一株新型黑曲霉和其生產(chǎn)糖化酶的方法

一株新型黑曲霉和其生產(chǎn)糖化酶的方法【專利摘要】本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域，公開了一種以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株，通過誘變與篩選獲得的產(chǎn)耐熱糖化酶的生產(chǎn)菌株的其制備方法與其產(chǎn)糖化酶方面的應(yīng)用，并按此方法成功得到產(chǎn)耐熱糖化酶生產(chǎn)菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCCNo.8641，該菌株經(jīng)發(fā)酵產(chǎn)得的糖化酶與原始菌株產(chǎn)得的糖化酶相比，催化底物的最適溫度可提高至少10℃，即可達(dá)71℃，同時(shí)比酶活最高可達(dá)4219U/mL，高于黑曲霉(Aspergillusniger)原始菌種，在很大程度上降低了生產(chǎn)成本，具有一定的創(chuàng)新性，有較強(qiáng)的應(yīng)用前景與開發(fā)意義。CGMCCNo.86412013.12.27【專利說明】一株新型黑曲霉和其生產(chǎn)糖化酶的方法【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明屬于食品領(lǐng)域,具體涉及一種以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株，通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)單獨(dú)或協(xié)同誘變并經(jīng)過篩選獲得的產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,同時(shí)還涉及該菌株的制備方法以及利用該菌株生產(chǎn)耐高溫糖化酶方面的應(yīng)用。該菌株產(chǎn)得的糖化酶與原始菌株產(chǎn)得的糖化酶相比，在比酶活基本不變的情況下，催化底物淀粉的最適溫度可提高至71°C，在很大程度上降低了生產(chǎn)成本，有較強(qiáng)的應(yīng)用前景?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]糖化酶，又稱葡萄糖淀粉酶[Glucoamylase，系統(tǒng)命名為淀粉α-1.4_葡聚糖葡萄糖水解酶，ct-1.4-Glucanglucohydrolase(EC.3.2.1.3)],是一種具有外切活性的酶,它能把淀粉、糊精、糖原等從非還原性末端水解α-1.4-葡萄糖苷鍵，而得到終產(chǎn)物β-D-葡萄糖，也能緩慢水解α-1.6-葡萄糖苷鍵，轉(zhuǎn)化為葡萄糖，是淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖過程中的關(guān)鍵酶之一[1_2]。糖化酶具有重要商業(yè)價(jià)值，凡對(duì)淀粉、糊精、低聚糖進(jìn)行酶水解的工業(yè)上，都可適用。糖化酶分布很廣，植物、動(dòng)物、微生物中都存在，在工業(yè)中應(yīng)用的糖化酶主要從曲霉屬(Aspergillus)、根霉屬(Rhizopus)等絲狀真菌和酵母屬(Saccharmyces)中獲得，已報(bào)道的產(chǎn)糖化酶真菌微生物有23個(gè)屬35個(gè)種。但目前工業(yè)化生產(chǎn)的酶制劑多來自于曲霉和根霉，這些酶被食品和藥物管理中心(FDA)認(rèn)定為是安全的[3]。[0003]我國(guó)的這種酶制劑市場(chǎng)主要被國(guó)外著名酶制劑公司丹麥諾維信和美國(guó)杰能科公司的產(chǎn)品占領(lǐng)，導(dǎo)致使用該酶制劑的企業(yè)主要依賴進(jìn)口，不但形成了國(guó)外公司技術(shù)壟斷的局面，而且由于進(jìn)口酶制劑價(jià)格高導(dǎo)致生產(chǎn)成本大幅度上升。因此，開發(fā)具有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的、低成本高效能的糖化酶已成為我國(guó)玉米深加工產(chǎn)業(yè)的當(dāng)務(wù)之急。現(xiàn)階段國(guó)內(nèi)外使用的糖化酶不僅被國(guó)際大公司壟斷，從技術(shù)角度來講還都存在一定不足，即其耐熱溫度不高，致使其生產(chǎn)過程造成能源巨大浪費(fèi)。在所有的玉米深加工過程中，其液化工藝中使用的第一步催化溫度為90°C_95°C，進(jìn)一步糖化過程將利用上步所得淀粉與糖化酶催化反應(yīng)，得到還原性糖等產(chǎn)物，然而目前糖化酶的催化溫度均在58-60°C，因而需要將第一步進(jìn)行降溫調(diào)節(jié)，這種反復(fù)的升溫降溫不僅浪費(fèi)能源、損害設(shè)備，而且給生產(chǎn)帶來了諸多難題。生產(chǎn)中糖化一般溫度超過60°C，國(guó)產(chǎn)糖化酶活力會(huì)急劇下降，造成生產(chǎn)成本的顯著升高，[4_5]。當(dāng)前在實(shí)驗(yàn)室條件中，黑曲霉產(chǎn)糖化酶的催化活力一般為1000-2500U/mL，產(chǎn)糖化酶最適催化溫度為58-60°C，本專利涉及誘變菌株黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641催化活力最高可達(dá)4219U/mL，產(chǎn)糖化酶最適催化溫度為71°C，即在糖化酶催化比活力增高的情況下，使催化最適溫度提高了至少10°C，一旦應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)，可在很大程度上節(jié)約了能源，降低了成本，提聞了生廣效率。[0004]因此，為了盡快開發(fā)我國(guó)具有自用知識(shí)產(chǎn)權(quán)的專用酶制劑，推動(dòng)我國(guó)玉米深加工產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展，擬進(jìn)行耐高溫糖化酶酶制劑的生產(chǎn)關(guān)鍵技術(shù)改造及產(chǎn)業(yè)化示范具有重大意義。又因?yàn)槲覈?guó)北方玉米種植廣泛，因而采用現(xiàn)代高新技術(shù)開發(fā)化工等系列產(chǎn)品產(chǎn)業(yè)化高效生產(chǎn)技術(shù)是發(fā)展北方地區(qū)經(jīng)濟(jì)的可行之路。[0005]本項(xiàng)目采用紫外(UV)誘變和硫酸二乙酯(DES)協(xié)同或單獨(dú)進(jìn)行多輪誘變并篩選獲得產(chǎn)耐高溫糖化酶的黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641;采用生物統(tǒng)計(jì)優(yōu)化技術(shù)建立以玉米淀粉為主要原料的黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)工藝。降低糖化酶的生產(chǎn)成本，降低玉米精深加工過程中對(duì)設(shè)備的損害，減少能源浪費(fèi)，節(jié)約成本。本專利成果可以充分利用豐富的玉米資源，促進(jìn)可再生資源產(chǎn)業(yè)的高效、優(yōu)質(zhì)、快速發(fā)展，能夠滿足玉米深加工生產(chǎn)企業(yè)需求，創(chuàng)造良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益，具有較強(qiáng)的產(chǎn)業(yè)化優(yōu)勢(shì)和廣闊的市場(chǎng)發(fā)展前景?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的之一是以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株,通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協(xié)同或單獨(dú)誘變和篩選，獲得產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)菌株，獲得的菌株其分類命名為:黑曲霉(Aspergillusniger)UD9，已于2013年12月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所)，保藏編號(hào)為:CGMCC8641,故以下簡(jiǎn)稱黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0007]黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,屬于子囊菌亞門，絲孢目，叢梗孢科，黑曲霉種。黑曲霉壁厚而光滑，頂部形成球形頂囊，其上全面覆蓋一層?；鸵粚有」＃」Ｉ祥L(zhǎng)有成串褐黑色的球狀，直徑2.5?4.0μm。分生孢子頭球狀，直徑700?800μm,褐黑色。蔓延迅速，初為白色，后變成鮮黃色直至黑色厚絨狀，背面無色或中央略帶黃褐色。分生孢子頭褐黑色放射狀，分生孢子梗長(zhǎng)短不一。頂囊球形，雙層小梗。是重要的發(fā)酵工業(yè)菌種。黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641在含淀粉培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，培養(yǎng)基pH4.0?6.5之間，培養(yǎng)溫度28-35°C，最低相對(duì)濕度為88%，能引致水分較高的糧食霉變和其他工業(yè)器材霉變。其發(fā)酵產(chǎn)物之一糖化酶廣泛用于食品化工等行業(yè)。[0008]本發(fā)明的目的之二是提供一種上述產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)菌株CGMCC8641的制備方法；該制備方法通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協(xié)同或單獨(dú)誘變和篩選，易于實(shí)施、簡(jiǎn)潔、高效。又通過黑曲霉液體培養(yǎng)基與黑曲霉種子培養(yǎng)基逐級(jí)培養(yǎng)，黑曲霉長(zhǎng)勢(shì)良好，易于發(fā)酵。[0009]本發(fā)明的目的之三是提供一種利用本發(fā)明獲得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，以玉米淀粉為碳源發(fā)酵生產(chǎn)耐高溫糖化酶的方法。[0010]為了說明上述三項(xiàng)發(fā)明方法，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案:[0011]I)原始菌株的培養(yǎng)與孢子懸浮液的制備；[0012]2)菌種誘變與篩選；[0013]3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養(yǎng)；[0014]4)菌株發(fā)酵；[0015]5)產(chǎn)物純化與濃縮；[0016]6)糖化酶理化性質(zhì)分析。[0017]對(duì)于以上技術(shù)方案，具體步驟如下:[0018]步驟I)原始菌株的培養(yǎng)與孢子懸浮液的制備具體步驟為:從原始黑曲霉(Aspergillusniger)斜面培養(yǎng)基上挑取一接種環(huán)原始菌株,接種于黑曲霉液體培養(yǎng)基,在28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，反復(fù)活化兩次然后向三角瓶中加入玻璃珠，充分振蕩，使孢子脫落并過濾，再將所得全部孢子轉(zhuǎn)移到黑曲霉液體培養(yǎng)基，使孢子活化萌發(fā)，得到孢子濃度為107CFU/mL的孢子懸浮液。將所得孢子轉(zhuǎn)移到相同液體培養(yǎng)基，在28_35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)20-35h。黑曲霉液體培養(yǎng)基的質(zhì)量配比為:蔗糖3%、硝酸鈉0.2%等，培養(yǎng)基的pH為4.0-6.5,高壓滅菌。[0019]步驟2)菌種誘變與篩選的具體步驟為:原始菌株經(jīng)上一步處理后，分別采用紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)單獨(dú)誘變或協(xié)同誘變方法對(duì)原始菌種進(jìn)行誘變，其中硫酸二乙酯(DES)誘變方法為取孢子懸浮2%的硫代硫酸鈉溶液10-20ul終止反應(yīng)。用無菌水做梯度稀釋，按不同梯度稀釋菌液，然后涂布培養(yǎng)皿平板，每個(gè)梯度各涂布至少10個(gè)培養(yǎng)皿平板，然后預(yù)熱紫外燈和磁力攪拌器30min，取5-10mL孢子懸浮液放置于直徑9cm的培養(yǎng)皿中，放入滅菌的磁力攪拌珠，打開磁力攪拌器，菌液均勻接受紫外線照射，誘變組分別梯度照射5-60min，之后在紅光下做梯度稀釋，每組分別取不同梯度的菌液涂布培養(yǎng)皿平板，每組每個(gè)梯度各涂布至少10個(gè)培養(yǎng)皿平板，另外，取原始菌株的菌液做空白對(duì)照組，稀釋濃度，涂布方法同誘變組，所有培養(yǎng)皿平板28-35°C避光培養(yǎng)2-4天。每次用DNS法篩選得到發(fā)酵產(chǎn)糖化酶催化最適溫度與最適溫度下酶活力同時(shí)最高的菌株最為下一輪誘變的出發(fā)菌株，再次誘變篩選，反復(fù)多輪，直至誘變篩選出酶活力與最適溫度同時(shí)最高的-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。[0020]步驟3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養(yǎng)的具體步驟為:選擇菌落出現(xiàn)較早、菌落直徑較大的誘變菌落挑取于黑曲霉液體培養(yǎng)基中，28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，反復(fù)兩次，轉(zhuǎn)移至黑曲霉種子培養(yǎng)基28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，其中黑曲霉種子培養(yǎng)基質(zhì)量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調(diào)節(jié)PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。[0021]步驟4)菌株發(fā)酵的具體步驟為:取上述種子培養(yǎng)基接種于黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)3-7晝夜，過濾、離心取上清，即得粗酶液，其中發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調(diào)節(jié)PH值至4.0-6.5，聞壓滅菌。[0022]步驟5)產(chǎn)物純化與濃縮的具體步驟為:50%-80%飽和度的硫酸銨對(duì)粗酶液進(jìn)行沉淀，再用PH為4.0-6.5的檸檬酸緩沖液重懸，于截留量為10KD-40KD的透析袋內(nèi)透析，4°C過夜，次日取出。此鹽析-透析過程反復(fù)兩次，用反透析法進(jìn)行純化后酶液的濃縮。[0023]步驟6)糖化酶理化性質(zhì)分析的具體步驟為:取粗酶液與純化后酶液分別進(jìn)行了蛋白含量、酶催化最適溫度及酶活力的測(cè)定。其中糖化酶最適溫度的測(cè)定:取待測(cè)酶液，稀釋合適的倍數(shù)。設(shè)定50°C-80°C，間隔1°C為溫度梯度。在每一溫度梯度下采用DNS法測(cè)定糖化酶的酶活力，選擇酶活力最高的溫度作為最適催化溫度。每個(gè)樣做3個(gè)平行；蛋白含量的測(cè)定:取待測(cè)液，稀釋合適的倍數(shù)。采用Bradford法測(cè)定蛋白含量，用酶標(biāo)儀在595nm下，測(cè)得A595nm,并計(jì)算蛋白質(zhì)含量，每個(gè)樣做3個(gè)平行；粗酶液酶活力的測(cè)定:取5mL2%可溶性淀粉溶液和5mL稀釋酶液，在最適溫度條件下保溫1min后，用一次性滴管吸取I?2滴反應(yīng)液于比色板上，用0.lmol/L碘液檢測(cè)，保證有淀粉殘余，沸水浴中5min終止酶促反應(yīng)。取冷卻后的反應(yīng)液ImL于刻度試管(20mL)中，加入ImLDNS顯色劑，沸水浴充分反應(yīng)8min，取出迅速冷卻后，用蒸餾水定容至1mL刻度線處，搖勻，酶標(biāo)儀測(cè)定540nm處吸光度值。用加熱滅活的酶液做空白，且每個(gè)樣做3個(gè)平行。[0024]本發(fā)明的有益效果描述有以下三點(diǎn):[0025]一、由于原始菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶過程中會(huì)分泌出糖化酶，這種糖化酶的最適催化溫度一般為58-60°C，比酶活一般為1000-4000U/mL在玉米精深加工中會(huì)造成巨大的能源浪費(fèi)和設(shè)備損傷。所以，選育產(chǎn)耐高溫糖化酶的菌株是從根本上解決以上問題的方法以黑曲霉(Aspergillusniger)為原始菌株,通過誘變和篩選，獲得產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641:該菌株最適酶活可達(dá)71°C，同時(shí)比酶活最高可達(dá)4219U/mL，極大程度地節(jié)約了發(fā)酵成本，可廣泛用于食品化工等行業(yè)，前景廣闊，市場(chǎng)潛力巨大。[0026]二、提供一種產(chǎn)耐高溫糖化酶的生產(chǎn)菌株CGMCC8641的制備方法；該制備方法通過紫外線(UV)和硫酸二乙酯(DES)協(xié)同或單獨(dú)誘變和篩選，遺傳穩(wěn)定性好，易于實(shí)施、簡(jiǎn)潔、高效。又通過兩輪黑曲霉液體培養(yǎng)基與黑曲霉擴(kuò)大培養(yǎng)基逐級(jí)培養(yǎng)，黑曲霉長(zhǎng)勢(shì)良好，易于發(fā)酵。[0027]三、利用本發(fā)明獲得的菌株一黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641,以玉米淀粉為碳源發(fā)酵生產(chǎn)耐高溫糖化酶，確定該菌株發(fā)酵產(chǎn)糖化酶最適條件，產(chǎn)生穩(wěn)定的糖化酶，在玉米精深加工方面取得突破性進(jìn)展。[0028]應(yīng)用實(shí)例1:一級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵[0029](I)菌種:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641[0030](2)培養(yǎng)基的配制:[0031]液體培養(yǎng)基質(zhì)量比:[0032]蔗糖3%，硝酸鈉0.2%，磷酸氫二鉀0.1%等，pH=4.7-5.0。[0033]擴(kuò)大培養(yǎng)基質(zhì)量比:[0034]葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調(diào)節(jié)PH值至4.7-5.0。[0035]發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比:[0036]玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調(diào)節(jié)PH值至4.7-5.0。[0037](3)活化培養(yǎng):挑取誘變菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641接種于20mL黑曲霉液體培養(yǎng)基，在28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)24h，使孢子活化萌發(fā)。[0038](4)種子培養(yǎng):取上述液體培養(yǎng)液按10%接種于200mL種子培養(yǎng)基，28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)48h。[0039](5)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶:取上述種子培養(yǎng)液20mL接種于200mL發(fā)酵培養(yǎng)基，28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)120h，取發(fā)酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0040](6)發(fā)酵后處理:取粗酶液經(jīng)過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經(jīng)DNS法測(cè)定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為4219U/mL。[0041]應(yīng)用實(shí)例2:二級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵[0042](I)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶:取一級(jí)發(fā)酵液50mL接種于500mL發(fā)酵培養(yǎng)基，作為二級(jí)發(fā)酵液，28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)120h，取發(fā)酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0043](2)發(fā)酵后處理:取粗酶液經(jīng)過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經(jīng)DNS法測(cè)定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為3974U/mL。[0044]應(yīng)用實(shí)例3:三級(jí)擴(kuò)大發(fā)酵[0045](I)發(fā)酵產(chǎn)糖化酶:取二級(jí)酵液150mL接種于1500mL發(fā)酵培養(yǎng)基，作為三級(jí)發(fā)酵液，28°C條件下?lián)u床培養(yǎng)120h，取發(fā)酵液無菌紗布過濾并離心30min，得上清液即為糖化酶粗酶液。[0046](2)發(fā)酵后處理:取粗酶液經(jīng)過80%硫酸銨鹽析沉淀，以PH4.6檸檬酸緩沖液重懸并透析、濃縮得純化后糖化酶液，經(jīng)DNS法測(cè)定糖化酶最適催化溫度為71°C，該溫度下的比酶活為3277U/mL。[0047]參考文獻(xiàn)[0048][l]NorouzianD,AkbarzadehA,ScharerJM,etal.Fungalglucoamylases[J].B1technolAdv.,2006,24:80-85.[0049][2]CardonaF,GotiA,BrandiA,etal.Moleculardynamicssimulat1nofthecomplexesofglucoamylaseIIfromAspergillusawamorivar.XlOOwithdeoxynojiromycinandlentiginosine[J].JMolModel,1997,3(1):249.[0050][3]PavezziFC,CarneiroAAJ,MartinsDA,etal.1nfluenceofdifferentsubstatesontheproduct1nofamutantthermostableglucoamylaseinsubmergedfermentat1n[J].ApplBicohemB1technol,2011,163:14-24.[0051][4]G1RDANORL,TROVATIJ,SCHMIDELLff.Continuousproduct1nofethanolfromstarchusingglucoamylaseandyeastco-1mmobiIizedinpectingel[J].ApplB1chemB1technol,2008,147(1-3):47-61.[0052][5]李旺軍，方華，謝廣發(fā)，等.RSM法優(yōu)化AspergillusoryzaeA0-01產(chǎn)糖化酶條件的研究[J].食品科學(xué)，2007,28(11):322-327.【權(quán)利要求】1.一株新型黑曲霉和其生產(chǎn)糖化酶的方法:一種黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641，于2013年12月27日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)這一過程的特征如下:步驟:1)原始菌株的培養(yǎng)與孢子懸浮液的制備；2)菌種誘變與篩選；3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養(yǎng)；4)菌株發(fā)酵；5)產(chǎn)物純化與濃縮；6)糖化酶理化性質(zhì)分析。2.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟I)原始菌株的培養(yǎng)與孢子懸浮液的制備的具體步驟為:挑取原始菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)接種于黑曲霉液體培養(yǎng)基，在28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，反復(fù)活化兩次，將所得孢子轉(zhuǎn)移到相同液體培養(yǎng)基，在28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)20-35h，使孢子活化萌發(fā)，其中液體培養(yǎng)基的質(zhì)量配比為:蔗糖3%、硝酸鈉0.2%等；培養(yǎng)基的pH為4.0-6.5，高壓滅菌。3.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟2)菌種誘變與篩選的具體步驟為:原始菌株經(jīng)上一步處理后，分別采用紫外線和硫酸二乙酯單獨(dú)誘變或協(xié)同誘變方法對(duì)原始菌種進(jìn)行反復(fù)誘變，篩選得到產(chǎn)糖化酶催化最適溫度與最適溫度下酶活力同時(shí)最高的菌株-黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641。4.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟3)黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641的培養(yǎng)的具體步驟為:選擇菌落出現(xiàn)較早、菌落直徑較大的誘變菌落挑取于黑曲霉液體培養(yǎng)基中，28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，反復(fù)兩次，轉(zhuǎn)移至黑曲霉種子培養(yǎng)基28_35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)35-60h，其中黑曲霉種子培養(yǎng)基質(zhì)量比:葡萄糖2%，淀粉4%，酵母提取物2%等，調(diào)節(jié)PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。5.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟4)菌株發(fā)酵的具體步驟為:取上述種子培養(yǎng)基接種于黑曲霉發(fā)酵培養(yǎng)基，28-35°C條件下?lián)u床培養(yǎng)3-7天，過濾、離心取上清，即得粗酶液，其中發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量比:玉米淀粉6%，豆柏粉1.8%，玉米糖漿1.8%，硫酸鋅0.18%等，調(diào)節(jié)PH值至4.0-6.5，高壓滅菌。6.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟5)產(chǎn)物純化與濃縮的具體步驟為:50%-80%飽和度的硫酸銨對(duì)粗酶液進(jìn)行沉淀，再用PH為4.0-6.5的檸檬酸緩沖液重懸，透析袋內(nèi)透析，鹽析-透析過程反復(fù)兩次，用反透析法進(jìn)行酶液的濃縮。7.根據(jù)權(quán)利要求所述:黑曲霉(Aspergillusniger)CGMCC8641誘變篩選、制備過程與耐高溫糖化酶的生產(chǎn)過程，其特征在于，步驟6)糖化酶理化性質(zhì)分析的具體步驟為:取粗酶液與純化后酶液分別進(jìn)行了蛋白含量、酶催化最適溫度及酶活力的測(cè)定。【文檔編號(hào)】C12N1/14GK104357335SQ201410613332【公開日】2015年2月18日申請(qǐng)日期:2014年10月31日優(yōu)先權(quán)日:2014年10月31日【發(fā)明者】胡鑫,李悅,梁冬雪,王玉華,于寒松,郭藝迪申請(qǐng)人:吉林大學(xué)