一種pcr反應液及試劑盒和pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種PCR反應液及試劑盒和PCR方法。所述PCR反應液，包括如下原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10×PCR buffer，溴酚藍溶液，溶質(zhì)體積百分數(shù)為30％的甘油溶液和rTaq酶。本發(fā)明優(yōu)化了PCR實驗的PCR反應液，特別是加入一定比例的甘油溶液，并加入BSA與DMSO的組合，保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活性，并減少引物二聚體的形成，減少PCR反應液配置時間，在瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物時，只需加入核酸染料即可檢測，可以大量節(jié)省PCR產(chǎn)品檢測時間，提高PCR的擴增效率。
【專利說明】-種PCR反應液及試劑盒和PCR方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術領域】，具體涉及一種PCR反應液及試劑盒和PCR方法。
【背景技術】
[0002] 聚合酶鏈式反應（Polymerasechainreaction，PCR)是一種體外快速擴增特定 DNA片段的技術，它是現(xiàn)代分子生物學最重要的手段之一。其基本原理是根據(jù)獲諾貝爾 1953年生理學獎的DNA雙螺旋模型所建立的體細胞復制的機制以及雙鏈DNA在體外可隨溫 度變化發(fā)生變性與復性的特點設計。1985年Randll.K.Skaii等利用KlenowDNA聚合酶建 立了聚合酶鏈式反應技術，并將其應用于鐮刀形貧血病的基因診斷。它是80年代分子生物 學領域的一項革命性突破，被譽為分子生物學資源發(fā)展史上的又一里程碑。此項技術一經(jīng) 問世就因其操作簡單、快速、靈敏度高和特異性強等優(yōu)點迅速在與分子生物學相關的學科 得到廣泛應用，如分子生物學研究、醫(yī)學檢驗、動植物檢驗、法醫(yī)鑒定及考古等各個領域。
[0003] 在PCR過程中，DNA聚合酶起著關鍵性作用。目前已有100多個DNA聚合酶的相 關基因被克隆和測序，Thermusaquaticus是一種水生嗜熱菌，從該菌中分離出的DNA聚合 酶（TaqDNA聚合酶）具有催化以DNA為模板合成DNA的功能。
[0004] TaqNDA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對Mg2+濃度非常敏感。研究表 明，Mg2+濃度低于ImM，dNTP過多，鰲合Mg2+作用強時，Mg2+對TaqDNA聚合酶的催化作用幾 乎喪失，不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。隨著Mg2+濃度的增加，其催化作用增強，擴增產(chǎn)物增多，但產(chǎn)物濃 度增大的同時，背景也明顯增強。
[0005] 常規(guī)的PCR擴增體系配置，往往是將DNTP、Buffer、rTaq酶等試劑單獨保存，待要 進行PCR擴增時，將樣品分別加到同一PCR管中，在操作過程中除了經(jīng)常忘記加入個別試劑 的缺點外，多次的取用會對試劑造成污染，影響后續(xù)使用。因此，急需研發(fā)一種PCR擴增體 系對于減少PCR擴增體系配置時間以及提高PCR體系配置的準確性和減少PCR擴增過程中 的污染。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明所要解決的技術問題是：提供一種減少PCR反應液配置時間的含有溴酚藍 指示劑的PCR反應液的配置方法。
[0007] 為了解決上述技術問題，本發(fā)明采用的技術方案為：提供一種PCR反應液，包括如 下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10XPCRbuffer，溴酚藍溶液，溶質(zhì)體積 百分數(shù)為30%的甘油溶液和rTaq酶。
[0008] 本發(fā)明的另一技術方案為提供一種PCR試劑盒，其包含上述的PCR反應液。
[0009] 本發(fā)明的又一技術方案為提供一種PCR方法，包含使用上述的PCR反應液的步驟。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明優(yōu)化了PCR實驗的PCR反應液，特別是加入一定比 例的甘油溶液，以保證rTaq酶的活性，加入BSA與DMS0的組合保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活 性，并減少引物二聚體的形成，減少PCR反應液配置時間，在瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物 時，只需加入核酸染料即可檢測，與常規(guī)的PCR檢測相比，使用本發(fā)明PCR反應液無需再加 入溴酚藍指示劑，可以大量節(jié)省PCR產(chǎn)品檢測時間，提高PCR的擴增效率，適用于大批量PCR 產(chǎn)品的檢測。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明【具體實施方式】中的轉(zhuǎn)基因水稻GUS基因結(jié)果檢測圖；
[0012] 其中泳道1，2是常規(guī)PCR方法配置的PCR檢測結(jié)果，泳道3、4是含有溴酚藍指示 劑的PCR反應液的PCR檢測結(jié)果，泳道5是DNAmarker。
【具體實施方式】
[0013] 為詳細說明本發(fā)明的技術內(nèi)容、所實現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實施方式并配合附 圖予以說明。
[0014] 本發(fā)明最關鍵的構思在于：本發(fā)明在PCR反應液中加入甘油、BSA與DMS0有保證 Tag酶的穩(wěn)定性及活性，制備出可以直接使用的PCR混合液提高PCR的擴增效率。
[0015] 實施例1
[0016] -種PCR反應液，包括如下原料制備而成：6_8li 1二甲亞砜，6_8li 1質(zhì)量體積百分 數(shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液，9-lliil lOmMDNTP溶液，18-22iil 10XPCRbuffer，2-4iil 溴酚藍溶液，45-55 ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30%甘油溶液和4-6 ill rTaq酶。
[0017] 傳統(tǒng)配制PCR反應液時，將DNTP、Buffer、rTaq酶等試劑進行混合，制備出可以直 接使用的PCR混合液，將PCR混合液放于-20°C保存，rTaq酶的活性會下降。因此，本發(fā)明 在混合液中加入一定比例的甘油溶液和BSA與DMS0的組合保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活性， 并減少引物二聚體的形成。
[0018] 一種PCR反應液，所述反應液由如下組分混合而成：6ii1二甲亞砜，1質(zhì)量體積 百分數(shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液,9iillOmMDNTP溶液，18iil10XPCRbuffer，2iil溴 酚藍溶液，45ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30%甘油溶液和4illrTaq酶。
[0019] 一種PCR反應液，所述反應液由如下組分混合而成：8ii1二甲亞砜，1質(zhì)量體積 百分數(shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液，111111011110見13溶液，2211110\?〇?131^€61'，4111溴 酚藍溶液，55ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30%甘油溶液和6illrTaq酶。
[0020] 實施例2
[0021] -種PCR反應液，所述反應液包括7. 5 ii 1二甲亞砜，7. 5 ii 1質(zhì)量體積百分數(shù)為 0.1%牛血清蛋白溶液lOiil lOmMDNTP溶液，20iil 10XPCRbuffer，5iil溴酚藍溶液， 47 ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30%甘油溶液和5 ill rTaq酶。將配置好的溶液混勻后離心，存 放于-20°C冰箱中。
[0022] 進一步的，上述的PCR反應液中，所述10XPCR buffer包含50-150mM的PH為8.3 的Tris-Hcl，250-750mM Kcl和5-20mM Mgcl2。
[0023] 進一步的，上述的PCR反應液中，所述溴酚藍溶液包含體積百分數(shù)為30 %的甘油 和質(zhì)量體積百分數(shù)為〇. 05%溴酚藍粉末。
[0024] -種PCR試劑盒，其特征在于，其包含上述任一項的PCR反應液。
[0025] 上述PCR反應液的使用：從冰箱中取出2XPCR反應液，配置PCR體系，20iU的 ?〇?體系配置如下：2父？〇?反應液10111，引物1?1111，引物？1111，轉(zhuǎn)基因水稻基因組模 板1Ul，滅菌水7ill。進行PCR后，PCR程序如下；
[0026]
【權利要求】
1. 一種PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白， DNTP，10XPCRbuffer，溴酚藍溶液，溶質(zhì)體積百分數(shù)為30%的甘油溶液和rTaq酶。
2. 根據(jù)權利要求1所述的PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：6-8 yl 二甲亞砜，6-8iil質(zhì)量體積百分數(shù)為0. 1%的牛血清蛋白溶液，9-lliillOmM DNTP溶液， 18-22 ill 10 XPCR buffer，2-4 ill溴酚藍溶液，45-55 ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30 %甘油溶 液和 4-6 u 1 rTaq 酶。
3. 根據(jù)權利要求1所述的PCR反應液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：7. 5 yl 二甲亞砜，7. 5iil質(zhì)量體積百分數(shù)為0. 1%牛血清蛋白溶液lOiil 10mM DNTP溶液，20iil 10 X PCR buffer，5 ill溴酚藍溶液，47 ill溶質(zhì)體積百分數(shù)為30 %甘油溶液和5 ill rTaq 酶。
4. 根據(jù)權利要求1所述的PCR反應液，其特征在于，所述10XPCR buffer包含 50-150mM 的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl，250-750mM Kcl 和 5-20mM Mgcl2。
5. 根據(jù)權利要求1所述的PCR反應液，其特征在于，所述溴酚藍溶液包含體積百分數(shù)為 30%的甘油和質(zhì)量體積百分數(shù)為0. 05%溴酚藍粉末。
6. -種PCR試劑盒，其特征在于，其包含權利要求1-5任一項所述的PCR反應液。
7. -種PCR方法，其特征在于，包含使用權利要求1-5任一項所述的PCR反應液的步 驟。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328170SQ201410581850
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請人:福建師范大學