重組乙酰輔酶a合成酶的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種重組乙酰輔酶A合成酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；本發(fā)明重組乙酰輔酶A合成酶具有高熱穩(wěn)定性、高活性的特性，60℃處理30min后，酶活保留率為59.6%，較原有酶獲得大幅度的提高；催化油酸乙酰化反應(yīng)的表觀Km值為1.2*10 -5 M；可以提高酶在試劑盒中的熱穩(wěn)定性，有利于避免或減少試劑盒的運(yùn)輸和使用過程的溫度影響。
【專利說明】重組乙酰輔酶A合成酶
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種重組乙酰輔酶A合成酶及其在試劑盒中 的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 游離脂肪酸（NEFA)是指血脂中清蛋白攜帶轉(zhuǎn)運(yùn)的非酯化脂肪酸，正常人血漿中 的NEFA含量極少，為50?1200 μmol/L，僅占血漿中總脂肪酸的5%?10%，波動范圍大。 游離脂肪酸不僅參與機(jī)體的構(gòu)成、能量代謝，還參與機(jī)體眾多生理功能的調(diào)整，比如許多生 理調(diào)節(jié)物質(zhì)的合成。
[0003] NEFA的異常在眾多疾病檢測中均具有重要的診斷價值，其升高常用于糖尿病、肢 端肥大癥、甲狀腺功能亢進(jìn)癥、肝炎等方面的診斷，其降低常用于甲狀腺功能減低癥，降糖 藥或胰島素使用過量等方面的檢測診斷。
[0004] 目前，臨床上檢測NEFA的主要方法有氣相色譜法和酶法，其中酶法檢測由于操作 簡單、快速，特別是可以適應(yīng)于全自動生化儀的批量分析，所以得到的廣泛的應(yīng)用。
[0005] 酶法檢測NEFA的反應(yīng)原理為：待檢測的NEFA在乙酰輔酶A合成酶（Acyl-CoA Synthetase、ACS)的作用下，與試劑盒中輔酶A生成乙酰輔酶A(Acyl-CoA)，乙酰輔酶A在 ?；o酶A氧化酶（Acyl-CoA 0xidase、AC0)的作用下被氧氣氧化，反應(yīng)生成產(chǎn)物過氧化 氫（H2O2)，后者利用Trinder反應(yīng)即過氧化物酶（Peroxidase, P0D)，顯色劑4-氨基安替比 林（4-AAP)存在下和色原物質(zhì)生成有色的醌亞胺化合物，通過在可見光下的吸收峰變化測 定NEFA的含量。
[0006] 具體反應(yīng)步驟分為以下三個部分：
【權(quán)利要求】
1. 一種重組乙酰輔酶A合成酶，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示。
2. -種編碼權(quán)利要求1所述的重組乙酰輔酶A合成酶的基因，其特征在于：其核苷酸 序列如SEQ ID No. 1所示。
3. -種按權(quán)利要求1所述的重組乙酰輔酶A合成酶在NEFA酶法檢測試劑盒中的應(yīng)用； 所述NEFA試劑盒由R1和R2兩部分組成；R1組成為：1?500mM Tris-HCl緩沖液或MOPS 緩沖液、〇? 01 ?ImM C〇A、0. 01 ?5mM ATP、0. 001 ?2mM MgCl2、0. 001 ?2% Triton X-100、 0? 5mM?lOmM T00S、0. 05?lOOU/mL重組乙酰輔酶A合成酶，pH7. 2?8. 2 ;R2組成為： 1 ?800mM Tris-HCl 緩沖液或 MOPS 緩沖液、0? 2 ?5mM 4-AAP、0. 01 ?5mM NEM、1 ?200U/ mL P0D、0. 1 ?100U/mL ACO, pH7.2 ?9.2。
【文檔編號】C12Q1/25GK104480077SQ201410804903
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月22日
【發(fā)明者】鄒炳德, 鄒繼華, 章玉勝, 賈江花 申請人:寧波美康生物科技股份有限公司