糙草△6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了糙草△6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族及其重組表達(dá)載體和應(yīng)用，ApD6D基因家族包括ApD6D1和ApD6D2兩個(gè)成員，具有△6-脂肪酸脫飽和酶活性，能夠催化亞油酸形成γ-亞麻酸(GLA)，也能夠催化α-亞麻酸(ALA)形成十八碳四烯酸(SDA)，將ApD6D1和ApD6D2正義轉(zhuǎn)入糙草自身以后，轉(zhuǎn)基因糙草種子中GLA和SDA含量大幅提高；轉(zhuǎn)入甘藍(lán)型油菜以后，轉(zhuǎn)基因油菜種子中積累了非轉(zhuǎn)基因油菜種子所不具有的GLA和SDA；表明利用ApD6D基因家族能夠創(chuàng)造新資源材料，并用于工業(yè)生產(chǎn)GLA和SDA，或直接用于生產(chǎn)富含GLA和SDA的保健型食用油。
【專利說明】糙草A6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族及其重組表達(dá)載 體和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，具體涉及糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族， 還涉及ApD6D基因家族的重組表達(dá)載體和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 多不飽和脂肪酸（Polyunsaturated Fatty Acids, PUFA)是在碳原子之間 含有兩個(gè)以上雙鍵的不飽和脂肪酸，其代謝途徑是以亞油酸（Linoleic acid，LA; C18:3A9'12，n-6)為初始底物，在一系列脂肪酸脫飽和酶（脂肪酸脫氫酶）和脂肪酸 延伸酶的催化下，先后生成Y -亞麻酸（Y-linolenic acid, GLA ;C18:3 A6'9'12, n-6)、 〇-亞麻酸（<1-1：[1101611；[0&(^(1，六1^;018:3八 9'12'15，11-3)、十八碳四烯酸（8七6&1'1(1011；[0 已。1(1，30六，0(^3(16。3七61：四6110；[。3。1(1，（7^，018:4八6' 9'12'15，11-3)、雙高丫-亞麻酸（0111^)、 花生四烯酸（ARA)、二十碳五烯酸（EPA，n-3)、二十二碳五烯酸（DPA)、二十二碳六烯酸 (DHA，n-3)等長鏈多不飽和脂肪酸（LC-PUFAs)或超長鏈多不飽和脂肪酸（VLC-PUFAs)。
[0003] PUFA能促進(jìn)生長發(fā)育，調(diào)節(jié)人體的脂質(zhì)代謝，還能治療和預(yù)防心腦血管疾病，同 時(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗癌、延緩衰老等重要的生理功能，對人類健康起到非常重要的作用。 Q3(n-3)系列脂肪酸對人體具有重要生理功能，其中ALA是n-3PUFA(EPA、DHA)合成前體； EPA是一類重要的多聚不飽和脂肪酸化學(xué)信使物，在免疫和炎癥反應(yīng)上起至關(guān)重要的作用； DPA是生成DHA的中間產(chǎn)物，對冠心病具有潛在的抑制作用；DHA是視網(wǎng)膜正常發(fā)育和發(fā)揮 其正常功能所必需的，大腦和神經(jīng)組織中DHA含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于機(jī)體其他組織，對神經(jīng)功能發(fā) 揮著至關(guān)重要的作用。Q6(n-6)系列脂肪酸對人體也具有重要生理功能，其中GLA是組成 人體各組織生物膜的結(jié)構(gòu)材料，也是合成前列腺素的前體，GLA水平的不足可導(dǎo)致體內(nèi)機(jī)能 的紊亂，引起某些疾病，如糖尿病、高血脂等。
[0004] A 6-脂肪酸脫飽和酶（A 6fatty acid desaturase，D6D)是一種多功能酶，也是 PUFA生物合成途徑經(jīng)第一步限速酶，它能夠以LA為底物催化合成GLA，也能夠以ALA為底 物催化合成SDA，據(jù)報(bào)道在它哺乳動(dòng)物中還能夠催化以24C-PUFA為底物的生化反應(yīng)。
[0005] 理論上人體只需要通過食物等途徑攝入足夠的LA和ALA，就可以利用人體自身的 D6D等酶系統(tǒng)將它們分別合成為GLA和EPA、DHA，但殘酷的現(xiàn)實(shí)是人體D6D活性很低而且易 被多種環(huán)境因素（如膳食中的脂肪）所抑制。這就導(dǎo)致人體即使攝入了足夠的底物L(fēng)A和 ALA，但合成GLA、EPA、DHA的水平依然嚴(yán)重不足，因此需要直接攝入GLA、EPA、DHA等來補(bǔ)充 其不足。
[0006] GLA作為人體內(nèi)必需的不飽和脂肪酸，成年人每日需要量約為36mg/kg。傳統(tǒng)補(bǔ)充 人體EPA和DHA的主要途徑是深海魚油，魚油中的PUFA實(shí)際上是魚通過取食藻類物等而富 集在體內(nèi)的，該種方式受到魚類資源量的極大限制，來源極為有限，缺乏可持續(xù)性，且工藝 復(fù)雜，成本高，價(jià)格昂貴。最近的研究表明，人體能夠利用攝入的SDA迅速而有效地合成為 EPA，進(jìn)一步合成DHA，其效果雖然比直接攝入EPA和DHA略差，但遠(yuǎn)遠(yuǎn)比攝入ALA的效果好 得多，可以有效解決人體EPA和DHA不足的問題。因此，直接補(bǔ)充EPA和DHA的方式完全可 以由補(bǔ)充SDA的方式所取代。研究發(fā)現(xiàn)，不僅一些真菌和藻類物種中能夠合成SDA，而且少 數(shù)植物也能夠合成SDA，紫草科（Boraginaceae)特別是藍(lán)薊屬（Echium)植物、少數(shù)報(bào)春花 屬（Primula)植物的種子油脂中富含SDA，原因是它們的D6D酶能夠有效利用ALA生成SDA， 其它植物中SDA的情況以及D6D酶對ALA底物的利用效率問題則有待研究。
[0007] PUFA在市場上一直供不應(yīng)求，而且市場需要量還在不斷地增長。培養(yǎng)藻類和真菌 生產(chǎn)PUFA是一個(gè)重要的研究熱點(diǎn)，而且已經(jīng)取得重要成就，但仍然受到操作復(fù)雜、成本高、 價(jià)格貴的困擾。利用植物系統(tǒng)尤其是大宗油料作物的種子來生產(chǎn)PUFA，相比動(dòng)物、真菌、藻 類等生產(chǎn)途徑，具有容易上規(guī)模、種植簡單、成本相對較低、安全性好的優(yōu)點(diǎn)。雖然大宗油料 作物如油菜、大豆、花生、棉花、向日葵、棕櫚、橄欖中不存在GLA，所有高等植物都不具有合 成EPA和DHA的關(guān)鍵酶，而且通過植物代謝工程生產(chǎn)EPA和DHA在技術(shù)上極其困難，但如果 通過基因工程方式導(dǎo)入既能利用LA也能利用ALA為底物的外源D6D基因，則可以利用大宗 油料作物來生產(chǎn)GLA和SDA，滿足市場需求量，并降低成本。
[0008] 糙草（Asperugo procumbens)系紫草科糙草屬一至二年生蔓生草本植物，在我國 主要分布于我國的西藏、新疆、青海、甘肅、陜西、內(nèi)蒙等地，適應(yīng)于青藏高原，對寒、旱、強(qiáng)紫 外線具有很強(qiáng)的適應(yīng)性，種籽種含油率可達(dá)26. 65 %，不飽和脂肪酸達(dá)90 %左右，ALA、SDA、 GLA的含量分別達(dá)到36. 46%、11. 75%、5. 35%，是能同時(shí)提供多種PUFA的珍稀新油源植 物，已受到業(yè)界關(guān)注并開始被人工馴化種植。但是，天然糙草籽油中GLA和SDA的含量仍然 不高，通過代謝工程大幅提高其GLA和SDA含量具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。
[0009] 甘藍(lán)型油菜（Brassica napus L.，2n = 38，AACC)為我國五大油料作物之首，經(jīng)濟(jì) 性狀好，產(chǎn)量高，含油量高，抗逆性強(qiáng)，是重要的食用油和蛋白質(zhì)飼料來源，也是重要的工業(yè) 原料。菜子油品質(zhì)改良的重要內(nèi)容是改善其中脂肪酸的成分和含量，對于普通食用型菜籽 油而言，主要集中在降低或消除芥酸，增加油酸的比例，減少易導(dǎo)致油腐敗的ALA的比例， 提高含油量。通過導(dǎo)入外源D6D基因，利用油菜這一傳統(tǒng)大宗油料作物作為生物反應(yīng)器，來 生產(chǎn)GLA、SDA等PUFA，是油菜品質(zhì)改良和分子育種的另一個(gè)重要方面，在人類的醫(yī)藥保健 領(lǐng)域具有重要的意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 有鑒于此，本發(fā)明的目的之一在于提供糙草a6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家 族，本發(fā)明的目的之二在于提供含有糙草△ 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族的重組表 達(dá)載體；本發(fā)明的目的之三在于提供含有上述所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子；本發(fā)明的目的 之四在于提供糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族在提高糙草屬植物亞麻酸和 十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用；本發(fā)明的目的之五在于提供糙草A6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D 基因家族在大宗油料作物重建亞麻酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。
[0011] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0012] 1、糙草八6-脂肪酸脫飽和酶4口060基因家族，所述4口060基因家族包括4口0601 和ApD6D2兩個(gè)成員；所述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID N0. 5所示或SEQ ID N0. 5所示 氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸，且來源于糙草的具有△ 6-脂肪酸脫飽和酶 活性的氨基酸序列；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID N0. 6所示或SEQ ID N0. 6所示氨 基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸，且來源于糙草的具有△ 6-脂肪酸脫飽和酶活 性的氨基酸序列。
[0013] 優(yōu)選的，所述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQIDN0. 5所示；所述ApD6D2的氨基酸序 列如SEQIDN0. 6所示。
[0014] 優(yōu)選的，所述ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸 序列經(jīng)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸，且來源于糙草的編碼具有△ 6-脂肪酸脫飽和酶 活性的核苷酸序列；所述4口0602的基因序列如3￡〇10勵(lì).4所示或3￡〇10勵(lì).4所示核苷 酸序列經(jīng)取代、缺失或添加至少一個(gè)核苷酸，且來源于糙草的編碼具有△ 6-脂肪酸脫飽和 酶活性的核苷酸序列。
[0015] 優(yōu)選的，所述ApD6Dl的基因序列如SEQIDN0. 3所示，所述ApD6D2的基因序列如 SEQIDN0. 4 所示。
[0016] 2、含有所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族的重組表達(dá)載體。
[0017] 優(yōu)選的，所述重組載體含有ApD6Dl基因編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序列，所述 ApD6Dl基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQIDNo. 3第162?1511位堿基所示，所述ApD6D2基 因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQIDNo. 4的第390?1739位堿基所示。
[0018] 更優(yōu)選的，所述重組表達(dá)載體是將ApD6Dl基因編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序 列插入PC2301M1NPB載體的NapA啟動(dòng)子與Nos終止子之間而得；
[0019] 或所述重組表達(dá)載體是ApD6Dl基因編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序列插入 PYES2質(zhì)粒的Xbal和BamHI酶切位點(diǎn)而得；
[0020] 所述pC2301MlNPB載體由以下方法制備：用Hindlll和EcoRI切下pBI121上的 ⑶S基因表達(dá)盒然后插入pCAMBIA2301載體的Hindlll和EcoRI酶切位點(diǎn)處，然后用SacI 和Xmal切去⑶S基因后用帶有SacI和Xmal粘性末端的序列連接，得pC2301Ml載體，然后 在PC2301M1載體Hindlll酶切位點(diǎn)處連入由MAS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)bar基因表達(dá)、MAS終止子終 止表達(dá)的bar基因表達(dá)盒，得PC2301M1B載體；最后將PC2301M1B載體上的CaMV35S啟動(dòng)子 用種子特異啟動(dòng)子NapA替換即得PC2301M1NPB載體。
[0021] 3、含有所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。優(yōu)選的，所述轉(zhuǎn)化子為農(nóng)桿菌，更優(yōu)選的所述 農(nóng)桿菌為LBA4404。
[0022] 4、所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族在提高糙草屬植物Y _亞麻酸 和十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用。
[0023] 5、所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族在大宗油料作物重建Y_亞麻 酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。優(yōu)選的，所述大宗油料作物為油菜、大豆、花生、棉 花、向日葵、棕櫚或橄欖，更優(yōu)選的，大宗油料作物為油菜；最優(yōu)選的，所述油菜為甘藍(lán)型油 菜。
[0024] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供了糙草ApD6D基因家族2個(gè)成員ApD6Dl和 ApD6D2的全長cDNA序列和gDNA序列、編碼蛋白序列和結(jié)構(gòu)特征、進(jìn)化關(guān)系、表達(dá)的器官組 織特異性等，并確認(rèn)了ApD6D基因家族成員均編碼有雙活性的A6-脂肪酸脫飽和酶，采用 轉(zhuǎn)基因技術(shù)將ApD6Dl和ApD6D2基因正義轉(zhuǎn)化糙草后能夠大幅度提高種子中GLA和SDA的 含量，將ApD6Dl和ApD6D2正義轉(zhuǎn)化甘藍(lán)型油菜后均能夠引起種子中積累GLA和SDA，證明 ApD6D基因家族在植物GLA和SDA性狀的分子育種方面具有很好的應(yīng)用前景，其轉(zhuǎn)基因植物 可應(yīng)用于工業(yè)提取GLA和SDA，或直接應(yīng)用于生產(chǎn)富含GLA和SDA的保健型食用油。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0026] 圖1為ApD6D基因家族的克隆電泳圖，其中a為ApD6D基因家族保守區(qū)標(biāo)簽序列 的擴(kuò)增（A為ApD6Dl，B為ApD6D2)，b為ApD6Dl和ApD6D2的5' -RACE的巢式擴(kuò)增（E為 ApD6Dl，F(xiàn) 為 ApD6D2)，c 為 ApD6Dl 的 3' -RACE 的巢式擴(kuò)增（G 為 ApD6Dl)，d 為 ApD6D2 的 3' -RACE的巢式擴(kuò)增（H為ApD6Dl)，e為ApD6Dl和ApD6D2的全長cDNA擴(kuò)增（E和F為 ApD6Dl，G、H 為 ApD6D2)，M 為 Trans2K plus DNA marker。
[0027] 圖2為ApD6Dl和ApD6D2的核苷酸序列及其編碼的氨基酸序列圖（A為ApD6Dl，B 為ApD6D2,起始密碼子和終止密碼子加方框，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和poly (A)加尾位點(diǎn)加下劃線 (主要位點(diǎn)為粗體）。
[0028] 圖3為ApD6Dl和ApD6D2蛋白的系統(tǒng)分析圖[D6D : A 6-脂肪酸脫飽和酶；sD8D : A 8-鞘脂脫飽和酶（也簡稱為SLD);角齒蘚（Ceratodon purpureus，CAB94993. 1);地 錢（Marchantia polymorpha，AAT85661. 1);銀蓮花（Anemone leveillei，AAQ10731. 1); 銀蓮花（Anemone leveillei，AAQ10732. 1);黑加侖（Ribes nigrum，ADA60230. 1);黑加 侖（Ribes nigrum，ADA60228. 1);擬南芥（Arabidopsis thaliana，AAM648951);琉璃苣 (Borago officinalis，AAG43277. 1);琉璃苣（Borago officinalis，AAD01410. 1);藍(lán) 薊（Echium gentianoides，AAL23580. 1);煙草（Nicotiana tabacum，AB031111. 1);油茶 (Camellia oleifera，ADD10720. 1);柱花草（Stylosanthes hamata，ABU98945. 1);報(bào)春花 (Primula vialii，AAP23036. 1);報(bào)春花（Primula vialii，AAP23035. 1)]。
[0029] 圖4為ApD6Dl和ApD6D2在糙草各器官中轉(zhuǎn)錄表達(dá)的熒光定量PCR檢測結(jié)果（A 為ApD6Dl及其等位基因ApD6Dl'，B為ApD6D2及其等位基因ApD6D2'）。
[0030] 圖 5 為酵母菌株 INVScI 分別轉(zhuǎn) pYES2 (對照）、pYES2-ApD6Dl 和 pYES2-ApD6D2 的脂肪酸GC檢測圖（A :轉(zhuǎn)pYES2質(zhì)粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果；B :轉(zhuǎn) pYES2-ApD6Dl質(zhì)粒酵母菌株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果；C :轉(zhuǎn)pYES2-ApD6D2質(zhì)粒酵母菌 株INVScI脂肪酸GC檢測結(jié)果）。
【具體實(shí)施方式】
[0031] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0032]本發(fā)明實(shí)施例采用的植物材料為糙草（Asperugo procumbens)，采自青海省西寧 市湟中縣上新莊鎮(zhèn)地光村（海拔約3150m)，同時(shí)收獲糙草成熟種子用于轉(zhuǎn)基因研究。甘藍(lán) 型油菜（Brassica napus)品種中雙10號(hào)種子由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所張學(xué)昆研 究員惠贈(zèng)，油菜品種中油821等其它品種材料為自己保存，種植條件為常規(guī)試驗(yàn)條件。
[0033] 本發(fā)明實(shí)施例采用的試劑及試劑盒：SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 為美國 Clontech 公司產(chǎn)品；PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)>SYBR:?Premix Ex Taq? II(Tli RNaseH Plus)R0X plus>DNA Ligation Kit> pMD18_T、pMD19_T、Taq DNA 聚合酶、DNase I (RNase-free)及 buffer、RNase Inhibitor、 DL-2000及入-Hindlll DNA Marker購自大連寶生物（TaKaRa)生物工程有限公司；小量 植物組織RNA抽提試劑盒、膠回收試劑盒、小量法質(zhì)粒抽提試劑盒購自上海華舜生物技術(shù) 有限公司；限制性內(nèi)切酶購自立陶宛MBI Fermentas公司；MS(Murashige&Skoog medium， including vitamins)培養(yǎng)基為荷蘭 Duchefa 公司產(chǎn)品；DL_2000plus、Easy-Taq 酶、dNTPs 等試劑購自北京全式金（Transgen)生物技術(shù)有限公司；X-Gluc(5-brom〇-4-chlor〇-3_ind olyl-0-D-glucuronic acid)、利福平（Rif)、鏈霉素（Str)、卡那霉素（Kan)、氨節(jié)青霉素 (Amp)、瓊脂糖、Tris、CTAB、Tris 飽和酌?（pH = 8. 0)、Tryptone、Yeast Extract、X-gal、 IPTG、CTAB等其它生化與分子生物學(xué)試劑購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；植物 激素購自上海稼豐園藝用品等公司。
[0034] 本發(fā)明實(shí)施例采用的主要儀器：Veriti?多重控溫PCR儀購自美國Applied Biosystems公司；CFX96熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司；氣相色譜儀（Gas Chromatography，GC)為日本島津GC-7A型；以及分子生物學(xué)和基因工程的其它儀器設(shè)備。
[0035] 本發(fā)明實(shí)施例所用PCR引物和銜接子序列由上海英駿/英濰捷基公司、上海生工 或北京六合華大公司完成。
[0036] 實(shí)施例1、糙草D6D(ApD6D)基因家族的克隆
[0037] (1)糙草基因組總DNA和總RNA的提取
[0038] 取糙草植株的嫩葉，采用十六烷基三甲基溴化胺（CTAB)法提取基因組總DNA，采 用1. 0%瓊脂糖凝膠電泳法和分光光度法評價(jià)核酸樣品的質(zhì)量和濃度。結(jié)果顯示，提取的糙 草基因組總DNA的完整性好，平均分子量略大于入-HindIII DNA Marker的23kb條帶，RNA 消化完全，分光光度法檢測其純度也較高，可用于PCR擴(kuò)增。
[0039] 同時(shí)，以糙草的根（Ro)、莖（St)、葉（Le)、蕾（Bu)、花（F1)、早期種子（ES)、中期 種子（MS)、后期種子（LS)為材料，分別采用小量植物組織RNA抽提試劑盒提取總RNA，用 DNase I去除總RNA中含有的DNA雜質(zhì)，電泳檢測總RNA的質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)測定總RNA 的濃度和純度。電泳檢測表明獲得的總RNA特征條帶清晰，無明顯RNA降解和DNA污染，分 光光度法檢測評價(jià)的質(zhì)量也較好，能夠滿足后述實(shí)驗(yàn)的要求，然后儲(chǔ)存于_80°C冰箱備用。
[0040] (2)糙草種子RACE總cDNA第一鏈的獲得
[0041] 取糙草各發(fā)育階段的總RNA各1 ii g混合，采用SMARTer? RACE cDNA Amplification Kit 按照其說明書操作，分別得到 5' -RACE-Ready cDNA 和 3' -RACE-Ready cDNA第一鏈備用。
[0042] (3)ApD6D基因家族保守區(qū)的擴(kuò)增
[0043] 通過 Vector NTI Advance 9. 0 對琉璃苣（Borago officinalis)、藍(lán)薊（Echium gentianoides)、草玉梅（Anemone leveillei)、高穗花報(bào)春（Primula vialii)等植物 的D6D基因進(jìn)行多重比對，根據(jù)保守點(diǎn)設(shè)計(jì)兼并引物，上游引物為FBD6D0,下游引物為 RBD6D0,具體序列如表1所示。然后以3' -RACE-Ready cDNA 1 ii 1為模板，F(xiàn)BD6D0和RBD6D0 為引物，擴(kuò)增ApD6D基因家族的保守區(qū)序列。PCR反應(yīng)的程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min ;94°C變 性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行 電泳檢測，結(jié)果如圖1中a所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增出了 1條近1. 4kb的特異條帶，然后回收 特異條帶，并進(jìn)行TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，送7個(gè)陽性克隆子測序，將測序結(jié)果進(jìn)行多重比 對后發(fā)現(xiàn)獲得了 2個(gè)獨(dú)立基因（unigene)的標(biāo)簽序列，凈長度分別為1350bp和1353bp (不 計(jì)引物上的人工酶切位點(diǎn)），其核苷酸序列分別如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。經(jīng) nucleotide blast (http: //blast, ncbi. nlm. nih. gov/)比對后發(fā)現(xiàn)它們均與植物特別是 紫草科D6D基因最同源，表明該序列為ApD6D基因家族2個(gè)成員的標(biāo)簽序列，分別命名為 ApD6Dl和 ApD6D2。
[0044] (4)ApD6D基因家族5'-cDNA末端和3'-cDNA末端的擴(kuò)增
[0045] 根據(jù)克隆獲得的保守區(qū)標(biāo)簽序列，分析保守區(qū)序列的同源性后，設(shè)計(jì)了克 隆 ApD6Dl 和 ApD6D25' 端的 4 個(gè)反向引物，分別如下 RBD6D5-1、RBD6D5-2、RApD6D2S、 RApD6D2SN，其引物序列如表1所示。然后以5'-RACE-Ready cDNA liiL為模板，用引物組 合UPM與RBD6D5-1和UPM與RApD6D2S分別進(jìn)行ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE的第 一次PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性2min ;94°C變性30sec，62°C退火30sec，72°C 延伸lmin，22個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。再以第一次擴(kuò)增PCR產(chǎn)物0. liiL為模板，用引物 組合NUP與RBD6D5-2和NUP與RApD6D2SN分別進(jìn)行ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE的 巢式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序同第一次PCR擴(kuò)增，區(qū)別為退火溫度為60°C且擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)。 將巢式PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果如圖1中b所示。結(jié)果顯示，ApD6Dl和ApD6D2基 因的5' -RACE均產(chǎn)生了 1條約800bp的寬帶，與其它植物D6D基因序列預(yù)測的長度相近。 回收ApD6Dl和ApD6D2基因的5' -RACE擴(kuò)增條帶、經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，將轉(zhuǎn)化子用 PCR進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，ApD6D2插入片段存在長度多態(tài)性，根據(jù)檢測結(jié)果各送7個(gè)代表性 克隆子測序，結(jié)果表明ApD6Dl的5' -cDNA末端凈長度為760bp，ApD6D2的5' -cDNA末端凈 長度為931bp、830bp、817bp、789bp、678bp、607bp 6種，且短片段包含在長片段序列內(nèi)，表 明ApD6D2的5' -cDNA具有長度多態(tài)性，這可能由轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的位置不同而引起的。
[0046] 根據(jù)前面克隆獲得的保守區(qū)標(biāo)簽序列，分析保守區(qū)序列的同源性后，設(shè)計(jì)克隆 ApD6Dl 和 ApD6D23'端 4 個(gè)正向引物，分別如下：FBD6D3-1、FBD6D3-2、FApD6D2S、FApD6D2SN， 引物序列如表1所示。然后以3'-RACE-Ready cDNA liiL為模板，用引物組合FBD6D3-1與 UPM和FApD6D2S與UPM分別進(jìn)行ApD6Dl和ApD6D2基因的3'-RACE第一次PCR擴(kuò)增，反應(yīng) 程序同5' -RACE。取第一次PCR擴(kuò)增產(chǎn)物0. 1 y L為模板，分別用引物組合FBD6D3-2與NUP 和FApD6D2SN與NUP進(jìn)行ApD6Dl和ApD6D2的3' -RACE的巢式PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序同 第一次PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳檢測，結(jié)果分別如圖1中c和d所示。結(jié)果顯示 ApD6D13' -RACE產(chǎn)生了約600bp的條帶，ApD6D23' -RACE產(chǎn)生了約400bp的條帶，與根據(jù) 其它植物D6D基因序列預(yù)測的長度相近。將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行膠回收、經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿 菌，然后將轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果表明，ApD6D23'-RACE的克隆子存在長度的多態(tài)性，分 別送2個(gè)ApD6D13' -RACE和4個(gè)ApD6D23' -RACE代表性的克隆子測序，結(jié)果表明ApD6Dl 的3' -cDNA末端凈長度為519bp這1種，ApD6D2的3' -cDNA末端凈長度為302、300、279、 192bp這4種，長度多態(tài)性可能由poly(A)加尾位置不同而引起的。
[0047] (5)ApD6D基因家族全長cDNA和gDNA的克隆
[0048] 根據(jù)ApD6D基因家族的保守區(qū)、5'-狀0￡、3'-狀0￡的測序結(jié)果，利用軟件可以分別 拼接出ApD6Dl和ApD6D2的全長cDNA序列，然后分別設(shè)計(jì)了 ApD6Dl全長cDNA和gDNA的 擴(kuò)增引物組合FApD6Dl與RApD6Dl、ApD6D2全長cDNA和gDNA的擴(kuò)增引物組合FApD6D2u或 FApD6D2d與RApD6D2,引物序列如表1所示。
[0049] 以 3' -RACE-ReadycDNA1iiL為模板，分別用引物組合FApD6Dl與RApD6Dl、 FApD6D2u與RApD6D2、FApD6D2d與RApD6D2 進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性 2min; 94°C變性lmin，56-60°C退火lmin，72°C延伸2min，35個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行電泳檢測，結(jié)果如圖1中e所示。結(jié)果顯示分別獲得了約1. 8kb、l. 9kb、l. 8kb的特異條 帶，將擴(kuò)增條件進(jìn)行回收、經(jīng)TA克隆后轉(zhuǎn)化大腸桿菌、送克隆子測序。結(jié)果表明，ApD6Dl的 全長cDNA為1768bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 3所示；ApD6D2的全長cDNA分別為1912bp 或1811bp，核苷酸序列如SEQIDNO. 4所示和SEQIDNO. 4所示第102位至1912位所示， 擴(kuò)增獲得的全長cDNA序列與拼接序列一致。
[0050] 然后以基因組總DNA 1 ii L為模板，用引物組合FApD6Dl與RApD6Dl、FApD6D2u與 RApD6D2、FApD6D2d與RApD6D2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物回收，經(jīng)TA克隆、然后測序。結(jié)果 顯示，以DNA為模板擴(kuò)增獲得序列與獲得的全長cDNA序列完全一致，說明這兩個(gè)基因均沒 有內(nèi)含子。
[0051] 表l、ApD6D基因家族克隆引物
[0052]
【權(quán)利要求】
1. 糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所述ApD6D基因家族包括 八口0601和4口0602兩個(gè)成員；所述4口0601的氨基酸序列如5￡〇10勵(lì).5所示或5￡〇10勵(lì).5 所示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸，且來源于糙草的具有A 6-脂肪酸脫飽 和酶活性的氨基酸序列；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6所示或SEQ ID NO. 6所 示氨基酸序列取代、缺失或添加至少一個(gè)氨基酸，且來源于糙草的具有A 6-脂肪酸脫飽和 酶活性的氨基酸序列。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所 述ApD6Dl的氨基酸序列如SEQ ID NO. 5所示；所述ApD6D2的氨基酸序列如SEQ ID NO. 6 所示。
3. 權(quán)利要求1所述的糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所述 ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示或SEQ ID NO. 3所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或添 加至少一個(gè)核苷酸，且來源于糙草的編碼具有A 6-脂肪酸脫飽和酶活性的核苷酸序列；所 述ApD6D2的基因序列如SEQ ID NO. 4所示或SEQ ID NO. 4所示核苷酸序列經(jīng)取代、缺失或 添加至少一個(gè)核苷酸，且來源于糙草的編碼具有A 6-脂肪酸脫飽和酶活性的核苷酸序列。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族，其特征在于：所 述ApD6Dl的基因序列如SEQ ID NO. 3所示，所述ApD6D2的基因序列如SEQ ID NO. 4所示。
5. 含有權(quán)利要求3所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族的重組表達(dá)載體。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組載體含有ApD6Dl基因 編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序列，所述ApD6Dl基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID No. 3 第162?1511位堿基所示，所述ApD6D2基因編碼區(qū)的序列對應(yīng)于SEQ ID No. 4的第390? 1739位堿基所示。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體是將ApD6Dl 基因編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序列插入pC2301MlNPB載體的NapA啟動(dòng)子與Nos終止 子之間而得； 或所述重組表達(dá)載體是ApD6Dl基因編碼區(qū)或ApD6D2基因編碼區(qū)的序列插入pYES2質(zhì) 粒的Xbal和BamHI酶切位點(diǎn)而得； 所述PC2301M1NPB載體由以下方法制備：用Hindlll和EcoRI切下pBI121上的⑶S 基因表達(dá)盒然后插入PCAMBIA2301載體的Hindlll和EcoRI酶切位點(diǎn)處，然后用SacI和 Xmal切去⑶S基因后用帶有SacI和Xmal粘性末端的序列連接，得pC2301Ml載體，然后在 PC2301M1載體Hindlll酶切位點(diǎn)處連入由MAS啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)bar基因表達(dá)、MAS終止子終止 表達(dá)的bar基因表達(dá)盒，得PC2301M1B載體；最后將PC2301M1B載體上的CaMV35S啟動(dòng)子用 種子特異啟動(dòng)子NapA替換即得PC2301M1NPB載體。
8. 含有權(quán)利要求5-7任一項(xiàng)所述重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)化子。
9. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族在提高糙草屬 植物亞麻酸和十八碳四烯酸含量中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1-4任一項(xiàng)所述糙草A 6-脂肪酸脫飽和酶ApD6D基因家族在大宗油料作 物重建亞麻酸和十八碳四烯酸合成途徑中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N9/02GK104450748SQ201410658168
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】柴友榮, 柴成燕, 練劍平, 付春, 王瑞, 韓發(fā), 周雪榮, 馬赑 申請人:西南大學(xué)