一種假單胞菌株和由其產(chǎn)生的低溫脂肪酶及基因的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種假單胞菌（ Pseudomonas sp.）PF16和假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶及其基因；通過純化得到的低溫脂肪酶Lip-PF16具有良好的低溫活性、酶活高，可廣泛用于洗滌、食品加工、皮革加工、助消化劑、有機(jī)合成化工產(chǎn)品、香料、藥物制備、油脂加工等行業(yè)。CGMCC NO 936220140619
【專利說明】-種假單胞菌株和由其產(chǎn)生的低溫脂肪酶及基因
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及酶基因工程和酶工程領(lǐng)域，具體涉及一株假單胞菌(AeWiZoffioaas sp. PF16,簡稱PF16)，及其脂肪酶基因和含有該酶基因的重組質(zhì)粒和表達(dá)相應(yīng)酶的重組菌株在 生產(chǎn)低溫脂肪酶中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 脂肪酶（Lipase，EC 3. I. L 3)是一類在油-水界面上催化天然油脂（甘油三脂） 降解為甘油和游離脂肪酸的酶，廣泛存在于微生物和高等真核生物中。目前，工業(yè)上應(yīng)用的 脂肪酶大多是由微生物產(chǎn)生，且基本上為胞外酶，產(chǎn)酶的最適溫度多在30°C以上，而酶的最 適反應(yīng)溫度一般在40°C左右或更高，在0°C附近普遍喪失活性?？傮w而言，微生物脂肪酶具 有比動(dòng)植物脂肪酶更廣的作用pH、作用溫度范圍，高穩(wěn)定性和活性、對(duì)底物有特異性。脂肪 酶反應(yīng)條件溫和，具有優(yōu)良的立體選擇性，并且不會(huì)造成環(huán)境污染。因此，在食品、皮革、醫(yī) 藥、飼料和洗滌劑等許多工業(yè)領(lǐng)域中均有廣泛的應(yīng)用。
[0003] 脂肪酶可以將廉價(jià)的脂加工成昂貴的脂肪。可可脂是一種昂貴脂肪，它含有棕櫚 酸和硬脂酸，熔點(diǎn)為37°C，在口中熔化時(shí)可以產(chǎn)生一種類似于巧克力的涼爽的口感。利用 脂肪酶的水解作用和合成反應(yīng)，可以將棕櫚油轉(zhuǎn)化為類可可脂。比如利用米赫毛霉(ifocor 脂肪酶Lipozyme IM，可以使硬脂酸甲酯與33~39°C熔點(diǎn)棕櫚油進(jìn)行酯交換，制取類 可可脂。由于脂肪酶的交換作用，許多不飽和脂肪酸（PUFAs)越來越多地應(yīng)用于營養(yǎng)業(yè)和 食品業(yè)中。微生物脂肪酶還應(yīng)用于從動(dòng)物脂質(zhì)中獲取PUFAs，例如鯡魚油、金槍魚油等。此 夕卜，脂肪酶在改變植物油物理性狀方面也有很大的潛力。
[0004] 傳統(tǒng)的處理織物表面脂質(zhì)的方法是用化學(xué)品脫除。但這種方法處理后的效果不理 想，且環(huán)境污染大，成本高。脂肪酶能將織物表面的脂質(zhì)水解成易溶于水的脂肪酸，易于脫 除。EI-Syed等研究了脂肪酶處理羊毛毯的防縮性能，比未處理的羊毛縮水性有明顯改善。 用脂肪酶和淀粉酶協(xié)同處理棉布纖維，棉布白度提高，顏色瑕疵少，更柔軟舒適。
[0005] 脂肪酶可以用做疾病診斷工具，它是一種重要的藥物靶或中間體標(biāo)記酶，可用來 預(yù)測疾病。通過測定脂肪酶催化甘油三酸酯產(chǎn)生的甘油可間接獲得血清甘油三酸酯的含 量，血清中脂肪酶還可用于檢測急性胰腺炎和胰腺損傷。Ahmed研究了脂肪酶和血清淀粉酶 測定胰腺炎的特異性，結(jié)果表明，胰腺炎病發(fā)后血脂肪酶明顯升高，診斷有特異性，結(jié)果比 血清淀粉酶更可靠。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，從蠟蛀蟲中提取的脂肪酶或酯酶，對(duì)分生桿菌屬結(jié)核桿菌 iMercWiasis) H37Rv有殺滅作用。提取植物脂肪酶制成的藥物，可改善 患者的消化吸收功能。美國俄勒岡州健康護(hù)理專業(yè)研究中心已有脂肪酶類藥品上市，用于 治療胃腸紊亂、消化不良等疾病。在手性藥物合成中，用脂肪酶制備單異構(gòu)體手性藥物可提 高轉(zhuǎn)化率、減少環(huán)境污染。
[0006] 在工業(yè)上，脂肪酶作為洗滌劑的添加劑來水解脂肪。作為去污劑的添加劑所用的 脂肪酶必需具備以下幾個(gè)條件：首先是底物特異性低，如可水解不同脂肪的混合物；其次 是可適用于不同的洗滌條件（ρΗ1(Γ?1，3(Γ6(Γ〇 ;再有就是可防止表面活性劑和蛋白酶的 破壞。目前還可通過連續(xù)篩選和蛋白質(zhì)技術(shù)結(jié)合獲得所需的脂肪酶。1994年,Novo Nordisk 首次合成了市售的重組脂肪酶（Lipolase)，它是真菌脂肪酶基 因在中表達(dá)獲得的。
[0007] 根據(jù)Margsin等人的定義，低溫脂肪酶是指最適酶活溫度在30°C左右，在(TC左右 仍有一定催化活性的脂肪酶。目前研究的低溫脂肪酶普遍由低溫微生物分泌產(chǎn)生，酶的最 適反應(yīng)溫度一般均低于40°C，而在(TC仍具高酶活。由于它們普遍具有低溫下酶活力高、抗 有機(jī)溶劑等特點(diǎn)，因而成為了近年來酶學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。
[0008] 低溫脂肪酶主要有以下四個(gè)生理生化特點(diǎn)：（1)最適作用溫度低或在低溫下有高 催化活性是脂肪酶歸類為低溫脂肪酶的先決條件。（2)在低溫下的具有高周轉(zhuǎn)率（Kcat)和 高催化效率（Kcat/Km)是低溫酶的主要適應(yīng)特性，它們可以彌補(bǔ)低溫導(dǎo)致化學(xué)反應(yīng)速率降 低帶來的影響，為生物提夠足夠的代謝活力并維持足夠的代謝通量。高催化效率對(duì)所有低 溫酶來說都是尤為重要的，因?yàn)樗梢员ＷC低溫下底物與酶活性位點(diǎn)的充分結(jié)合。（3)結(jié)構(gòu) 柔順性是低溫脂肪酶的另一個(gè)特點(diǎn)。低溫脂肪酶柔順、松散和開放的結(jié)構(gòu)特征，有助于提高 酶分子在催化過程中的構(gòu)象變化能力。（4)低溫脂肪酶的熱穩(wěn)定性差。低溫脂肪酶結(jié)構(gòu)的 高度柔順性可能造成蛋白的離子配位松散，并且由于缺乏二硫鍵及剛性的二極結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致 低溫脂肪酶對(duì)熱變性敏感，穩(wěn)定性降低。
[0009] 和其它低溫酶相比較，低溫脂肪酶不但具有其它低溫酶的共同特征，而且還有自 己的一些獨(dú)特的理化特征，歸納起來大致有以下幾點(diǎn)：一是對(duì)有機(jī)溶劑有較好的耐受性，在 一定濃度的有機(jī)溶劑中，低溫脂肪酶不僅不失活，酶活反而有所提高，這一特性為低溫脂肪 酶今后在化學(xué)工業(yè)中的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。二是大部分低溫脂肪酶對(duì)鏈長為C3~C10的甘油 酯具有好的催化活性，這點(diǎn)與較偏好短鏈的酯類是不同。三是相對(duì)于高溫和中溫脂肪酶而 言，低溫脂肪酶有更寬的PH適應(yīng)范圍，這進(jìn)一步拓寬了它的工業(yè)應(yīng)用范圍。一般來說，酶的 理化特性是由其結(jié)構(gòu)決定的，但對(duì)于如何從結(jié)構(gòu)上解釋低溫脂肪酶的獨(dú)特理化特性，根據(jù) 現(xiàn)有的研究結(jié)果還未能給出一個(gè)很好的解釋，需要作進(jìn)一步的研究。
[0010] 近來低溫脂肪酶的研究得到了快速發(fā)展，除了比較傳統(tǒng)的研究方法如低溫選育和 突變選育以外，隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和計(jì)算機(jī)技術(shù)的快速發(fā)展，對(duì)低溫脂肪酶進(jìn)行研究的方 法和手段有了飛速提高。利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)低溫脂肪酶的分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行3D建模模擬 分析，已經(jīng)從結(jié)構(gòu)上解釋了部分低溫脂肪酶的低溫適應(yīng)機(jī)制和低溫催化特性。而要進(jìn)一步 解釋清楚低溫脂肪酶的理化和結(jié)構(gòu)特征與低溫適應(yīng)性的關(guān)系，無疑DNA芯片，蛋白質(zhì)芯片 以及晶體結(jié)構(gòu)分析技術(shù)將是今后研究方法發(fā)展的方向。同樣，針對(duì)低溫脂肪酶的表達(dá)量低、 難純化以及熱穩(wěn)定性差等問題也建立起了一些相應(yīng)的研究方法。比如：利用基因工程手段 對(duì)低溫脂肪酶分子進(jìn)行克隆和異源表達(dá)使低溫脂肪酶的產(chǎn)量提高，在純化低溫脂肪酶時(shí)對(duì) 傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)純化方法進(jìn)行改進(jìn)，利用酶的固定化技術(shù)改變低溫脂肪酶的熱穩(wěn)定性等，運(yùn) 用這些方法已在低溫脂肪酶的分離和純化以及相關(guān)研究中取得了一定成效。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0011] 本發(fā)明的目的旨在提供一株假單胞菌sp. PF16,簡稱PF16)，該菌 株已經(jīng)于2014年6月19日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址： 北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國科學(xué)院微生物研究所，保藏號(hào)為：CGMCC No. 9362。
[0012] 本發(fā)明菌株是從4°C冷庫中分離篩選到1株脂肪酶產(chǎn)生菌株，對(duì)該菌進(jìn)行了形態(tài) 學(xué)和16S rRNA基因序列分析，并對(duì)該菌所產(chǎn)生的脂肪酶進(jìn)行了部分酶學(xué)性質(zhì)研究，主要包 括酶的熱穩(wěn)定性及pH穩(wěn)定性。
[0013] 為保證能正確克隆到假單胞菌PF16 sp. PF16)脂肪酶基因，采用了 PCR克隆拼接即運(yùn)用BLASTp和ClustalX序列分析軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，通過比對(duì)假單胞 菌屬的脂肪酶基因，找到它們的保守區(qū)域，然后根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)簡并引物分段擴(kuò)增潛在 的脂肪酶基因，最后通過拼接獲得脂肪酶的全基因序列；該假單胞菌產(chǎn)生的脂肪酶的氨基 酸序列如SEQ ID NO :2所示，其基因的核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示； 為了使低溫脂肪酶基因能夠在大腸桿菌中進(jìn)行高效表達(dá)，要構(gòu)建目的基因的原核表達(dá) 載體，將其轉(zhuǎn)入大腸桿菌，主要是將目的蛋白重組到pET21a，構(gòu)建目的蛋白的原核表達(dá)載體 Lip-PF16/pET21a，然后在大腸桿菌中表達(dá)目的蛋白。
[0014] 假單胞菌PF16所產(chǎn)脂肪酶為胞內(nèi)脂肪酶，在(T25°C、pH 7. 5~10溫度條件下穩(wěn)定， 是一種堿性低溫脂肪酶。
[0015] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)和技術(shù)效果如下： 1、 本發(fā)明提供的脂肪酶是一種堿性低溫脂肪酶，在0~25°c、pH 7. 5~10溫度條件下穩(wěn) 定； 2、 通過純化得到的低溫脂肪酶具有良好的低溫活性、酶活高，可廣泛用于洗滌、食品加 工、皮革加工、助消化劑、香料、藥物制備等行業(yè)； 3、 該低溫脂肪酶都有著接近自然環(huán)境溫度的最適酶活反應(yīng)溫度，因此它們?cè)诃h(huán)境修復(fù) 領(lǐng)域大有用武之地，不僅可用于去除低溫狀態(tài)下工業(yè)廢物中的油脂，諸如：脂類加工所產(chǎn) 生的含脂廢物和飲食業(yè)產(chǎn)生的含油脂廢物等，還可以處理大量的城市和生活含脂廢水和廢 物。用低溫脂肪酶處理這些含脂廢棄物時(shí)，所需附加的熱能低，且安全、高效，不會(huì)造成二次 污染，對(duì)環(huán)境保護(hù)有非常積極的意義； 4、 由于該低溫脂肪酶具有極高的選擇性和專一性，它們還可用于藥物合成生產(chǎn)，這不 僅能有效提高手性化合物的產(chǎn)率，而且在一定程度上降低了產(chǎn)生副作用的幾率，同時(shí)減少 了合成時(shí)所需的能量，保證了藥品質(zhì)量。
[0016] 總之，該低溫脂肪酶由于其在低溫下的高催化特性，在工業(yè)上有著越來越廣泛應(yīng) 用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0017] 圖1為本發(fā)明中重組質(zhì)粒Lip-PF16/pMD18-T的酶切鑒定電泳圖，圖中：1為 Lip-PF16G/pMD18-T ; M 為 DNA Marker (Ikb λ DNA maker); 圖2為本發(fā)明中Lip-PF16/ pET21a的酶切鑒定示意圖，圖中：1?3均為Lip-PF16/ pET21a，M 為 DNA Marker ; 圖3為本發(fā)明中SDS-PAGE電泳檢測脂肪酶基因的表達(dá)結(jié)果示意圖，圖中：1為 Lip-PF16 /pET21a/BL21 未經(jīng) IPTG誘導(dǎo)；2 為 pET21a/BL21 ;3、4 為 Lip-PF16 /pET21a/BL21 誘導(dǎo)表達(dá)后的全菌；5、6為Lip-PF16 /pET21a/BL21誘導(dǎo)表達(dá)后菌體破碎后的上清；7、8為 Lip-PF16 /pET21a/BL21誘導(dǎo)表達(dá)后菌體破碎后的沉淀； 圖4為本發(fā)明中低溫脂肪酶Lip- PF16的熱穩(wěn)定性結(jié)果示意圖； 圖5為本發(fā)明中pH對(duì)誘導(dǎo)表達(dá)的低溫脂肪酶Lip-PF16穩(wěn)定性的影響結(jié)果示意圖； 圖6為本發(fā)明中轉(zhuǎn)化菌株在橄欖油培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈結(jié)果示意圖；圖中a為4°C水 解結(jié)果；b為15°C水解結(jié)果；c為25°C水解結(jié)果；d為37°C水解結(jié)果。
【具體實(shí)施方式】
[0018] 下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說明，但本發(fā)明的內(nèi)容并不局限于此，本 實(shí)施例中方法如無特殊說明的均按常規(guī)方法操作，所用試劑如無特殊說明的采用常規(guī)試劑 或按常規(guī)方法配置的試劑。
[0019] 實(shí)施例1 :假單胞菌sp. ) PF16的分離及鑒定 1. 1樣品采集及培養(yǎng)基 樣品米集于云南省昆明理工大學(xué)生物工程技術(shù)研究中心的4°C冷庫的水樣，菌株分離 的普通培養(yǎng)基為LB液體培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10, pH7. 0 ;LB固體培 養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10,瓊脂20, pH7. 0 ;篩選脂肪酶的含橄欖油的LB 選擇性培養(yǎng)基（g/L):胰蛋白胨10,酵母粉5, NaCl 10,橄欖油乳化液8% (體積比)，瓊脂粉 20, pH 7. 2 ;以上培養(yǎng)基均在121°C下高壓滅菌20min。
[0020] I. 2 PF16菌株的分離及鑒定 將采集到的水樣用無菌水稀釋100倍，配成菌懸液，吸取50 μ L涂布于LB平板上，15°C 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)72h ;用接種針挑取適量形態(tài)、顏色各不相同的菌落，在固體LB培養(yǎng)基平板 上繼續(xù)劃線培養(yǎng)，直至產(chǎn)生單菌落；將產(chǎn)生的單菌落接種到篩選脂肪酶的菌株的含橄欖油 的LB選擇性培養(yǎng)基上培養(yǎng)。產(chǎn)脂肪酶的菌株會(huì)在培養(yǎng)基上產(chǎn)生水解圈，根據(jù)水解圈直徑R 1 與菌落直徑R2的比值大小并結(jié)合菌落形態(tài)進(jìn)行篩選，初步確定比值大于2的PF16菌株為 篩選到的高產(chǎn)脂肪酶菌株。
[0021] 所得菌株序列提交GenBank進(jìn)行序列同源性檢索分析，并選取同源性高的菌株利 用ClustX和Mega軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹：與菌株Aewt/offioftas sp. Nj-55序列相似性最高， 為99%。結(jié)合形態(tài)特征分析結(jié)果，初步鑒定菌株P(guān)F16屬于假單胞菌屬，命名為Aewt/offioftas sp. PF16〇
[0022] 對(duì)sp. PF16菌落特征進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀察，與菌株sp. Nj-55菌株比較的結(jié)果見表1，并用杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化反 應(yīng)管對(duì)其進(jìn)行生理生化特性檢測，與sp. Nj-55菌株比較的結(jié)果見表2。
[0023] 表 I 饑sp. PF16 和饑sp. Nj-55 菌株的生物學(xué)特征比較 結(jié)果
【權(quán)利要求】
1. 一株假單胞菌sp. )PF16,其在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通 微生物中心的保藏編號(hào)為：CGMCC No. 9362。
2. 由權(quán)利要求1所述的假單胞菌產(chǎn)生的低溫脂肪酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所 /_J、i 〇
3. 編碼權(quán)利要求2所述低溫脂肪酶的基因，其特征在于：核苷酸序列如SEQ ID NO :1 所示。
【文檔編號(hào)】C12R1/38GK104403961SQ201410595733
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】季秀玲, 張傳建, 魏云林, 王毅, 馬永凱, 蘇楊, 林連兵, 張琦 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)