一種可用于藍白篩選的多功能的ta克隆載體系統(tǒng)及其用途
【專利摘要】本發(fā)明通過調(diào)整編碼框架的方法，構建一種多功能的TA克隆載體系統(tǒng)。與常規(guī)商品化TA載體相比，本發(fā)明TA克隆時的假陽性和假陰性率降低；載體自連現(xiàn)象明顯改善。本發(fā)明更具有創(chuàng)造性的用途是，可提供插入序列后菌落由藍變白和由白變藍兩種選擇，其中由白變藍的選擇能達到假陽性和假陰性均低于1％。其次，本載體可用于腫瘤相關基因移碼突變的微小病變檢測，這是目前市場具有這一功能的獨家產(chǎn)品；且本載體能用于反因子蛋白酶TALENs有效性的檢測。
【專利說明】-種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統(tǒng)及其用 途
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，涉及醫(yī)學診斷和生物技術。通過調(diào)整編碼框架的方 法，構建三種TA克隆載體。與常規(guī)商品化TA載體相比，除保留了由藍變白的篩選之外，增 加了由白變藍的新選擇，可用于微小突變的檢測和反因子核酸酶活性的檢測。
【背景技術】
[0002] 目前，分子生物學實驗中大多數(shù)克隆載體都是經(jīng)人工構建的，基本上都帶有可供 選擇的遺傳標志或表型特征。藍白斑篩選（β_半乳糖苷酶系統(tǒng)）是較常用的篩選標記。
[0003] 此類載體攜帶lacZ'基因，它編碼β_半乳糖苷酶的N-末端（α-肽），并且處于 誘導物IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷，與乳糖結構類似但不能被β-半乳糖苷酶降 解）誘導的啟動子調(diào)控之下。質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的宿主菌為LacZΛΜ15基因型（含有編碼N-末端 缺陷型的β-半乳糖苷酶多肽的基因）。未重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌后，在IPTG的誘導下，質(zhì) 粒與宿主菌分別表達缺陷但可以相互補償?shù)膬蓚€肽（即α-互補），形成了有功能的β-半 乳糖苷酶，該酶能把培養(yǎng)基中無色的X-gal(5-溴-4-氯-3-H引哚-β-D-半乳糖苷）底物 分解成半乳糖和深藍色的5-溴-4-氯-靛藍，菌落呈現(xiàn)藍色。但當外源DNA插入質(zhì)粒位于 α-肽編碼序列中的多克隆位點時，由于破壞了α-肽的閱讀框架，使其編碼的α-肽失去 活性，則重組子所在的細菌不能完成α互補，不能形成有活性的β-半乳糖苷酶，致使重組 菌形成白色菌落。因此，可以借助藍白斑篩選出重組子.
[0004] 盡管藍白斑篩選應用了三十余年，但假陽性和假陰性率仍然很高。SlilatySN和 LebelS. [1]研究證明，藍白斑篩選的載體，通常將插入位點放在LacZ基因的起始密碼子 ATG到第7個氨基酸密碼子之間。但如果將插入位置改變到LacZ基因的第11-36個氨基酸 密碼子之間，那么就可以完全消除假陽性和假陰性。GenomicsOne公司正是利用了他們的 研究結果開發(fā)出TrueBlue技術，同樣是藍白斑篩選，但準確率可達100%。不過實際操作中 仍出現(xiàn)一定程度的假陽性和假陰性。
[0005] 為了解決現(xiàn)有技術中存在的上述缺陷，本發(fā)明由此而來。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種高效率和多功能的TA克隆載體體系。該載 體體系的優(yōu)點是既能采用由藍變白的選擇方式，又能采用由白變藍的選擇方式，降低了假 陽性和假陰性的發(fā)生，除能用于克隆PCR產(chǎn)物外，還能用于微小病變的檢測，能用于反因子 核酸酶活性的檢測等。
[0007] 為解決上述技術問題，本發(fā)明的技術方案為，一種可用于藍白篩選的多功能的TA 克隆載體系統(tǒng)，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質(zhì)粒組成；其中，pMD19-JZ3 的基因序列為SeqNo. 3，pMD19_JZ2的基因序列為SeqNo. 2,其中堿基N選自A，T，C，G; PMD19-JZ1的基因序列為SeqNo. 1，其中堿基N選自A, T，C，G。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)選技術方案中，質(zhì)粒體pMD19-JZ3為本身閱讀框未發(fā)生移碼的載體； 質(zhì)粒體pMD19-JZ2為本身閱讀框因增加了二對堿基發(fā)生移碼的載體；質(zhì)粒體pMD19-JZ1 為本身閱讀框因增加了一對堿基發(fā)生移碼的載體。
[0009] 本發(fā)明的優(yōu)選技術方案中，PMD19-JZ2的基因序列為SeqNo. 2,第433位堿基N為 g,第434位堿基N為t;pMD19-JZl的基因序列為SeqNo. 1，第433位堿基N為t。
[0010] 本發(fā)明的第二方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體 系用于亞克隆，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三個質(zhì)粒 體組成；其中，PMD19-JZ3的基因序列為SeqNo. 3,pMD19-JZ2的基因序列為SeqNo. 2， PMD19-JZ1的基因序列為SeqNo. 1。
[0011] 本發(fā)明的第三方面的所要解決的技術問題是提供一種多功能的TA克隆載體體 系用于用于微小病變的基因檢測，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和PMD19-JZ1三個質(zhì)粒體組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為SeqNo. 3,pMD19-JZ2的基因 序列為SeqNo. 2,pMD19_JZl的基因序列為SeqNo. 1。
[0012] 在大量實驗的基礎上，我們發(fā)現(xiàn)一個現(xiàn)象：應用TrueBlue技術的藍白斑篩選載 體，插入片段小于IOObp時，若插入片段是3的整數(shù)倍則菌落呈藍色；若是3的非整數(shù)倍則 菌落呈白色。在分子生物學實驗中，常需要將擴增的PCR產(chǎn)物進行克隆。Taq酶是最早發(fā)現(xiàn) 的可用來進行PCR反應的DNA聚合酶，該酶的一個重要特點是在產(chǎn)物的3'末端以不依賴 于模板的方式摻入A堿基，導致PCR產(chǎn)物不能以平末端的方式克隆，而需要用特殊的載體 即T載體進行克隆。T載體作為一種克隆PCR產(chǎn)物的有效工具，因其3'末端帶有突出的T 堿基，可直接與PCR擴增產(chǎn)物3'末端突出的A堿基配對，因此大大提高了PCR產(chǎn)物與載 體的連接效率。
[0013] 由于現(xiàn)有T載體僅僅采用由藍變白這樣一種選擇，而實際結果是有些藍色菌落 含有插入序列，另一些白色菌落為空載體。本產(chǎn)品發(fā)明以常用的PMD19-Tvector為基礎 改建，構建了含有3種載體的TA克隆載體體系--分別命名為pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和 PMD19-JZ1，與常規(guī)的TA克隆載體相比，本發(fā)明TA克隆時的假陽性和假陰性率降低；載體 自連現(xiàn)象明顯改善。
[0014] 本發(fā)明的技術方案是：
[0015] 本產(chǎn)品由pMD19-JZ3,pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三個質(zhì)粒體組成TA克隆載體系 統(tǒng)；其中的質(zhì)粒體PMD19-JZ3為本身閱讀框未發(fā)生移碼的載體；質(zhì)粒體pMD19-JZ2為本身 閱讀框因增加了二對堿基發(fā)生移碼的載體；質(zhì)粒體PMD19-JZ1為本身閱讀框因增加了一對 堿基發(fā)生移碼的載體。（序列見表1)
[0016] 上述三種載體的共同特征是均為雙鏈線性DNA，且具有三末端一個胸腺嘧啶堿基 突出（見表1)。這種含有三末端突出T的載體分子，用于亞克隆時，能與低保真DNA聚合酶 的PCR產(chǎn)物中含有三末端突出腺嘌呤的片段形成互補的粘性接頭，在DNA連接酶作用下，克 隆效率高于平末端。由于本產(chǎn)品所含三個質(zhì)粒體的共性，因此均能用于亞克隆（見應用例 1，2, 3)。通過使用Pfu作為對照，應用例1，2, 3還同時表明，本產(chǎn)品體系對于高保真DNA聚 合酶產(chǎn)生的平末端產(chǎn)物克隆效率極低。（圖1，AtagBpfu)
[0017] 表 1
[0018]
【權利要求】
1. 一種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統(tǒng)，其由pMD19-JZ3，pMD19-JZ2,和 PMD19-JZ1三種質(zhì)粒組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為Seq No. 3, pMD19-JZ2的基因序 列為 Seq No. 2, pMD19_JZl 的基因序列為 Seq No. 1。
2. 根據(jù)權利要求1所述的多功能的TA克隆載體體系，其特征在于，質(zhì)粒體pMD19-JZ3 為本身閱讀框未發(fā)生移碼的載體；質(zhì)粒體PMD19-JZ2為本身閱讀框因增加了二對堿基發(fā)生 移碼的載體；質(zhì)粒體PMD19-JZ1為本身閱讀框因增加了一對堿基發(fā)生移碼的載體。
3. 根據(jù)權利要求1或2所述的多功能的TA克隆載體體系，其特征在于，pMD19-JZ2的 基因序列為Seq No. 2,第433位堿基n為g，第434位堿基n為t ;pMD19-JZl的基因序列 為Seq No. 1，第433位堿基n為t。
4. 一種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統(tǒng)用于亞克隆，其中，TA克隆載體體 系由PMD19-JZ3, pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質(zhì)粒組成；其中，pMD19-JZ3的基因序列為 Seq No. 3, pMD19-JZ2 的基因序列為 Seq No. 2, pMD19-JZl 的基因序列為 Seq No. 1。
5. -種可用于藍白篩選的多功能的TA克隆載體系統(tǒng)及其用途用于微小病變的基因檢 測，其中，TA克隆載體體系由pMD19-JZ3, pMD19-JZ2,和pMD19-JZl三種質(zhì)粒組成；其中， PMD19-JZ3的基因序列為Seq No. 3，pMD19_JZ2的基因序列為Seq No. 2，pMD19_JZl的基因 序列為Seq No. 1。
【文檔編號】C12N15/66GK104357472SQ201410659108
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權日:2014年11月18日
【發(fā)明者】李凱, 潘韻芝 申請人:蘇州大學