的枯草芽孢桿菌H8-1于2014年6月18日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，簡(jiǎn)稱CGMCC，地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCCNo.9356。實(shí)施例5不同鹽濃度條件下H8-1生長(zhǎng)情況比較使用鹽度分別為0‰、3‰、15‰的水配制LB固體培養(yǎng)基，用滅菌后的牙簽點(diǎn)種H8-1在不同鹽度的平板上，放置于30℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16h，觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，點(diǎn)種在三種鹽度不同的平板上的菌落生長(zhǎng)均良好，生長(zhǎng)完成后的菌落大小較一致，說(shuō)明H8-1耐鹽性能強(qiáng)。LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化鈉10g/L；瓊脂粉15g/L。用鹽度計(jì)配制鹽度分別為0‰、3‰、15‰的水，進(jìn)行培養(yǎng)基的配制。實(shí)施例6不同鹽濃度條件下H8-1降氮性能測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3，如表所示，在0‰、3‰、15‰鹽度下，H8-1的降氮性能有所差別，但受鹽度的影響很小。表3在不同鹽度下測(cè)定H8-1的降氮性能氨氮篩選培養(yǎng)基：(NH4)2SO4母液50μl，蝦料0.05mg，分別使用不同鹽度的水(0‰鹽度的水：蒸餾水；3‰和15‰鹽度的水:添加海鹽到蒸餾水中，用鹽度計(jì)測(cè)定，達(dá)到鹽度分別為3‰和15‰)50mL，氨氮濃度約為：2.5mg/L，121℃滅菌。硫酸銨母液：稱取9g(NH4)2SO4加入1L蒸餾水，此時(shí)銨態(tài)氮濃度約為：2.5g/l。亞硝氮篩選培養(yǎng)基：NaNO2母液50μl，蝦料0.05mg，不同鹽度的水50mL，亞硝氮濃度約為：2.5mg/l，121℃滅菌。亞硝酸鈉母液：稱取3.75gNaNO2加入1L蒸餾水，此時(shí)亞硝態(tài)氮濃度約為：2.5g/l。實(shí)施例7在低溫條件下H8-1生長(zhǎng)情況用滅菌后的牙簽點(diǎn)種H8-1單菌落在LB固體平板上，分別放置在溫度為10℃、15℃、30℃培養(yǎng)箱中24h，觀察平板上菌落生長(zhǎng)情況。培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，在10℃和15℃培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)的平板上菌落大小相似，均為生長(zhǎng)在30℃培養(yǎng)箱中平板上菌落大小的1/2，這說(shuō)明H8-1在溫度較低的養(yǎng)殖環(huán)境中也能夠正常生長(zhǎng)而發(fā)揮降氮功能。LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨：10g/L；酵母提取物5g/L；氯化鈉10g/L；瓊脂粉15g/L。實(shí)施例8枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356菌粉的制備：枯草芽孢桿菌種子液的制備：將保藏菌種接種至裝有100mlMNB培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為225rpm；將制備好的枯草芽孢桿菌種子液按照1-3％的接種量接種至裝有100mLMNB培養(yǎng)基的錐形瓶中，30℃恒溫?fù)u床中培養(yǎng)16h，搖床轉(zhuǎn)速為225rpm；所述的MNB培養(yǎng)基配方如下：葡萄糖，5.0g/L；蛋白胨，5.0 g/L；牛肉膏，3.0g/L；酵母浸粉，1.0g/L；七水硫酸鎂，0.5g/L；硫酸錳，0.005g/L；pH7.0±0.2；通過(guò)發(fā)酵液的離心、濃縮、加入凍干保護(hù)劑、真空冷凍干燥及菌粉活菌數(shù)檢驗(yàn)等生產(chǎn)程序，最終制備出粉狀活菌制劑。實(shí)施例9粉狀微生態(tài)制劑制備將制備的枯草芽孢桿菌CGMCCNo.9356的菌粉、地衣芽孢桿菌CGMCCNo.7030的菌粉，短小芽孢桿菌CGMCCNo.4756的菌粉按重量比1:1:1混合后，即得本發(fā)明的分裝芽孢桿菌，粉狀微生態(tài)制劑中的活菌數(shù)約為110億cfu/g。實(shí)施例10約氏乳桿菌CGMCCNo.4926發(fā)酵液的制備1)將冷凍保存的約氏乳桿菌CGMCCNo.4926在MRS瓊脂平板活化三次，挑取單菌落接種于10mL深層MRS液體試管，37℃培養(yǎng)10小時(shí)后，以1％接種量轉(zhuǎn)接于250mLMRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)10小時(shí)后作為種子液；2)以5％的接種量將步驟1)所得的種子液接種于5L的發(fā)酵罐中培養(yǎng)；3)發(fā)酵過(guò)程中維持發(fā)酵液pH值為6.0，當(dāng)pH超過(guò)設(shè)定值時(shí)，補(bǔ)加料液；當(dāng)pH低于設(shè)定值時(shí)，自動(dòng)流加堿性中和劑氨水；在溫度37℃、轉(zhuǎn)速100rpm條件下發(fā)酵14小時(shí)，發(fā)酵過(guò)程通入N2，維持溶氧小于1％；4)當(dāng)補(bǔ)加料液pH不再降低或發(fā)酵液在600nm波長(zhǎng)下的吸光值(即OD600)不再增加時(shí)，終止發(fā)酵，即得約氏乳桿菌活菌數(shù)達(dá)1011cfu/ml以上的發(fā)酵液。實(shí)施例11屎腸球菌CGMCCNo.9134菌液制備1)培養(yǎng)基滅菌：培養(yǎng)基配方：10g/L果糖、50g/L牛肉膏、10g/L酵母膏、15g/L 硫酸鎂、15g/LNaCl、15％CaCO3。配制培養(yǎng)基，注水(自來(lái)水即可)，滅菌溫度為115℃，時(shí)間為20min，調(diào)節(jié)pH值至6.8；2)穩(wěn)定理化指標(biāo)：發(fā)酵罐轉(zhuǎn)速50rpm，通風(fēng)1:0.1vvm，罐壓維持在0.05MPa，液體理化指標(biāo)穩(wěn)定后，標(biāo)定溶解氧。3)接種發(fā)酵：按照1％的比例接種，培養(yǎng)條件：溫度20℃，轉(zhuǎn)速50rpm，罐壓為0.01兆帕，通風(fēng)量為1:0.1vvm。該狀態(tài)下，培養(yǎng)10h下罐，下罐時(shí)活菌數(shù)為1×109cfu/ml以上。實(shí)施例12液體微生態(tài)制劑制備將屎腸球菌CGMCCNo.9134的發(fā)酵液與約氏乳桿菌CGMCCNo.4926按體積比1:1的比例進(jìn)行混合，即得本發(fā)明的液體微生態(tài)制劑，其中，活菌數(shù)約為20億cfu/ml。實(shí)施例13鯉魚(yú)膨化飼料制備魚(yú)粉10份、去皮豆粕40份、菜粕10份、面粉20份、米糠15份、豆油4份、膨潤(rùn)土1份、磷酸二氫鈣3份、氯化膽堿0.1份、復(fù)合維生素0.5份、復(fù)合微量元素0.5份、粉狀微生態(tài)制劑0.5份和液體微生態(tài)制劑0.5份。按重量份稱取魚(yú)粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進(jìn)行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態(tài)制劑混合均勻后投入到超細(xì)微粉碎機(jī)中，粉碎成90％過(guò)80目的粉狀飼料，再進(jìn)行膨化制粒；膨化制粒后通過(guò)后噴涂將液體微生態(tài)制劑添加到顆粒表面，烘干。實(shí)施例14鯉魚(yú)膨化飼料制備魚(yú)粉5份、去皮豆粕20份、菜粕30份、面粉15份、米糠10 份、豆油1份、膨潤(rùn)土3份、磷酸二氫鈣1份、氯化膽堿0.5份、復(fù)合維生素0.1份、復(fù)合微量元素0.1份、粉狀微生態(tài)制劑0.1份和液體微生態(tài)制劑2份。按重量份稱取魚(yú)粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進(jìn)行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態(tài)制劑混合均勻后投入到超細(xì)微粉碎機(jī)中，粉碎成90％過(guò)80目的粉狀飼料，再進(jìn)行膨化制粒；膨化制粒后通過(guò)后噴涂將液體微生態(tài)制劑添加到顆粒表面，烘干。實(shí)施例15鯉魚(yú)膨化飼料制備魚(yú)粉9份、去皮豆粕30份、菜粕20份、面粉18份、米糠11份、豆油2份、膨潤(rùn)土2.1份、磷酸二氫鈣2份、氯化膽堿0.3份、復(fù)合維生素0.3份、復(fù)合微量元素0.3份、粉狀微生態(tài)制劑0.2份和液體微生態(tài)制劑1.5份。按重量份稱取魚(yú)粉、去皮豆粕、棉粕、菜粕和米糠，先進(jìn)行初次粉碎，然后與其他原料和粉狀微生態(tài)制劑混合均勻后投入到超細(xì)微粉碎機(jī)中，粉碎成90％過(guò)80目的粉狀飼料，再進(jìn)行膨化制粒；膨化制粒后通過(guò)后噴涂將液體微生態(tài)制劑添加到顆粒表面，烘干。試驗(yàn)例1本試驗(yàn)于2015年7月5日至9月5日在大北農(nóng)集團(tuán)唐山玉田水產(chǎn)試驗(yàn)基地進(jìn)行，共4組試驗(yàn)，1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)試驗(yàn)組。試驗(yàn)組1-3分別為實(shí)施例13-15制備的膨化鯉魚(yú)飼料，對(duì)照組其他成分同實(shí)施例15，區(qū)別在于不添加微生態(tài)制劑。每個(gè)試驗(yàn)組設(shè)4個(gè)重復(fù)，共16個(gè)養(yǎng)殖桶(800L/桶)，每桶放30尾鯉魚(yú)(50.13±0.15克)。養(yǎng)殖期間日投飼率為體重的3％，上下午各投喂一次，每?jī)芍芊Q重調(diào)整一次投喂量。每天下午換水1/3，以保證養(yǎng)殖水體符合漁業(yè)養(yǎng)殖水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求，試驗(yàn)結(jié)束后每桶隨機(jī)取5尾魚(yú)測(cè)定體長(zhǎng)、體重等生長(zhǎng)指標(biāo)。試驗(yàn)結(jié)束后各組鯉魚(yú)的成活率均為100％，其生長(zhǎng)數(shù)據(jù)測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4：表4各試驗(yàn)組生長(zhǎng)指標(biāo)組別魚(yú)體初重(g)魚(yú)體末重(g)增重率％餌料系數(shù)肥滿度％對(duì)照組50.28±0.0777.67±2.2854.48±3.60a2.15±0.18a2.56±0.05a試驗(yàn)組150.10±0.2581.48±3.1562.63±4.25b2.03±0.21b2.48±0.11a試驗(yàn)組250.08±0.1582.38±3.0764.49±4.19b1.98±0.25b2.53±0.13a試驗(yàn)組350.06±0.1283.17±2.1266.14±3.59b1.86±0.21b2.64±0.12b注：同一列中具不同上標(biāo)字母表示差異顯著(P<0.05)。從增重率來(lái)看，本發(fā)明的3個(gè)試驗(yàn)組的增重率均顯著高于對(duì)照組，其中試驗(yàn)組1高于對(duì)照組8.15％，試驗(yàn)組2高于對(duì)照組10.01％，試驗(yàn)組3高于對(duì)照組11.66％；餌料系數(shù)方面，3個(gè)試驗(yàn)組也顯著低于對(duì)照組；從肥滿度來(lái)看，試驗(yàn)組3顯著高于對(duì)照組。由以上分析結(jié)果可知，膨化飼料中添加微生態(tài)制劑后，可以顯著提高鯉魚(yú)的生長(zhǎng)速度，降低餌料系數(shù)。以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和潤(rùn)飾，這些改進(jìn)和潤(rùn)飾也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)范圍。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3