玉米紋枯病抗病基因grmzm2g456997及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種玉米紋枯病抗病相關(guān)基因GRMZM2G456997，其基因序列如SEQ ID NO.1所示。同時(shí)還公開(kāi)了該基因的編碼區(qū)基因如SEQ ID NO.2所示，以及該序列翻譯的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。將GRMZM2G456997基因的超量表達(dá)載體轉(zhuǎn)入玉米植株后，GRMZM2G456997基因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化玉米對(duì)紋枯病菌的抗性明顯增強(qiáng)，證明GRMZM2G456997基因在玉米抗紋枯病中發(fā)揮重要作用。
【專利說(shuō)明】玉米紋枯病抗病基因 GRMZM2G456997及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 其在作物改良提高對(duì)紋枯病抗性中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物在生長(zhǎng)的過(guò)程，受到多種病原物的侵害。植物病原物的種類繁多，包括病毒、 細(xì)菌、真菌和線蟲(chóng)等。病原物侵入植物導(dǎo)致兩種結(jié)果：（1)病原體成功的在寄主植物內(nèi)繁 殖，引起相關(guān)病癥；（2)寄主植物產(chǎn)生抗病反應(yīng)，殺死病原物或阻止其生長(zhǎng)。利用抗性基因 資源改良植物的抗病性，是預(yù)防病害同時(shí)又保護(hù)環(huán)境的根本出路。
[0003] 植物的抗病反應(yīng)是多基因參與調(diào)控的復(fù)雜過(guò)程。參與植物抗病反應(yīng)的基因分為兩 類：（1)抗病基因，又稱R (resistance)基因和（2)抗病相關(guān)基因。
[0004] 根據(jù)目前人們對(duì)抗病基因功能的認(rèn)識(shí)，這類基因的產(chǎn)物主要是作為受體，直接或 間接與病原蛋白相互作用，啟動(dòng)植物體內(nèi)的抗病信號(hào)傳導(dǎo)路徑（Tang等，1996，Science 274: 2060-2063 ;Baker 等，1997, Science 276: 726-733 ;Jia 等，2000, EMBO J. 19: 4004-4014 ;Dangl 和 Jones，2001，Nature 411: 826-833 ;Nimchuk 等，2001，Curr. Opin. Plant Biol. 4: 288-294)?？共』蚪閷?dǎo)的抗病反應(yīng)強(qiáng)，是很好的基因資源。但由于下述 原因，使利用抗病基因改良植物抗性受到限制：（1)抗病基因的資源有限，如目前知道的抵 抗水稻重要病害白葉枯病的抗病基因少于30個(gè)，抵抗另一水稻重要病害-稻瘟病的抗病基 因也只有大約40個(gè)；（2)抗病基因具有病原種類和病原生理小種特異性，抗病范圍有限； (3)因?yàn)椴≡目焖偻蛔?，一個(gè)抗病基因的作用往往幾年或者十幾年后就喪失了。
[0005] 抗病相關(guān)基因是指除抗病基因外所有參與抗病反應(yīng)的基因，它們的編碼產(chǎn)物參與 合成植物體內(nèi)抗病信號(hào)分子、參與信號(hào)傳導(dǎo)或參與防衛(wèi)反應(yīng)等。這類基因的共同特點(diǎn)是病 原誘導(dǎo)后它們的表達(dá)量升高或減少，因此人們可以根據(jù)病原誘導(dǎo)前后基因的表達(dá)量的差異 大規(guī)模地鑒定植物抗病相關(guān)基因（Maleck等，2000，Nature Genet. 26 :403-410 ;Schenk 等，2000, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97: 11655-11660 ;Zhou 等，2002, Science in China 45: 449-467)。目前，人們對(duì)抗病相關(guān)基因的認(rèn)識(shí)有限。根據(jù)已有報(bào)道，絕大多數(shù)抗 病相關(guān)基因單獨(dú)作用時(shí)的抗性能力可能比抗病基因小。但根據(jù)下述原因，它們是值得大力 開(kāi)發(fā)的基因資源：（1)由于絕大多數(shù)抗病相關(guān)基因的產(chǎn)物不需要直接與病原物相互作用， 這類基因是具有持久抗性的基因資源；（2)大多數(shù)抗病相關(guān)基因參與的抗病反應(yīng)沒(méi)有病原 特異性，因此它們是具有廣譜抗性的基因資源；（3)這類基因的資源豐富。
[0006] 植物的抗病反應(yīng)可以分為兩大類。長(zhǎng)期以來(lái)研宄者們對(duì)這兩大類抗病反應(yīng)給 予了不同名稱，如垂直抗性和水平抗性（Van Der Plank等，1968，Disease Resistance in Plants，Academic，New York)、質(zhì)量抗性和數(shù)量抗性（Ou 等，1975，Phytopathology 65: 1315-1316)、完全抗性和部分抗性（Parlevliet，1979，Annu. Rev. Phytopathol. I: 203-222)。質(zhì)量抗性(或垂直抗性或完全抗性）是抗病基因介導(dǎo)的抗病反應(yīng)。數(shù)量抗性(或 水平抗性或部分抗性）是由數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL)調(diào)控的抗病 反應(yīng)，它被認(rèn)為無(wú)病原特異性，而且抗性持久（Roumen，1994, Rice Blast Disease，Zeigler 等編著，CAB International，Cambridge，UK，pp. 245-265)。目前，人們對(duì)植物抗病 QTL 的基因本質(zhì)還不清楚。因此，雖然已經(jīng)鑒定出了大量抗病QTL，如水稻抗白葉枯病QTL (Li 等，1999, Mol. Gen. Genet. 261:58-63)、抗稻瘟病 QTL (Wang 等，1994, Genetics 136: 1421-1434 ;Chen 等，2003, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100: 2544-2549)、抗紋枯病 QTL (Li 等，1995,Theor. Appl. Genet. 91: 382-388)和抗病毒病 QTUAlbar 等，1998,Theor. Appl. Genet. 97: 1145-1154)等，但這些抗性QTL沒(méi)有被很好地用于植物抗病性的改良。
[0007] 近年研宄發(fā)現(xiàn)很多抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)，提示這些抗病 相關(guān)基因可能就是相對(duì)應(yīng)的QTL。抗病相關(guān)基因的染色體位置與抗病QTL相對(duì)應(yīng)這一現(xiàn)象 在多種植物中都被觀察到，包括水稻（Xiong等，2002,中國(guó)科學(xué)45: 518-526 ;Ramalingam 等，2003, Mol. Plant-Microbe Interact. 16: 14-24 ;Wen 等，2003, Mol. Gen. Genomics 269: 331-339 ;Chu 等，2004, Mol. Gen. Genomics 271: 111-120)、小麥（Faris 等， 1999，Theor. Appl. Genet. 98 :219_225)、豆類（Geffroy 等，2000，Mol. Plant-Microbe Interact. 13: 287-296)和馬鈴薯（Trognitz 等，2002，Mol. Plant-Microbe Interact. 15: 587-597)。這些結(jié)果為采用候選基因策略分離、克隆和利用抗病QTL的基因提供了依 據(jù)。
[0008] 玉米和水稻是世界上重要的糧食作物，但紋枯病常常造成其產(chǎn)量和品質(zhì)的下降， 并且玉米和水稻紋枯病菌可以互相侵染。因此，了解紋枯病的發(fā)病機(jī)制，有助于利用高效途 徑改良玉米和水稻品種的抗性，控制病害的發(fā)生，減少或避免植物病害所帶來(lái)的損失。分離 克隆抗病相關(guān)基因是對(duì)玉米和水稻抗病機(jī)理研宄的前提。同時(shí)，與抗病基因的應(yīng)用相比，抗 病相關(guān)基因的應(yīng)用能提供植物更為廣譜及長(zhǎng)效的抗性。通過(guò)超量表達(dá)抗病相關(guān)基因進(jìn)行玉 米和水稻品種的改良，將進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗病性，拓寬植物的抗譜。這些方面是采用常規(guī) 植物育種和改良技術(shù)所不能達(dá)到的。因此如何利用玉米抗病基因的克隆獲得抗病植株成為 亟待解決的問(wèn)題之一。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 本發(fā)明的發(fā)明人針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)的情況要解決的技術(shù)問(wèn)題，提供了一個(gè)從玉米 中分離克隆出的抗病相關(guān)基因整編碼區(qū)段的DNA片段。其基因的序列如 序列表SEQ ID NO. 1所示，編碼序列如序列表SEQ ID NO. 2所示，編碼氨基酸序列如序列表 SEQ ID NO. 3 所示。
[0010] 該基因仰片段來(lái)源于玉米B73,其通過(guò)特殊設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增玉米B73 cDNA獲得，其中所述的引物包括引物1，5< -ATGGAGTACTCGTCTACTAGGG-3'其序列如序列 表SEQ ID NO. 4所示，引物2,5< -CTAGTAGGGTCTCTGTCCGCHV 其序列如序列表SEQ ID NO. 5 所示，之后利用強(qiáng)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)原理的轉(zhuǎn)基因技術(shù)，將因的超量表達(dá)載體 轉(zhuǎn)入水稻品種中花11。因表達(dá)量顯著提高的遺傳轉(zhuǎn)化水稻對(duì)紋枯病菌的 抗性明顯增強(qiáng)，證明你堪因在水稻抗紋枯病中發(fā)揮重要作用。
[0011] 之所以采用上述的方法，主要是由于將克隆的抗病相關(guān)基因轉(zhuǎn)入感病的植物，有 助于產(chǎn)生新的抗病植物。特別是可以用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)在植物中累加多個(gè)抗性基因，而不會(huì) 產(chǎn)生傳統(tǒng)育種技術(shù)中伴隨出現(xiàn)的連鎖基因組序列。而抗病相關(guān)基因的克隆是克服傳統(tǒng)育種 不能植物種間轉(zhuǎn)移抗病相關(guān)基因問(wèn)題的前提。
[0012] 通過(guò)實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的內(nèi)容，可以達(dá)到以下效果： (1) 發(fā)明人在國(guó)際上首次提供了玉米紋枯病抗病相關(guān)基因 GRMZM2G456997,并且成功驗(yàn) 證了其功能； (2) 利用其功能最終發(fā)現(xiàn)采用超量表達(dá)之后可以賦予植物對(duì)由紋枯病菌所引起的病 害產(chǎn)生抗病反應(yīng)，獲得高抗病植株。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0013] 附圖用來(lái)提供對(duì)本發(fā)明的進(jìn)一步理解，并且構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分，與本發(fā)明的實(shí) 施例一起用于解釋本發(fā)明，并不構(gòu)成對(duì)本發(fā)明的限制。在附圖中： 圖1是接種紋枯病菌YWK62和YWK196后GRMZM2G456997基因的表達(dá)檢測(cè)； 圖2是6----?g量表達(dá)Tl代遺傳轉(zhuǎn)化植株接種紋枯病菌YWK1967天后結(jié)果 示意圖； 圖3為圖2中結(jié)果的柱狀圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014] 以下對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行說(shuō)明，應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的優(yōu)選實(shí)施例僅用 于說(shuō)明和解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
[0015] 實(shí)施例1 因接種紋枯病菌后的表達(dá)模式： 為了檢測(cè)因受紋枯病菌誘導(dǎo)表達(dá)模式，利用qRT-PCR檢測(cè)了這個(gè)基 因接種病原菌后的表達(dá)，所用引物為引物3,5< -TGATTAGGTTTCTTGTGAACCTACTCA-3'其序 列如序列表SEQ ID NO. 6所示，引物4,5< -CACCCCACACAGAACATACACAT-3'其序列如序列 表SEQ ID NO. 7所示。如圖1所示，圖1是接種紋枯病菌YWK62和YWK196后仰怒麗如必你沒(méi)7 基因的表達(dá)檢測(cè)；結(jié)果表明，接種紋枯病菌后你9冷皮誘導(dǎo)表達(dá)，在接種8h后表 達(dá)達(dá)到峰值隨后逐漸降低；說(shuō)明，你9堪因能夠受YWK196和YWK62的誘導(dǎo)，說(shuō)明 堪因參與了玉米對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)。
[0016] 實(shí)施例2 分離克隆GRMZM2G456997基因： 發(fā)明人根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)GRMZM2G456997基因序列設(shè)計(jì)引物（引物1， 5 ' -ATGGAGTACTCGTCTACTAGGG-3 '其序列如序列表 SEQ ID NO. 4 所示，引物 2， 5 ' -CTAGTAGGGTCTCTGTCCGC-3 '其序列如序列表SEQ ID NO. 5所示）用來(lái)獲得 GRMZM2G456997基因。提取玉米B73 RNA并通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，以cDNA作為模板，進(jìn)行 PCR擴(kuò)增； 反應(yīng)程序如下：預(yù)變性94°C 5 min，變性94°C 40 s，退火54°C 40 s，延伸72°C 1.5 min，反應(yīng)35個(gè)循環(huán)，后延伸72°C 7 min; 結(jié)束后，用康為公司的DNA回收試劑盒回收并純化擴(kuò)增片段，然后將純化的DNA片段連 接至載體pGEM-T中（Promega公司），轉(zhuǎn)化E. coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽(yáng)性克隆提質(zhì)粒， 測(cè)序由華大基因完成，獲得長(zhǎng)度為504bp的GRMZM2G456997片段，具有序列表SEQ ID NO. 2 的DNA序列。
[0017] 實(shí)施例3 GRMZM2G456997基因的功能驗(yàn)證： 將上述純化的cDNA片段通過(guò)TA克隆連入超量表達(dá)載體pCXUN，熱激轉(zhuǎn)化E. coli DH5 α感受態(tài)細(xì)胞后對(duì)重組子進(jìn)行菌落PCR，瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，重組子中包含有與目的 片段大小相同的條帶。將鑒定好的重組子擴(kuò)大培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，質(zhì)粒測(cè)序后與原序列比 對(duì)，連入的片段為全長(zhǎng)cDNA并且沒(méi)有堿基突變和缺失，證明GRMZM2G456997超量表達(dá)載體 pCXUN: :GRMZM2G456997 構(gòu)建成功。
[0018] 采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法（Lin和Zhang，Optimising the tissue culture conditions for high efficiency transformation of indica rice，2005， Plant Cell R印.23 :540-547)將超量表達(dá)載體導(dǎo)入水稻品種中花11。獲得的遺傳轉(zhuǎn)化植株被命名 為pCXUN : :GRMZM2G456997。本發(fā)明共獲得獨(dú)立轉(zhuǎn)化植株14株，其中陽(yáng)性植株為8株。 分別對(duì)Tl代3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系pCXUN: :GRMZM2G456997-2、4、8的10個(gè)單株進(jìn)行玉米紋枯 病菌的接種鑒定。結(jié)果表明，接種紋枯病菌YWK196 7天后，超量表達(dá)GRMZM2G456997的 轉(zhuǎn)基因植株與野生型相比平均病斑縮短了 I. 32cm、l. 21cm和2. 36cm (表1，圖2)，說(shuō)明 GRMZM2G456997參與了水稻對(duì)紋枯病的抗性反應(yīng)。圖2中，超量表達(dá)Tl代遺傳轉(zhuǎn)化植株 (pCXUN : :GRMZM2G456997-2、4和8)接種紋枯病菌YWK196 7天后形成的病斑明顯比水稻 品種中花11 (對(duì)照）的短；中花11為遺傳轉(zhuǎn)化受體材料。
[0019] 表I GRMZM2G456997超量表達(dá)植株接種YWK196 7天后的病斑長(zhǎng)度
【權(quán)利要求】
1. 一種玉米紋枯病抗病相關(guān)基因仰其基因序列如SEQ ID NO. 1所示。
2. -種蛋白質(zhì)，是由序列表中SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
3. -種編碼權(quán)利要求2所述蛋白質(zhì)的基因，基因序列如SEQ ID NO. 2所示。
4. 一種重組表達(dá)載體，其特征在于，該載體包含有權(quán)利要求3中的基因。
5. 權(quán)利要求3所述的蛋白質(zhì)或者權(quán)利要求4所述基因在培育抗紋枯病玉米中的應(yīng)用。
6. 權(quán)利要求1所述的因或權(quán)利要求3所述的編碼區(qū)的基因在增加玉 米對(duì)紋枯病抗性中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/82GK104498507SQ201410819547
【公開(kāi)日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年12月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月25日
【發(fā)明者】?jī)?chǔ)昭輝, 丁新華 申請(qǐng)人:安徽拜森生物科技有限公司