一株蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一株蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)及其應(yīng)用，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年12月10日，保藏登記編號(hào)為：CGMCC No.6967。所述蠟狀芽胞桿菌(Bacillus cereus)在生產(chǎn)普魯蘭酶中的應(yīng)用。CGMCC No696720121210
【專利說明】一株蠟狀芽孢桿菌及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體涉及一種產(chǎn)普魯蘭酶的蠟狀芽孢桿菌和利用該菌株 生產(chǎn)普魯蘭酶的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 普魯蘭酶（Pullulanase，EC. 3. 2. 1. 41)與其他淀粉酶只能水解α -1，4-糖苷鍵 不同，是一種能夠?qū)Ｒ恍郧虚_支鏈淀粉分支點(diǎn)中的α-1，6糖苷鍵，從而剪下整個(gè)側(cè)枝，形 成直鏈淀粉的脫支酶。它可以將最小單位的支鏈分解，最大限度的利用淀粉原料，因此在淀 粉加工工業(yè)中有著重要的用途。同時(shí)隨著普魯蘭酶在淀粉加工行業(yè)中的研究日益廣泛和深 入，它可與α-淀粉酶，β-淀粉酶等糖化酶合用，提高葡萄糖漿，超高麥芽糖漿的產(chǎn)量。在 啤酒生產(chǎn)過程中，加入普魯蘭酶也可以提高糖利用率，縮短糖化的時(shí)間。當(dāng)前普魯蘭酶是應(yīng) 用于高葡萄糖漿、高麥芽糖漿和干啤酒生產(chǎn)以及醫(yī)藥等工業(yè)生產(chǎn)中重要的酶制劑。
[0003] 普魯蘭酶的工業(yè)化生產(chǎn)菌株極少，到目前為止僅有丹麥Novo公司的嗜酸普魯蘭 芽胞桿菌（Bacillus acidopullulyticus)的工業(yè)化生產(chǎn)工藝有報(bào)道，該菌株生產(chǎn)的商品名 為Pormoyzme的酶制劑是目前國(guó)際上唯一商品化的普魯蘭酶，并且市場(chǎng)份額約占中國(guó)乃至 世界95%以上。由于我國(guó)淀粉資源豐富，加之普魯蘭酶在食品工業(yè)、發(fā)酵、洗滌和紡織等行 業(yè)有重要的應(yīng)用，而目前我國(guó)淀粉工業(yè)中使用的普魯蘭酶大多都是從國(guó)外進(jìn)口，成本較高， 大大限制了普魯蘭酶的應(yīng)用。
[0004] 目前，國(guó)內(nèi)普魯蘭酶的研究主要從三個(gè)方面進(jìn)行：一是產(chǎn)普魯蘭酶菌種的分離、篩 選及結(jié)合物理、化學(xué)因素的誘變；二是產(chǎn)堿性普魯蘭酶的研究，由于堿性普魯蘭酶可作為衣 物洗滌劑和去污劑的有效添加成分應(yīng)用于洗滌劑工業(yè)中，它拓寬了普魯蘭酶在工業(yè)生產(chǎn)中 的應(yīng)用范圍；三是耐熱型耐酸型普魯蘭酶基因的克隆、測(cè)序和表達(dá)。主要是在大腸桿菌或芽 孢桿菌中進(jìn)行表達(dá)相關(guān)普魯蘭酶基因的表達(dá)研究。近年來，科技工作者開始從不同的來源 的基質(zhì)中分離篩選各種耐酸耐熱的類型的產(chǎn)極端耐熱普魯蘭酶菌株，如嗜熱脂肪芽孢桿菌 (Bacillus stearothermophilus)，厭氧古菌（Thermococcus siculi)等。這些耐熱耐酸菌 屬所產(chǎn)的普魯蘭酶大多數(shù)都是胞內(nèi)酶，而且該菌屬的發(fā)酵工藝非常困難，酸熱穩(wěn)定性方面 都有一些欠缺，不適應(yīng)現(xiàn)行酶法水解淀粉（PH4. 0-4. 5,65°C )的生產(chǎn)條件，并且這些菌株的 普魯蘭酶的活力還未得到很大提高。我國(guó)普魯蘭酶的研究至今仍限于實(shí)驗(yàn)室研究階段，未 見工業(yè)化應(yīng)用的報(bào)道，工業(yè)上添加的普魯蘭酶均是依賴進(jìn)口，所以研究和開發(fā)出具有自主 知識(shí)產(chǎn)權(quán)的普魯蘭酶產(chǎn)品具有重要的意義和良好的市場(chǎng)前景。
[0005] 雖然已有蠟狀芽孢桿菌普魯蘭酶基因?qū)＠膱?bào)道（中國(guó)專利申請(qǐng)201210008693. X)，其公開了一種蠟樣芽胞桿菌普魯蘭酶基因及其應(yīng)用，其分泌的普魯蘭酶最適反應(yīng)PH在 6. 0?7. 5,最適反應(yīng)溫度為50°C。但是相比本發(fā)明得到的菌株JS194與其記載的Bacillus cereus GXBC-I菌株除分類地位相距較遠(yuǎn)外，經(jīng)檢測(cè)普魯蘭酶活性也有差異，本發(fā)明菌株 JS194粗酶的最適溫度為55°C，最適pH為7. 5 ;在pH6. 5?7. 5、溫度50?65°C之間較為 穩(wěn)定。考慮到微生物的多樣性以及酶學(xué)差異與其應(yīng)用領(lǐng)域亦有不同且目前沒有應(yīng)用于工業(yè) 生產(chǎn)的報(bào)道，該菌株具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種蠟狀芽孢桿菌和利用該菌株生產(chǎn)普魯蘭酶的應(yīng) 用。
[0007] 技術(shù)方案：一株錯(cuò)狀芽胞桿菌（Bacillus cereus)，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種 保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期 為2012年12月10日，保藏登記編號(hào)為：CGMCC No. 6967。
[0008] 該菌株的16SrRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0009] 所述錯(cuò)狀芽胞桿菌（Bacillus cereus)在生產(chǎn)普魯蘭酶中的應(yīng)用。
[0010] 發(fā)酵條件為：溫度20?30°C，pH 6.0?8,時(shí)間為24?48h，溶氧：搖瓶轉(zhuǎn)速180? 250rpm，碳源選自：糯米淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、木薯淀粉或可溶性淀粉，初始濃度為 10 ?30g/L。
[0011] 所述發(fā)酵條件優(yōu)選為：溫度為30°C、初始pH7. 0、時(shí)間為48h。
[0012] 本發(fā)明蠟狀芽孢桿菌（JS194)CGMCC No. 6967在LB瓊脂平板上劃線，30°C培養(yǎng)24h 后觀察菌落直徑5-7_，呈圓形或近似圓形、邊緣擴(kuò)展、質(zhì)地軟、無色素、稍有光澤的白色菌 落如圖1所示。
[0013] 本發(fā)明的菌株JS194革蘭氏染色為陽(yáng)性，形成芽孢（見圖2)。
[0014] 本發(fā)明蠟狀芽孢桿菌JS194的生理生化特征見下表1 :
[0015] 表I TS194菌株的牛理?；丶?br>
[0016]
【權(quán)利要求】
1. 一株錯(cuò)狀芽胞桿菌（Bacillus cereus)，該菌株保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委 員會(huì)普通微生物中心，保藏地址是北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，保藏日期為2012年 12月10日，保藏登記編號(hào)為：CGMCC No. 6967。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1中所述的蠟狀芽孢桿菌，其特征在于該菌株的16SrRNA的核苷酸序 列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 權(quán)利要求1所述錯(cuò)狀芽胞桿菌（Bacillus cereus)在生產(chǎn)普魯蘭酶中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于發(fā)酵條件為：溫度20?30°C，pH 6. 0?8， 時(shí)間為24?48h，溶氧：搖瓶轉(zhuǎn)速180?250rpm，碳源選自：糯米淀粉、玉米淀粉、土豆淀粉、 木薯淀粉或可溶性淀粉，初始濃度為10?30g/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述發(fā)酵條件為：溫度為30°C、初始 pH7. 0、時(shí)間為 48h。
【文檔編號(hào)】C12R1/085GK104388357SQ201410714161
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年11月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月28日
【發(fā)明者】曹喜濤, 張建平, 張國(guó)政, 季更生, 陳欣, 沈興家 申請(qǐng)人:江蘇科技大學(xué)