一種藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系及其制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系及其制備方法。該株系首先通過(guò)克隆一個(gè)硬紫草中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因(LeMYC)并構(gòu)建其植物過(guò)表達(dá)載體，然后將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834后，侵染硬紫草的無(wú)菌苗而獲得。該轉(zhuǎn)基因株系所產(chǎn)紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無(wú)菌苗所獲得的毛狀根株系的3.37倍。同時(shí)，該株系易于繁殖、生長(zhǎng)迅速。本發(fā)明不僅可有效解決我國(guó)野外硬紫草資源日益短缺、人工栽培周期長(zhǎng)、受氣候及地理?xiàng)l件等因素制約問(wèn)題，并且可高效大量生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物。該高產(chǎn)株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物提供材料支撐，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系及其制備方 法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀 根株系及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 紫草屬紫草科多年生草本植物，為藥典收載臨床常用傳統(tǒng)中藥。1990年以后的 《中華人民共和國(guó)藥典》中收錄了紫草科（Boraginaceae)3種植物，即軟紫草屬（Arnebia Forsk)的新疆紫草[A. euchroma (Royle) Johnst.]，主產(chǎn)地為新疆；蒙紫草（黃花軟紫 草，A. guttata Bunge)，分布于我國(guó)西北至華北地區(qū)；紫草屬（Lithospermum)的硬紫草 (Lithospermum erythrorhizon)，在我國(guó)分布車(chē)交廣。漬紫草（Onosma paniculatum Bur. et Franch)在云南也常作紫草入藥。
[0003] 紫草的活性成分主要分布于根，因而藥用價(jià)值最高，被稱(chēng)為綠色黃金，成為行銷(xiāo)海 內(nèi)外的"道地藥材"，其主要活性成分紫草素亦稱(chēng)紫草寧及其衍生物為萘醌類(lèi)化合物，具有 抗免疫缺血、抗腫瘤，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多硬化癥、艾滋病、過(guò)敏性紫癜、銀肩病以及保肝 護(hù)肝、降血糖、降血粘度、降壓、解熱、鎮(zhèn)痛止痛等功效；多糖能增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性 免疫能力；紫草油具有治療燒傷、燙傷、急慢性膿耳、口腔潰瘍、褥瘡、痔瘡、急慢性濕瘆以及 促進(jìn)傷口愈合等功效；紫草色素具有抗真菌作用，可作為生物毒素用于番茄葉霉病的防治。 此外紫草素還可作為天然色素，被聯(lián)合國(guó)食品添加劑法典委員會(huì)列入食品、化妝品、藥品添 加劑范圍，廣泛用于化妝品、防曬制品（如塑料制品）、食品、藥品等著色以及印染、洗滌劑 的添加劑等，被國(guó)際譽(yù)為紅色素之王。紫草根油可直接入藥，制成軟膠囊可達(dá)藥用標(biāo)準(zhǔn)，籽 油具降糖、降壓、降血脂等功效，還可作工業(yè)用油。因此，紫草已逐漸成為醫(yī)療、食品色素和 化妝品及防病治病開(kāi)發(fā)新藥研宄的熱點(diǎn)。
[0004] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，采用植物基因工程技術(shù)生產(chǎn)并提高人類(lèi)所需的紫草 寧，成為一種非常重要的替代手段。上世紀(jì)70年代，日本即已成功運(yùn)用兩階段培養(yǎng)體系，即 在光照條件下B5固體培養(yǎng)基上繁殖紫草細(xì)胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產(chǎn)培養(yǎng)基 中培養(yǎng)紫草細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧。然而在植物細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中普遍存在細(xì)胞系不穩(wěn) 定細(xì)胞生長(zhǎng)緩慢，不耐剪切及代謝物產(chǎn)量低等問(wèn)題又成為其實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸。
[0005] 紫草毛狀根體系的建立可為大量生產(chǎn)天然活性物質(zhì)提供有效的手段。發(fā)根農(nóng)桿菌 (Agrobacteriumrhizogenes)是屬于根瘤菌科農(nóng)桿菌屬革蘭氏陰性菌，能侵染絕大多數(shù)雙 子葉植物和少數(shù)單子葉植物誘發(fā)被侵染植物受傷部位產(chǎn)生毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌之所以具有 這種致根特性是由于它具有能誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生的Ri質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外 的一個(gè)大質(zhì)粒，帶有冠癭堿合成基因和生長(zhǎng)素合成基因。毛狀根培養(yǎng)是較細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生天 然產(chǎn)物具有更優(yōu)越的實(shí)驗(yàn)材料。此外，由于發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒能將外源基因整合到 寄主染色體、其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根易獲得再生植株等優(yōu)點(diǎn)，因此，建立特定植物的轉(zhuǎn)基因毛 狀根體系，提高毛狀根中次生代謝物的產(chǎn)量，在定向植物分子育種方面具有廣泛應(yīng)用前景。 近年來(lái)利用發(fā)根農(nóng)桿菌已轉(zhuǎn)化大約160多種植物，在40多種植物建立了毛狀根培養(yǎng)體系， 特別是一些藥用植物建立了毛狀根轉(zhuǎn)基因體系，極大地方便了藥用天然產(chǎn)物生產(chǎn)及遺傳育 種研宄。
[0006] 具有bHLH結(jié)構(gòu)域的MYC蛋白是調(diào)節(jié)植物次生代謝物合成的一類(lèi)重要轉(zhuǎn)錄因子，通 常又稱(chēng)bHLH轉(zhuǎn)錄因子。它們?cè)谡{(diào)節(jié)玉米、擬南芥、各種觀賞植物及園藝植物花青素的生物 合成方面具有重要作用。如玉米中編碼bHLH轉(zhuǎn)錄因子的基因R1具有調(diào)節(jié)谷粒糊粉層著色， 調(diào)節(jié)花藥及胚芽鞘著色功能。擬南芥中參與調(diào)控花青素合成的bHLH蛋白主要包括TT8、GL3 和EGL3,通過(guò)調(diào)節(jié)花青素原代謝途徑中的DFR和ANS/LDOX的表達(dá)而促進(jìn)花青素原的合成。 各種觀賞植物及園藝植物花青素的合成也是受bHLH轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的，如非洲菊（Gerbera hybrida) GMYC1編碼的bHLH蛋白調(diào)節(jié)花冠和心皮中DFR的表達(dá)促進(jìn)花青素的合成。bHLH 蛋白通常與R2R3類(lèi)MYB轉(zhuǎn)錄因子和WD40蛋白形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體MBW共同調(diào)節(jié)花青素代謝途 徑中各種酶基因的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)花青素等苯丙素類(lèi)化合物的合成。
[0007] 本課題組在前期工作中對(duì)在M9培養(yǎng)基上生產(chǎn)紫草寧及其衍生物的紫草細(xì)胞轉(zhuǎn)錄 組深度測(cè)序發(fā)現(xiàn)一個(gè)高豐度的具有編碼bHLH結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄本，結(jié)合文獻(xiàn)的相關(guān)報(bào)道，我們 推測(cè)bHLH轉(zhuǎn)錄因子可能在紫草寧及其衍生物的合成調(diào)節(jié)方面具有重要作用。
[0008] 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫草本身的MYC基因轉(zhuǎn)入紫草中過(guò)表達(dá)，提高紫草毛狀根中紫 草寧的含量，從中篩選出高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，在理論上是完全 可行的。
[0009] 通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的紫草毛狀根株系，不僅在系統(tǒng)研宄紫草 藥用天然產(chǎn)物生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)制方面具有重要的理論意義，并在商業(yè)化生產(chǎn) 紫草藥用天然產(chǎn)物方面具有非常重要的應(yīng)用前景和價(jià)值。盡管目前國(guó)內(nèi)外有利用毛狀根為 材料對(duì)紫草寧合成調(diào)控進(jìn)行的相關(guān)研宄，但并無(wú)將紫草bHLH類(lèi)MYC蛋白的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入發(fā) 根農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)出能高效合成紫草藥用天然產(chǎn)物的紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根并藉此提高紫草寧合 成的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010] 本發(fā)明需要解決的問(wèn)題是通過(guò)轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一個(gè)高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草 轉(zhuǎn)基因毛狀根株系及其制備方法。本發(fā)明根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期M9培養(yǎng)基上生產(chǎn)紫草寧及其 衍生物的紫草細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序信息，通過(guò)RACE技術(shù)（rapid amplification of cDNA ends)克隆出具有bHLH結(jié)構(gòu)域的LeMYC轉(zhuǎn)錄因子基因（基因登錄號(hào)N0.KC818627)，將所選 擇的LeMYC基因構(gòu)建植物過(guò)表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，然后侵染硬紫草無(wú)菌苗，高效誘 導(dǎo)出含目的基因LeMYC的硬紫草毛狀根株系，對(duì)獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行分子 鑒定和藥用天然產(chǎn)物含量檢測(cè)。
[0011] 本發(fā)明所述硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的制備方法包括如下步驟：
[0012] (1)提取在M9紫草寧色素生產(chǎn)培養(yǎng)基上紫草細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模 板，根據(jù)實(shí)驗(yàn)室前期M9培養(yǎng)基上生產(chǎn)紫草寧及其衍生物的紫草細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組深度測(cè)序信息 設(shè)計(jì)引物，通過(guò)RACE技術(shù)克隆出具有bHLH結(jié)構(gòu)域的LeMYC轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)序列。高 保真酶擴(kuò)增目的基因LeMYC，將獲得的目的片段與真核表達(dá)載體pEGAD-eGFP (購(gòu)自北京天 根生化科技有限公司）連接，將連接產(chǎn)物用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834(購(gòu)自北京中 國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心）感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽(yáng)性克隆。
[0013] (2)將硬紫草種子表面清洗干凈，低溫浸泡在自來(lái)水中兩天，此間換水2-3次，然 后用濕砂和種子混勻后放入4°C冰箱層積處理1個(gè)月左右，種子出芽后，用自來(lái)水沖洗掉沙 子，用0. 1 %升汞消毒發(fā)芽的種子5分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5-7次，將水空干接種在1/2MS 無(wú)激素的固體培養(yǎng)基上于25°C，16小時(shí)光照8小時(shí)暗培養(yǎng)2周。待幼苗長(zhǎng)至2-4cm高度并 伸展出第2-3對(duì)真葉時(shí)用作被侵染材料。
[0014] (3)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備：挑取陽(yáng)性克隆菌落，用YEB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增至0D600 = 0. 8時(shí)，添加乙酰丁香酮（AS)，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0015] (4)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根：用無(wú)菌針浸蘸上述活化的具有侵染特 性的菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對(duì)真葉的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖 節(jié)處一下，共穿刺2-3次。然后將侵染的幼苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于25°C弱散射光培 養(yǎng)。針刺一周左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，隨后在侵染部位的白色突起首先變成 絨毛狀，然后長(zhǎng)出一條或多條白色的毛狀根。將誘發(fā)的毛狀根從侵染點(diǎn)部位剪切下來(lái)，培養(yǎng) 在含有頭孢霉素500mg/L的B5培養(yǎng)基上，每周轉(zhuǎn)接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素B5 培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
[0016] (5)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根的培養(yǎng)：將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培 養(yǎng)；將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0017] (6)轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定：取野生型和預(yù)計(jì)為轉(zhuǎn)基因毛狀根材料提取其DNA作 為模板，運(yùn)用PCR方法同時(shí)檢測(cè)農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因， 判斷是否為硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0018] (7)紫草寧合成及測(cè)定：將鑒定的轉(zhuǎn)基因紫草毛狀根經(jīng)B5液體生長(zhǎng)培養(yǎng)15天后 轉(zhuǎn)入M9生產(chǎn)紫草寧液體培養(yǎng)基，置于26°C黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃 度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計(jì)測(cè)定 紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根（只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草 毛狀根）為對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0019] 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是：
[0020] 如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧的培養(yǎng)體 系，已經(jīng)成為紫草寧藥用研宄及大量商業(yè)化應(yīng)用的一個(gè)制約因素。至今未見(jiàn)通過(guò)誘導(dǎo)出轉(zhuǎn) 入LeMYC基因的毛狀根，藉此提高紫草寧合成產(chǎn)量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明首次將一個(gè)紫 草bHLH類(lèi)MYC家族蛋白的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因LeMYC轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根 農(nóng)桿菌后再轉(zhuǎn)入紫草無(wú)菌苗，誘導(dǎo)出紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根；獲得的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫 草寧含量較野生型紫草毛狀根大大提高。該方法可克服紫草愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)困難，細(xì)胞 易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季難產(chǎn)或不產(chǎn)紫草寧等諸多問(wèn)題；解決了 利用愈傷細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化存在的周期長(zhǎng)，轉(zhuǎn)化效率偏低等問(wèn)題，轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)和繁 殖不受外界環(huán)境、季節(jié)和紫草花期等因素制約，大大提高紫草轉(zhuǎn)基因效率；轉(zhuǎn)入的LeMYC基 因有助于紫草藥用天然產(chǎn)物合成的分子調(diào)控機(jī)制研宄，對(duì)紫草功能基因鑒定和研宄及植物 分子育種具有重要指導(dǎo)意義，對(duì)其他轉(zhuǎn)基因困難的木本植物提供了可靠的借鑒方法；獲得 的轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧高產(chǎn)株系，具有廣闊的開(kāi)發(fā)應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0021] 圖1用RACE技術(shù)克隆LeMYC基因的全長(zhǎng)序列
[0022] 圖2針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)LeMYC基因的硬紫草毛狀根
[0023] 圖3轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0024] 圖4轉(zhuǎn)基因毛狀根在B5液體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0025] 圖5轉(zhuǎn)LeMYC基因硬紫草毛狀根RolC基因，35S-eGFP-LeMYC融合基因檢測(cè)
[0026] 圖6轉(zhuǎn)基因毛狀根在M9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)
[0027] 圖7轉(zhuǎn)基因毛狀根紫草寧及其衍生物含量測(cè)定及比較
【具體實(shí)施方式】
[0028] 實(shí)施例1、LeMYC基因全長(zhǎng)序列克隆及載體構(gòu)建
[0029] (l)LeMYC基因全長(zhǎng)序列克?。夯谟沧喜菁?xì)胞兩階段培養(yǎng)即在B5培養(yǎng)基上細(xì) 胞增殖生長(zhǎng)和在M9培養(yǎng)基上生產(chǎn)紫草素，我們對(duì)M9細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了深度測(cè)序發(fā)現(xiàn) 存在一條與MYC基因高度保守的cDNA片段，序列長(zhǎng)度為1653bp。根據(jù)這一序列信息我們 設(shè)計(jì)了用于 3' RACE 與 5' RACE 的引物。3' RACE FI :TCTATGCTCTTAGAGCAGTAGITCC ;3' RACE F2 ：TTCAGCTCCACCAACATCGCGTGGG ；5'RACE FI ：AAAGTGCCTGACCCGGAAGCCCGG ；5'RACE F2 ： TTCTTGCTCAGCCATGAAGGCAGG.利用該引物和試劑盒中的相應(yīng)引物進(jìn)行末端巢式PCR擴(kuò)增， 分別得到該基因的5'和3'的基因片段大小分別為483bp、480bp (圖1)，經(jīng)克隆測(cè)序后得到 了該基因的全長(zhǎng)序列命名為L(zhǎng)eMYC，基因的0RF框?yàn)?91 lbp，編碼636個(gè)氨基酸。
[0030] ⑵過(guò)表達(dá)載體構(gòu)建：根據(jù)已克隆的紫草LeMYC 5'和3'序列設(shè)計(jì)克隆該基因 的全長(zhǎng)序列引物 LeMYC-ORF-F :5' -ATGATGAACTTCTGGAACAATACTACACC-3' ；LeMYC-〇RF-R : 5' -TTAGGCAGTTTCGGCTACTCTTGATGTC-3'，高保真酶擴(kuò)增目的片段；將獲得的目的片段切膠 回收，并與pEGAD-eGFP載體連接，構(gòu)建pEGAD-eGFP-LeMYC質(zhì)粒；將pEGAD-eGFP-LeMYC質(zhì)粒 用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克隆。
[0031] 實(shí)施例2、轉(zhuǎn)硬紫草LeMYC基因毛狀根的誘導(dǎo)
[0032] (1)硬紫草無(wú)菌苗培養(yǎng)：選取飽滿(mǎn)的硬紫草種子，無(wú)菌水清洗后置于4°C環(huán)境中 黑暗培養(yǎng)1-2個(gè)月，直至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，清水洗干凈；用0. 1 %的升汞消毒 5min，再用無(wú)菌水清洗5-7次；置于MS基本培養(yǎng)基，26°C -28°C光照培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的 紫草無(wú)菌苗。一個(gè)月后，當(dāng)紫草無(wú)菌苗長(zhǎng)出兩片真葉后，作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。
[0033] (2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備：將獲得的陽(yáng)性克隆菌落，轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基，在 26-28°C，lOOrpm的搖床中擴(kuò)增至0D600 = 0. 8時(shí)，添加100 y M的AS，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0034] (3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根：用接種針蘸上述活化的具有侵染特性 的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無(wú)菌苗的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節(jié)處一下，每 株共穿刺2-3次；將侵染的無(wú)菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。10-15天左右 即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長(zhǎng)出絨毛狀根系，然后長(zhǎng)出 一條或多條毛狀根（圖2);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法， 誘導(dǎo)出紫草野生型毛狀根，作為對(duì)照材料。
[0035] 實(shí)施例3、轉(zhuǎn)硬紫草LeMYC基因毛狀根的培養(yǎng)
[0036](1)毛狀根除菌培養(yǎng)：誘導(dǎo)出來(lái)的毛狀根經(jīng)過(guò)一星期的生長(zhǎng)，剪取長(zhǎng)度約1cm的毛 狀根，轉(zhuǎn)入B5+500mg/L頭孢霉素的固體除菌培養(yǎng)基，再過(guò)一星期轉(zhuǎn)入B5+250mg/L頭孢霉 素，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基培養(yǎng)（圖3);
[0037] (2)毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)：將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基，lOOrpm的搖 床中光照擴(kuò)大培養(yǎng)（圖4)。
[0038] 實(shí)施例4、轉(zhuǎn)硬紫草LeMYC基因毛狀根的鑒定
[0039] 取一定數(shù)量毛狀根，CTAB法提取毛狀根DNA為模板，設(shè)計(jì)檢測(cè)RolC與 35S-eGFP-LeMYC融合基因的引物分別為RolC-F:5' -ACAAGCCACTTCTGITTCCC-3' ；RolC-R: 5' -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3'，CaMV35S-F:5'-CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；LeMYC-R-115 7:5' -ATCTCCCCTTCACCTCCAAATACTG-3'用PCR方法擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序比對(duì)，檢測(cè)轉(zhuǎn)基因毛 狀根中農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因存在與否，隨機(jī)選取的3個(gè)擴(kuò)大培養(yǎng)硬紫草毛狀根株系， 均檢測(cè)到RolC基因的存在，說(shuō)明獲得的均為毛狀根；同時(shí)檢測(cè)35S-eGFP-LeMYC融合基因 (圖5)，表明用含有構(gòu)建載體的發(fā)根農(nóng)桿菌侵染紫草獲得的毛狀根為轉(zhuǎn)基因毛狀根。
[0040] 實(shí)施例5、轉(zhuǎn)硬紫草LeMYC基因毛狀根紫草寧含量測(cè)定
[0041] (1)將驗(yàn)證為轉(zhuǎn)入目的基因的轉(zhuǎn)基因硬紫草毛狀根及野生型毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體 培養(yǎng)基，置于26°C、100rpm的搖床中黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度（圖 6) 〇
[0042] (2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光 度計(jì)測(cè)定紫草寧含量，以野生型紫草毛狀根為對(duì)照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量含量 (圖7)。紫草寧含量總量包括紫草細(xì)胞或毛狀根和分泌到M9培養(yǎng)基中的紫草寧含量總和。 具體方法如下：稱(chēng)取在M9培養(yǎng)體系中的毛狀根，并取含有分泌的紫草寧的M9培養(yǎng)基，用石 油醚浸泡，反復(fù)提取紫草寧，直到提取液無(wú)色，合并提取液，紫外分光光度計(jì)測(cè)定0D520的 吸光值，由下列方程得到紫草寧含量：紫草寧含量（mg/gFW) = 41. 66X0D520X稀釋倍數(shù)。
[0043] (3)紫草寧含量測(cè)定顯示，所得到的這一個(gè)轉(zhuǎn)LeMYC基因的硬紫草毛狀根中紫草 寧含量比野生型毛狀根中的含量提高3. 37倍，而且該株系具有生長(zhǎng)速度快、繁殖容易的特 點(diǎn)，適于商業(yè)化生產(chǎn)所用，命名為L(zhǎng)eMYC-1ine-001。
【權(quán)利要求】
1. 一種藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，其特征是硬紫草轉(zhuǎn)LeMYC基因毛狀 根株系。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系的制備方法，其特征 是由以下步驟構(gòu)成： (1) 提取在M9紫草寧色素生產(chǎn)培養(yǎng)基上紫草細(xì)胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板，通 過(guò)RACE技術(shù)克隆出具有bHLH結(jié)構(gòu)域的LeMYC轉(zhuǎn)錄因子基因的全長(zhǎng)序列。高保真酶擴(kuò)增目 的基因 LeMYC，將獲得的目的片段與真核表達(dá)載體pEGAD-eGFP連接，將連接產(chǎn)物用凍融法 轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽(yáng)性克??； (2) 將硬紫草種子表面清洗干凈，低溫浸泡在自來(lái)水中兩天，此間換水2-3次，然后 用濕砂和種子混勻后放入4°C冰箱層積處理1個(gè)月，種子出芽后，用自來(lái)水沖洗掉沙子，用 0. 1 %升汞消毒發(fā)芽的種子5分鐘，然后用無(wú)菌水沖洗5-7次，將水空干接種在1/2MS無(wú)激 素的固體培養(yǎng)基上于25°C，16小時(shí)光照8小時(shí)暗培養(yǎng)2周，待幼苗長(zhǎng)至2-4cm高度并伸展 出第2-3對(duì)真葉時(shí)用作被侵染材料； (3) 轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備：挑取陽(yáng)性克隆菌落，用YEB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增至0D600 = 0. 8 時(shí)，添加乙酰丁香酮，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液； (4) 針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根：用無(wú)菌針浸蘸上述活化的具有侵染特性的 菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對(duì)真葉的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖節(jié)處 一下，共穿刺2-3次，然后將侵染的幼苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于25°C弱散射光培養(yǎng)。針 刺一周即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，隨后在侵染部位的白色突起首先變成絨毛狀，然 后長(zhǎng)出一條或多條白色的毛狀根，將誘發(fā)的毛狀根從侵染點(diǎn)部位剪切下來(lái)，培養(yǎng)在含有頭 孢霉素500mg/L的B5培養(yǎng)基上，每周轉(zhuǎn)接一次，直至除完菌后，移到不含抗生素 B5培養(yǎng)基 上培養(yǎng)； (5) 硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根的培養(yǎng)：將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)， 將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)； (6) 轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定：取野生型和預(yù)計(jì)為轉(zhuǎn)基因毛狀根材料提取其DNA作為模 板，運(yùn)用PCR方法同時(shí)檢測(cè)農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因和35S-eGFP-LeMYC融合基因，判斷 是否為硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根； (7) 紫草寧合成及測(cè)定：將鑒定的轉(zhuǎn)基因紫草毛狀根經(jīng)B5液體生長(zhǎng)培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)入 M9生產(chǎn)紫草寧液體培養(yǎng)基，置于26°C黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度，用 石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧，紫外分光光度計(jì)測(cè)定紫草寧 含量，以野生型紫草毛狀根即不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根為對(duì) 照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104450772SQ201410657429
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月18日
【發(fā)明者】楊永華, 趙胡, 戚金亮, 吳鳳瑤, 朱煜, 楊榮武, 龐延軍 申請(qǐng)人:南京大學(xué)