一種絲瓜內參基因及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種絲瓜內參基因，并揭露了利用該絲瓜內參基因為基礎設計的實時熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測中沒有內參基因的現(xiàn)狀；而且所設計的實時熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達分析時，能夠提高絲瓜基因表達分析研究的穩(wěn)定性、可靠性和重復性；此外，所設計的實時熒光定量PCR引物特異性強，從而能夠大大的提高了采用實時熒光定量檢測絲瓜時的檢測效率，并提高了檢測結果的可信度。
【專利說明】一種絲瓜內參基因及其應用 【【技術領域】】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學【技術領域】，具體涉及一種絲瓜內參基因及其應用，具體地， 利用該絲瓜內參基因的核苷酸序列為基礎設計一對熒光定量特異引物。 【【背景技術】】
[0002] 絲瓜（Luffa cylindrical)原產東印度，主要分布于熱帶、亞熱帶的亞洲各地，在 我國南北均有栽培，是我國主要的瓜類蔬菜。隨著其分子生物學研宄的不斷深入和發(fā)展，基 因表達分析正逐漸應用于揭示絲瓜基因調控機理的研宄中。為了避免不同樣本在RNA的產 量、質量、逆轉錄效率以及擴增效率上可能存在的差別，通常利用內參基因進行數(shù)據(jù)校正和 標準化，以減少樣本之間的誤差，因此選擇合適的內參基因對數(shù)據(jù)進行校正是得到可信數(shù) 據(jù)的關鍵。而18S核糖體脫氧核糖核酸（18S rRNA)存在于所有的真核生物細胞中，幾乎在 所有組織中都高水平表達，在同種細胞或者組織中的蛋白質表達量一般是恒定的，且其作 為內參基因在分析植物基因表達以及檢測植物體內的病原物研宄中應用廣泛。
[0003] 但目前關于絲瓜18S rRNA基因的克隆和作為關于絲瓜內參基因的研宄還未見報 道。而缺乏內參基因，則難以實現(xiàn)基因表達的校正和標準化，大大阻礙絲瓜各種基因的表達 特性及功能分析研宄。
[0004] 此外，雖然實時熒光定量PCR技術已被廣泛應用于多個物種基因表達的絕對定量 和相對定量研宄中，但是因絲瓜內參基因的缺乏，目前尚未發(fā)現(xiàn)實時熒光定量PCR技術應 用于絲瓜基因表達的絕對定量和相對定量研宄中的相關報道。 【
【發(fā)明內容】
】
[0005] 本發(fā)明所要解決的技術問題在于提供一種絲瓜內參基因，并揭露了利用該絲瓜內 參基因為基礎設計的實時熒光定量PCR引物。
[0006] 本發(fā)明是通過以下技術方案解決上述技術問題的：一種絲瓜內參基因，所述內參 基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示；且該內參基因是以絲瓜DNA為模板、并以如下引物 對進行PCR擴增反應所得的；
[0007] 其中引物對為：
[0008] 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，
[0009] 反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0010] 進一步地，以權利要求1中所述內參基因的核苷酸序列為基礎，利用Primer Premier5. 0軟件、并遵循實時熒光定量PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引 物，該對熒光定量特異引物即為所述實時熒光定量PCR引物；
[0011] 且該實時熒光定量PCR引物為：
[0012] 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，
[0013] 反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0014] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0015] 本發(fā)明提供了一種絲瓜內參基因，同時揭露了利用該絲瓜內參基因為基礎設計的 實時熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測中沒有內參基因的現(xiàn)狀；而且所 設計的實時熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達分析時，能夠提高絲瓜基因表達分析研宄 的穩(wěn)定性、可靠性和重復性；此外，所設計的實時熒光定量PCR引物特異性強，從而能夠大 大的提高了采用實時熒光定量檢測絲瓜時的檢測效率，并提高了檢測結果的可信度。 【【專利附圖】
【附圖說明】】
[0016] 下面參照附圖結合實施例對本發(fā)明作進一步的描述。
[0017] 圖1是本發(fā)明中實施例1的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0018] 圖2是本發(fā)明中實施例2的1 %瓊脂糖凝膠電泳圖。
[0019] 圖3是本發(fā)明中實施例3的PCR擴增曲線圖。
[0020] 圖4是本發(fā)明中實施例3的溶解曲線圖。
[0021] 圖5是本發(fā)明中實施例4的1%的瓊脂糖凝膠電泳圖。 【【具體實施方式】】
[0022] 本發(fā)明列舉了以下幾個代表性實施例，這些實施例僅是示例性的，且不用于 限制本發(fā)明的范圍，這些實施例僅用于對本發(fā)明進行說明。且各實施例中所采用的儀 器與試劑如下：美國ABI7500實時定量PCR儀，美國ABI Veriti96-well熱循環(huán)儀，美 國 ABI Power SYBR? Green PCR Master Mix, pMD18-T-vector、cDNA 第一鏈合成試 劑盒（PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、Marker DL 2000、Taq DNA PolymerashdNTP均為寶生物工程（大連）有限公司產品，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒 為Omega公司產品，引物合成和克隆測序由鉑尚生物技術（上海）有限公司完成，其余生化 試劑均為國產分析純。
[0023] 實施例1內參基因的獲得
[0024] 步驟（1)、根據(jù)Genbank公布的西瓜、甜瓜及西萌蘆的18S rRNA基因設計一對 引物，并利用Clustalx軟件對所設計的該引物對進行序列比對，且由鉑尚生物技術（上 海）有限公司合成該對引物，具體地，該對引物（如SEQ ID NO :1、2所示）：正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'，反向引物 5' -AGGATTCAATCCAGCCACAGGTT-3'。
[0025] 步驟（2)、DNA提?。翰捎酶牧糃TAB法進行絲瓜基因組DNA的提取，具體地：稱取絲 瓜嫩葉0. 5g于研缽中，加入液氮和0. Ig的PVPP快速充分研磨至粉末狀，將粉末移至I. 5mL 離心管中；每管加入600 μ L預熱至65°C的2% CTAB提取緩沖液，同時加入7ul β -琉基乙 醇，充分混勾，65°C水浴60min，且每隔15min顛倒一次；取出離心管，冷卻至室溫，接著加入 等體積的氯仿/異戊醇，且氯仿/異戊醇中氯仿、異戊醇二者的體積比為24:1，輕緩顛倒混 勻，靜置l〇min，后于4°C下12000rpm離心IOmin ;取上清液至另一離心管，并加入等體積的 氯仿/異戊醇（氯仿/異戊醇中氯仿、異戊醇二者的體積比為24:1)進行再次抽提，同樣于 4°C下12000rpm離心IOmin ;取上清液至另一離心管，并加入0. 6倍體積異丙醇，輕緩顛倒 混勾，后于4°C冰箱靜置30min-60min，之后在4°C條件下12000rpm離心IOmin ;用體積分數(shù) 70 %乙醇洗滌DNA沉淀2-3次，然后置于超凈工作臺上風干；風干后將所得DNA溶于100 μ L TE溶液中，并加入終濃度為IOmg. mL-1的RNase A 2. 5uL，接著于37°C水浴鍋中保溫30min， 之后用I %的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測DNA質量；最后將DNA稀釋至50ng. L-1，并于-20°c 冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>
[0026] 步驟⑶、PCR擴增：以經步驟⑶處理所得的DNA為模板，并以步驟⑴中獲得的 引物為引物對進行PCR擴增反應，得到PCR擴增產物。
[0027] PCR反應體系：反應體系的總體積為25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水。
[0028] ?0?反應程序為：94°0預變性31^11;94°0變性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 個循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0029] 步驟（5)、取步驟⑷所得PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，得到如圖1 所示大小的片段，回收該片段并進行純化后連接到PMD18-T載體上轉化，挑取陽性克隆子， PCR檢測后送至測序，所測得的序列即為內參基因的核苷酸序列，其如SEQ ID NO :3所示。
[0030] 實施例2實時熒光定量PCR設計和常規(guī)PCR檢測
[0031] 以實施例1獲得的內參基因的核苷酸序列為基礎，利用Primer Premier5. 0軟件， 并遵循實時熒光定量PCR引物設計的原則設計出一對熒光定量特異引物，其擴增片段為 271bp，該對熒光定量特異引物即為所述實時熒光定量PCR引物（如SEQ ID NO :4、5所示）： 正向引物 5' -GTGTTCTTCGGAATGACTGG-3'，反向引物 5' -ATCGTTTACGGCATGGACTA-3'。
[0032] 提取絲瓜總 RNA，并按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試劑盒 的方法合成cDNA第一鏈，即將RNA反轉錄為cDNA ;之后以所得cDNA為模板、以實時熒光定 量PCR引物為引物對進行PCR擴增，且PCR擴增的反應體系與反應程序如下：
[0033] PCR反應體系：反應體系的總體積為25yL，含25ng模板、0.4ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水；
[0034] ?0?反應程序為：94°0預變性31^11;94°0變性3〇8,56°0退火3〇8,72°0延伸9〇8,35 個循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0035] 將PCR擴增產物進行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖2所示；由圖2可知， PCR擴增得到一條單一條帶，沒有出現(xiàn)非特異性擴增條帶（圖2)，經測序大小為271bp，符合 預期大?。粍t可繼續(xù)下游的實時熒光定量PCR引物驗證。
[0036] 實施例3
[0037] 提取絲瓜總 RNA，并按照 PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit 試 劑盒的方法合成cDNA第一鏈，即將RNA反轉錄為cDNA ;之后以所得cDNA為模板、按照 Power SYBR1? Green PCR Master Mix 說明書在 ABI7500 實時定量 PCR 儀上進行 PCR 反 應，PCR反應的反應體系與反應程序如下：
[0038] 反應體系為：反應體系的總體積為25 yL，12. 5 yL Power SYBR? Green PCR Master Mix，IyL模板，實施例2中實時熒光定量PCR引物的正向引物0.5 yL(濃度為 10 μ mol/L)，實施例2中實時熒光定量PCR引物的反向引物0· 5 μ L (濃度為10 μ mol/L)，補 蒸餾水至總體積25 μ L。
[0039] 反應程序為：95°C預變性IOmin ;95°C變性15s，60°C退火lmin，共40個循環(huán)；4°C 保存；每個反應做3個重復。
[0040] 反應的結果如圖3(其中，ARn指熒光強度、cycle指循環(huán)數(shù)）所示，從圖3可以看 出，3次重復的熒光定量PCR擴增曲線均很好。且為檢驗反應的特異性， 申請人:在PCR后進 行融解曲線分析，分析結果如圖4所示，從圖4可顯示出，3次重復的Tm(溶解溫度）分別為 86. 25°C、86. 06°C、86. 25°C，且均只有一個特異峰，表明無引物二聚體，擴增條帶單一，特異 性強，沒有非特異性擴增出現(xiàn)，從而表明所設計的一對引物特異性強（即實施例2中的實時 熒光定量PCR引物），擴增效率高，特異性強，能夠用于絲瓜熒光定量PCR的內參引物實驗。
[0041] 實驗例4絲瓜18S rRNA基因表達穩(wěn)定性分析
[0042] 分別提取絲瓜根、莖、葉、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后 30天）、高溫處理（38°C )葉片、低溫處理（8°C )葉片、強光處理（2000umol ·πΓ2 葉片、 及弱光處理（200umol · πΓ2 · S4)葉片的總RNA，之后分別按照PrimeScriptTM 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒的方法合成cDNA第一鏈，以獲得各自的cDNA ;利用實施2中的 實時熒光定量特異引物為引物對，以獲得的10種的cDNA為模板，分別進行PCR擴增，PCR擴 增體系與擴增程序如下：
[0043] PCR擴增體系：反應體系的總體積為25 yL，25ng模板、0. 4 ymol/L正向引物、 0.4以111〇1/1反向引物、0.15臟〇1/1(1階1\川了&9〇嫩聚合酶、1.5臟〇1/1]\%(：1 2的10\?0? 緩沖液2. 5 μ L、其余成分為滅菌的超純水。
[0044] PCR 擴增程序為：94°C預變性 3min ;94°C變性 30s，58°C退火 30s，72°C延伸 30s，28 個循環(huán)；最后72°C下延伸7min ;于4°C下保存。
[0045] 將PCR擴增產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，檢測結果如圖5所示，且圖5中標 識1至10分別為絲瓜根、莖、葉、幼瓜（花后5天）、商品瓜（花后12天）、成熟瓜（花后30 天）、高溫處理（38°C )葉片、低溫處理（8°C )葉片、強光處理（2000umol ·πΓ2 · ?Γ1)葉片、 及弱光處理（200umol · m_2 · s_〇葉片的PCR擴增反應結果；由圖5顯示，采用實施2中的 實時熒光定量特異引物為引物對時，擴增所得的10個條帶亮度基本一致，從而表明在絲瓜 不同組織、各生長發(fā)育階段、及各種非生物脅迫條件下均能穩(wěn)定表達，即說明了實時熒光定 量特異引物在絲瓜基因表達中的穩(wěn)定性，從而適用于絲瓜基因表達的研宄。
[0046] 綜上，本發(fā)明提供了一種絲瓜內參基因，并揭露了利用該絲瓜內參基因為基礎設 計的實時熒光定量PCR引物，不僅解決了現(xiàn)有絲瓜定量PCR檢測中沒有內參基因的現(xiàn)狀；而 且所設計的實時熒光定量PCR引物用于絲瓜基因表達分析時，能夠提高絲瓜基因表達分析 研宄的穩(wěn)定性、可靠性和重復性；此外，所設計的實時熒光定量PCR引物特異性強，從而能 夠大大的提高了采用實時熒光定量檢測絲瓜時的檢測效率，并提高了檢測結果的可信度。
【權利要求】
1. 一種絲瓜內參基因，其特征在于：所述內參基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :3所示； 且該內參基因是以絲瓜DNA為模板、并以如下引物對進行PCR擴增反應所得的； 其中引物對為： 正向引物 5' -CCAATCATACTCAAAAGAAGAGTT-3'， 反向引物 5' -AGGAITCAATCCAGCCACAGGIT-3'。
2. -種實時熒光定量PCR引物，其特征在于：以權利要求1中所述內參基因的核苷酸 序列為基礎，利用Primer Premier5. 0軟件、并遵循實時熒光定量PCR引物設計的原則設計 出一對熒光定量特異引物，該對熒光定量特異引物即為所述實時熒光定量PCR引物； 且該實時熒光定量PCR引物為： 正向引物 5' -GTGITCTTCGGAATGACTGG-3'， 反向引物 5' -ATCGITTACGGCATGGACTA-3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104480202SQ201410725658
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月3日 優(yōu)先權日:2014年12月3日
【發(fā)明者】朱海生, 溫慶放, 陳敏氡 申請人:福建省農業(yè)科學院作物研究所