一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量pcr檢測(cè)方法

一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量pcr檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，本發(fā)明方法步驟包括魚源無乳鏈球菌DNA的提取、引物設(shè)計(jì)、標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板的制備、熒光定量PCR退火溫度的優(yōu)化、繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、敏感性和特異性檢測(cè)。本發(fā)明可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測(cè)出水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染無乳鏈球菌，靈敏度可達(dá)8.6細(xì)菌基因組拷貝/μL，對(duì)魚類無乳鏈球菌病的預(yù)防有重大意義。
【專利說明】-種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于細(xì)菌檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢 測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae)，也稱B族鏈球菌，是兼性的革蘭氏陽 性球菌，是一種重要的人、獸及魚共患病致病菌。魚源無乳鏈球菌可引起魚類敗血癥和腦膜 炎，具有較高的致病率和致死率?，F(xiàn)有的魚源無乳鏈球菌的檢測(cè)方法主要有常規(guī)的細(xì)菌分 離培養(yǎng)鑒定法、普通PCR檢測(cè)法、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP)檢測(cè)法等。細(xì)菌分離培養(yǎng)方 法存在耗時(shí)和受樣品污染等諸多因素的影響；普通PCR既無法對(duì)病原定量，又需要凝膠電 泳，容易對(duì)環(huán)境造成污染；LAMP法雖然靈敏性高，但不能對(duì)病原進(jìn)行定量；而熒光定量PCR 技術(shù)通過在PCR反應(yīng)體系中加入可嵌入雙鏈DNA的熒光燃料，利用相應(yīng)軟件實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè) PCR進(jìn)程中的熒光信號(hào)積累情況，對(duì)未知模板可進(jìn)行定性和定量分析，該方法可實(shí)時(shí)檢測(cè)、 速度快、高通量、定量準(zhǔn)確、靈敏度高、特異性好、自動(dòng)化程度高，在病原微生物檢測(cè)方面已 得到廣泛應(yīng)用，目前，尚無熒光定量PCR方法用于檢測(cè)魚源無乳鏈球菌的相關(guān)報(bào)道。近年 來，魚類無乳鏈球菌病大面積爆發(fā)流行，該病缺乏有效的治療方法，防止無乳鏈球菌的傳染 和流行是當(dāng)前采取的主要措施，早期快速檢測(cè)該病原是減少損失的有效途徑，熒光定量PCR 技術(shù)應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物無乳鏈球菌的檢測(cè)，對(duì)于疾病的預(yù)防意義重大。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為解決【背景技術(shù)】中的檢測(cè)臨床樣品中魚源無乳鏈球菌的問題，本發(fā)明提供一種魚 源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，該方法可以靈敏、快速、定量、特異性的檢測(cè)出水 產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物感染無乳鏈球菌，為防止魚源無乳鏈球菌的傳染和流行提供技術(shù)支持。
[0004] 本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案為：
[0005] (1)取患病魚的組織50?lOOmg，稱重后，放入組織勻漿器中研磨，加入1000 μ L TE緩沖液，制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L，加入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶， 30°C孵育IOmin ;后續(xù)的提取步驟按照細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行，即得到高純度細(xì) 菌基因組DNA，保存于-20°C備用。
[0006] (2)根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特 異性引物，序列如下：
[0007] 上游引物151?-8:5'66六六六0^60^1'11^〇61'(：1'-3'；
[0008] 下游引物 ISR-a:5' AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
[0009] (3)使用上述特異性引物擴(kuò)增出大小為190bp的片段；通過連接、轉(zhuǎn)化將該片段插 入pMD? 18-T載體；最后對(duì)pMD? 18-T重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。
[0010] (4)提取經(jīng)過測(cè)序鑒定正確的重組質(zhì)粒，應(yīng)用Thermo NanoDrop 2000進(jìn)行質(zhì)粒濃 度檢測(cè)，計(jì)算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋法稀釋成6. 04X IO8?6. 04X IO1 拷貝/ μ L的8個(gè)濃度梯度，將其作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板。
[0011] (5)將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，構(gòu)建反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增曲線 和標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0012] (6)將已經(jīng)計(jì)算出拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取6. 04Χ IO4? 6. 04X KT1拷貝/ μ L的6個(gè)濃度梯度，進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，以此確定熒光定量PCR所 能檢測(cè)的最低模板拷貝數(shù)，驗(yàn)證本發(fā)明方法的靈敏性。
[0013] (7)分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、 螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康 斑點(diǎn)叉尾鮰的DNA，以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證本發(fā)明方法的特 異性。
[0014] 其中本發(fā)明所述步驟5-7中，所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體積 20 μ L，其中 SYBR Green I PCR Master Mix 預(yù)混液（2X) 10 μ L、10y M 上、下游引物各 〇. 5 μ L、模板DNA I. 0 μ L、無菌水8. 0 μ L ;反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94°C，lmin，1個(gè)循環(huán)；隨后 進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?4°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec，同時(shí)設(shè)溶解曲線 反應(yīng)參數(shù)為 94,15sec，60°C，30sec，94,15sec。
[0015] 其中本發(fā)明中Ct值與質(zhì)?？截悢?shù)的對(duì)數(shù)之間表現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2 =0· 990,截距為36. 28,斜率為-3. 195,擴(kuò)增效率E = 106. 0%，從而可以算出拷貝數(shù)X與Ct 值之間的線性關(guān)系方程式：Ct =-3. 1951ogX+36. 28,而待測(cè)樣品的Ct值可以從實(shí)驗(yàn)結(jié)果中 直接讀??；把待測(cè)樣品的Ct值代入方程式就可以算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)（X)。由 于無乳鏈球菌的基因組內(nèi)含有7個(gè)拷貝的ISR序列，則樣品中的無乳鏈球菌基因組拷貝數(shù) =X/7。
[0016] 其中在反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析，擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解溫度為90. 8-91. 2°C，無非 特異性產(chǎn)物和引物二聚體的峰值出血標(biāo)準(zhǔn)品均一穩(wěn)定。
[0017] 其中分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿 菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健 康斑點(diǎn)叉尾鮰的DNA，以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。無乳鏈球菌感染 的羅非魚DNA模板出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，而其他樣品均未出現(xiàn)相應(yīng)的擴(kuò)增曲線，同時(shí)將擴(kuò) 增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果與上述一致，表明該方法具有較好的特異性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 圖1不同退火溫度下的擴(kuò)增結(jié)果，圖上部分顯示不同退火溫度所對(duì)應(yīng)Ct值，圖下 部分為不同退火溫度下產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。
[0019] 圖2不同稀釋濃度的陽性質(zhì)粒為模板的熒光定量PCR擴(kuò)增曲線。從左到右各條 曲線代表 6· 04X 1086· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04X IO1質(zhì)粒拷貝數(shù)/ μ L擴(kuò)增曲線。
[0020] 圖3熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線結(jié)果，回歸方程Ct = -3. 1951ogX+36.28,相關(guān)系數(shù)R2 =0· 990,擴(kuò)增效率 E = 106. 0%。
[0021] 圖4擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析，溶解溫度在90. 8-91. 2°C之間。
[0022] 圖5熒光定量PCR特異性檢測(cè)。以不同樣品的DNA模板，按照構(gòu)建的熒光定量PCR 方法進(jìn)行擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。泳道M，DL2000marker ;泳道1，無乳鏈 球菌感染的羅非魚DNA ;泳道2,海豚鏈球菌DNA ;泳道3,金黃色葡萄球菌DNA ;泳道4,海分 枝桿菌DNA ;泳道5,螄魚諾卡氏菌DNA ;泳道6,遲緩愛德華氏菌DNA ;泳道7,哈維弧菌DNA ; 泳道8,美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種DNA ;泳道9,斑點(diǎn)叉尾鮰DNA ;泳道10,羅非魚DNA ;泳道 11，人DNA標(biāo)準(zhǔn)品。
[0023] 圖6熒光定量PCR方法檢測(cè)感染無乳鏈球菌的羅非魚樣品。橫坐標(biāo)代表用于感染 羅非魚的不同無乳鏈球菌菌株；縱坐標(biāo)代表攻毒14天后，羅非魚腦組織內(nèi)的無乳鏈球菌基 因組DNA載量。

【具體實(shí)施方式】
[0024] 以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0025] 實(shí)施例一熒光定量PCR檢測(cè)無乳鏈球菌方法的建立
[0026] 1.樣品基因組DNA提取
[0027] (1)魚（包括魚體內(nèi)細(xì)菌）基因組DNA提?。喝◆~的組織50?lOOmg，稱重后，放入 組織織勻漿器中研磨，加入1000 μ LTE緩沖液，制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L，加 入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin ;后續(xù)的提取步驟按照OMEGABacterial DNAKit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行，即得到高純度的魚（魚包括體內(nèi)細(xì)菌）基因組 DNA，保存于-20°C備用。其中OMEGA Bacterial DNA Kit試劑盒（OMEGA公司）購于廣州飛 揚(yáng)生物工程有限公司。
[0028] (2)細(xì)菌基因組DNA提?。悍謩e培養(yǎng)無乳鏈球菌、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、 海分枝桿菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌和美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種，按照 OMEGA Bacterial DNA Kit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行，得到高純度的細(xì)菌基因組 DNA，保存于-20°C備用。
[0029] 2.引物設(shè)計(jì)與合成
[0030] 根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列（ISR)，通過 Primer Premier 6.0軟件設(shè)計(jì)的，并按照本領(lǐng)域常規(guī)方法合成。引物序列如下：
[0031] 上游引物151?-8:5'-66六六六0^60^1'11^〇61'(：1'-3'；
[0032] 下游引物 ISR-a:5' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3'。
[0033] 其中ISR-s/a預(yù)期片段為190bp。
[0034] 3.標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備：
[0035] 以上述提取的無乳鏈球菌基因組DNA為模板，使用上述設(shè)計(jì)的特異性引物擴(kuò)增出 大小為190bp的片段；通過連接、轉(zhuǎn)化將該片段插入pMD? 18-T載體；最后對(duì)pMD? 18-T重 組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定，命名為pMD? 18-T-ISR。
[0036] 陽性質(zhì)粒（pMD? 18-T-ISR)，交上海生工生物工程公司測(cè)序鑒定。用細(xì)菌質(zhì)粒 DNA小提試劑盒提取質(zhì)粒DNA，用Thermo NanoDrop 2000檢測(cè)質(zhì)粒濃度，此質(zhì)粒溶液即為本 發(fā)明的標(biāo)準(zhǔn)品模板。
[0037] 根據(jù)阿伏加德羅常數(shù)、堿基的平均分子量、重組質(zhì)粒的長度及濃度計(jì)算單位體積 質(zhì)粒溶液內(nèi)的拷貝數(shù)。其計(jì)算公式如下：每μ L質(zhì)粒溶液的拷貝數(shù)=[質(zhì)粒濃度（g/μ L) X 阿伏伽德羅常數(shù)]/[重組質(zhì)粒分子量Χ660]。
[0038] 經(jīng)計(jì)算得pMD? 18-T-ISR濃度為6. 04X 101°拷貝/ μ L，將質(zhì)粒稀釋成： 6. 04X 108、6. 04X 107、6. 04X 106、6. 04X 105、6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X IO1 拷貝/ μ L的濃度，于-20°c保存?zhèn)溆谩?br> [0039] 4.熒光定量PCR反應(yīng)條件及其優(yōu)化
[0040] 反應(yīng)體系（20 μ L)為：SYBR Green I PCR Master Mix 預(yù)混液（2 X) 10 μ UlOyM 上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、無菌水8.0 μ L。本申請(qǐng)實(shí)施例中實(shí)際使用SYBR Green I PCR Master Mix預(yù)混液（2X) (Τ0Υ0Β0公司）購自廣州美津生物技術(shù)有限公司； 所使用引物為上述設(shè)計(jì)的特異性引物。
[0041] 退火條件優(yōu)化：預(yù)變性94°C，lmin，1個(gè)循環(huán)；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?4°C， 30sec，退火55. 0?64. 9°C，20sec，延伸72°C，20sec，同時(shí)設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94， 15sec，60 °C，30sec，94,15sec。本申請(qǐng)實(shí)施例中實(shí)際使用 Eppendorf 公司的 Eppendorf Mastercycler ep realplex型突光定量PCR儀記錄結(jié)果。
[0042] 最佳退火溫度的確定：以實(shí)施例1中提取的無乳鏈球菌DNA為模板，按照上述反 應(yīng)體系和反應(yīng)條件，比較不同退火溫度下的擴(kuò)增產(chǎn)物所對(duì)應(yīng)Ct值，結(jié)合瓊脂糖凝膠電泳結(jié) 果，確定熒光定量PCR的最佳退火溫度。反應(yīng)的最佳退火溫度為60. 4°C (如附圖1)。
[0043] 5.方法學(xué)評(píng)價(jià)
[0044] (1)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作·
[0045] 將上述已定量的標(biāo)準(zhǔn)品（重組質(zhì)粒）以10倍的倍比關(guān)系作一系列稀釋，以 不同稀釋濃度的標(biāo)準(zhǔn)品作為模板，分別取LOyL按照上面的反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn) 行熒光定量PCR，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線（如附圖2)。熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程Ct =-3. 1951ogX+36.28,相關(guān)系數(shù)R2 = 0.990,擴(kuò)增效率E = 106.0%，用陽性質(zhì)粒所作 的標(biāo)準(zhǔn)曲線的Ct值與初始濃度有較好的線性關(guān)系（如附圖3)，標(biāo)準(zhǔn)品的溶解溫度都在 90. 8-91. 2°C之間（如附圖4)。
[0046] (2)靈敏度測(cè)試
[0047] 將已定量的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行 10 倍稀釋為 6. 04X 104、6. 04X 103、6. 04X 102、6. 04X 101、 6. 04X 10°、6. 04X KT1拷貝/ μ L，用建立的熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)，以此確定檢測(cè)的靈 敏度。結(jié)果顯示，當(dāng)重組質(zhì)粒濃度為60. 4拷貝/ μ L，即8. 6無乳鏈球菌基因組拷貝/ μ L 時(shí)，仍能夠獲得擴(kuò)增曲線和特異的溶解曲線。
[0048] (3)特異性驗(yàn)證
[0049] 為了 了解該方法的特異性，選用無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡 萄球菌、海分枝桿菌、螄魚諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞 種、健康羅非魚和健康斑點(diǎn)叉尾鮰的DNA，以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò) 增。在所檢測(cè)的樣品中，僅無乳鏈球菌感染的羅非魚DNA樣品結(jié)果為陽性，而其他樣品的檢 測(cè)結(jié)果均為陰性。同時(shí)將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，結(jié)果與上述一致（如附圖5)。 表明建立的熒光定量PCR方法不會(huì)受這些水產(chǎn)動(dòng)物病原菌的及宿主的干擾，也不會(huì)受操作 過程中人的DNA的干擾。
[0050] (4)熒光定量PCR穩(wěn)定性和重復(fù)性測(cè)試
[0051] 在評(píng)價(jià)熒光定量PCR檢測(cè)無乳鏈球菌方法的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，用陽性樣品和陰性 樣品，按照上述反應(yīng)體系和反應(yīng)條件，反復(fù)進(jìn)行熒光定量PCR檢測(cè)，每次試驗(yàn)的每個(gè)樣品做 8個(gè)平行反應(yīng)管，重復(fù)6次，結(jié)果表明所建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法具有很好的穩(wěn)定性和 重復(fù)性。
[0052] (5)樣品中的無乳鏈球菌定量
[0053] 待測(cè)樣品的Ct值可以在熒光定量PCR儀中直接讀取，把待測(cè)樣品的Ct值代入到 標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式可以算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)（X)。由于無乳鏈球菌的基因組 內(nèi)含有7個(gè)拷貝的ISR序列，則最終樣品中的無乳鏈球菌拷貝數(shù)=X/7。
[0054] 實(shí)施例二用本發(fā)明建立的熒光定量PCR方法檢測(cè)樣品
[0055] 選取10株不同毒力的無乳鏈球菌感染羅非魚，攻毒后第14天采集樣品。
[0056] 1.分離培養(yǎng)法
[0057] 將樣品接種于血瓊脂平板上，置28°C培養(yǎng)24_48h，觀察菌落，如見形成灰白色、表 面光滑、有乳光、圓形、β溶血的菌落，則進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢，發(fā)現(xiàn)單個(gè)、成雙、鏈狀排列、 長短不一，呈紫色的球菌。
[0058] 2.熒光定量PCR法
[0059] (1)樣品DNA提取
[0060] 將樣品稱重后，放入組織織勻漿器中研磨，加入1000 μ LTE緩沖液，制成組織勻漿 液。取組織勻漿液180 μ L，加入20 μ L濃度為50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin ;后續(xù)的 提取步驟按照OMEGA Bacterial DNA Kit細(xì)菌DNA提取試劑盒法的方法進(jìn)行，即得到高純 度的魚（魚包括體內(nèi)細(xì)菌）基因組DNA。
[0061] (2)熒光定量PCR反應(yīng)
[0062] 將一系列不同稀釋濃度的重組質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品和提取的樣品DNA作為模板，進(jìn)行熒光 定量PCR檢測(cè)，同時(shí)設(shè)陰性對(duì)照。反應(yīng)體系（20 μ L)為：SYBR Green I PCR Master Mix預(yù) 混液（2X) IOyLUO μ M上、下游引物各0.5 μ L、模板DNA 1.0 μ L、無菌水8.0 μ L。放入 Eppendorf Mastercycler ep realplex 型突光定量 PCR 儀。反應(yīng)條件：預(yù)變性 94°C，lmin， 1個(gè)循環(huán)；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，程序?yàn)?4°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec， 同時(shí)設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94,15sec，60°C，30sec，94,15sec。反應(yīng)結(jié)束后利用熒光定量 PCR軟件分析。
[0063] (3)結(jié)果計(jì)算
[0064] 各擴(kuò)增曲線與閾值線的交叉點(diǎn)對(duì)應(yīng)的橫坐標(biāo)即為Ct值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線上濃度與 Ct值的對(duì)應(yīng)關(guān)系，可求出各待測(cè)樣品中無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)（X)，則最終樣品中的無 乳鏈球菌拷貝數(shù)=X/7。
[0065] (4)數(shù)據(jù)分析
[0066] 采樣EXCLE軟件包，培養(yǎng)法和所建立的熒光定量PCR方法對(duì)樣品檢測(cè)結(jié)果陽性率 的比較采樣X2檢驗(yàn)。
[0067] 應(yīng)用所建立的熒光定量PCR方法和培養(yǎng)法對(duì)人工感染無乳鏈球菌的羅非魚30個(gè) 樣品進(jìn)行檢測(cè)，經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，這兩種方法有顯著性差異（P < 0. 05)。熒光定量PCR陽性 檢出率（100% )明顯高于培養(yǎng)法（76. 7% )。此外，熒光定量PCR還可對(duì)樣品中無乳鏈球菌 進(jìn)行定量分析（圖5)，判定無乳鏈球菌在魚體內(nèi)的定植情況。
[0068] 綜上所述，本發(fā)明的有益效果是：基于重組質(zhì)粒pMD? 18-T-ISR所建立的魚源無 乳鏈球菌實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)方法具有檢測(cè)速度快（2個(gè)小時(shí)左右）、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果可靠等特 點(diǎn)，該方法具有較好的敏感性和特異性，不僅可提高檢出率，還能定量出患病魚的無乳鏈球 菌的DNA載量，與傳統(tǒng)方法相比，明顯優(yōu)于培養(yǎng)法。
【權(quán)利要求】
1. 一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于其檢測(cè)方法的具體步驟 如下： (1) 提取魚組織內(nèi)的無乳鏈球菌DNA，制備檢測(cè)液。 (2) 引物設(shè)計(jì)：根據(jù)GenBank中的魚源無乳鏈球菌16S-23S rRNA基因間區(qū)序列，通過 Primer Premier6. O軟件設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，序列如下： 上游引物 I SR-s : 5，-GGAAACCTGCCATTTGCGTCT-3，； 下游引物 I SR-a : 5 ' -AATCTATTTCTAGATCGTGGAAT-3 '。 (3) 標(biāo)準(zhǔn)品模板的制備：使用上述特異性引物擴(kuò)增出大小為190bp的片段；通過連接、 轉(zhuǎn)化將該片段插入pMD?18-T載體；最后對(duì)pMD?18-T重組質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。提取經(jīng)過 測(cè)序鑒定重組質(zhì)粒，進(jìn)行質(zhì)粒濃度檢測(cè)，計(jì)算出重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)，將質(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋 法稀釋成 6· 04X 108、6· 04X 107、6· 04X 106、6· 04X 105、6· 04X 104、6· 04X 103、6· 04X 102、 6. 04Χ IO1拷貝/ μ L的8個(gè)濃度梯度，將其作為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板，其中單位體積質(zhì)粒溶液內(nèi) 的拷貝數(shù)計(jì)算公式如下：每μ L質(zhì)粒溶液的拷貝數(shù)=[質(zhì)粒濃度（g/μ L)X阿伏伽德羅常 數(shù)]/[重組質(zhì)粒分子量Χ660]。 (4) 標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：將標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒作為模板，構(gòu)建反應(yīng)體系，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，獲得 擴(kuò)增曲線和標(biāo)準(zhǔn)曲線。 (5) 將已經(jīng)計(jì)算出拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度稀釋，選取6. 04Χ 104、6. 04Χ 103、 6. 04X 102、6. (MXlO1J. 04Χ10°、6. 04ΧΚΓ1拷貝/ μ L的6個(gè)濃度梯度，進(jìn)行熒光定量PCR 檢測(cè)，以此確定熒光定量PCR所能檢測(cè)的最低重組質(zhì)?？截悢?shù)，驗(yàn)證本發(fā)明方法的敏感性。 (6) 分別以無乳鏈球菌感染的羅非魚、海豚鏈球菌、金黃色葡萄球菌、海分枝桿菌、螄魚 諾卡氏菌、遲緩愛德華氏菌、哈維弧菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、健康羅非魚和健康斑點(diǎn) 叉尾鮰的DNA，以及人DNA標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證本發(fā)明方法的特異 性。 (7) 樣品中的無乳鏈球菌定量計(jì)算方法：在熒光定量PCR儀中直接讀取待測(cè)樣品的Ct 值，將Ct值代入到標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程式，計(jì)算出無乳鏈球菌ISR的單拷貝數(shù)（X)。由于無乳 鏈球菌的基因組內(nèi)含有7個(gè)拷貝的ISR序列，則最終樣品中的無乳鏈球菌拷貝數(shù)=Χ/7。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在于 魚組織內(nèi)無乳鏈球菌DNA的提取方法為：取病魚的組織50?lOOmg，稱重后，放入組織織勻 漿器中研磨，加入1000 μ L TE緩沖液，制成組織勻漿液。取組織勻漿液180 μ L，加入20 μ L 濃度為50mg/mL的溶菌酶，30°C孵育IOmin后續(xù)的提取步驟按照常規(guī)試劑盒的提取方法進(jìn) 行，即得到高純度的含細(xì)菌和魚基因組DNA，保存于-20°C備用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種魚源無乳鏈球菌的熒光定量PCR檢測(cè)方法，其特征在 于步驟4-6中所述的熒光定量PCR反應(yīng)體系如下：總反應(yīng)體積20 μ L，其中SYBR Green I PCR Master Mix預(yù)混液（2X) 10 μ LUOyM上、下游引物各0.5 μ L、模板DNALO μ L、無菌 水8. 0 μ L ;熒光定量PCR反應(yīng)程序?yàn)椋侯A(yù)變性94°C，lmin，1個(gè)循環(huán)；隨后進(jìn)行40個(gè)循環(huán)， 程序?yàn)?4°C，30sec，退火60. 4°C，20sec，延伸72°C，20sec，同時(shí)設(shè)溶解曲線反應(yīng)參數(shù)為94， 15sec,60°C,30sec,94,15sec〇
【文檔編號(hào)】C12Q1/06GK104263842SQ201410553158
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月5日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月5日
【發(fā)明者】李安興, 蘇友祿 申請(qǐng)人:中山大學(xué)