一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基，表明了一套測定純小麥栽培料培養(yǎng)過程中的總?cè)?、多糖和三萜酸的方法與步驟，通過該方法測定的固體栽培料在培養(yǎng)到25天是三萜酸達(dá)到最大。目前在靈芝在液體發(fā)酵過程中胞外三萜酸可以達(dá)到200mg/L，茯苓僅僅達(dá)到50mg/L，而通過本發(fā)明純小麥培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵，胞外三萜酸高達(dá)130mg/L，是液體發(fā)酵胞外三萜酸濃度的2倍以上。目前已有利用純小麥培養(yǎng)茯苓作為酸奶添加劑。但通過純小麥培養(yǎng)，測定其中三萜酸含量的變化以及最高積累量仍未見報道。
【專利說明】一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物發(fā)酵工程領(lǐng)域，具體的說涉及一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基及其制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]茯苓為多孔菌科真菌茯苓的干燥菌核，多寄生于馬尾松或赤松的根部。在我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中，茯苓的藥用已有二千多年的歷史，其性味甘平，歸心、肺、脾經(jīng)，能滲濕利水、健脾安神，被譽為中藥四君八珍之一，是多種方劑配伍的要藥及中成藥的重要原料。茯苓因其藥用部位不同，而有不同的名稱和功用。
[0003]經(jīng)國內(nèi)外專家對茯苓化學(xué)成分的深入研究，茯苓的主要成分為三萜系化合物(茯苓素)和茯苓聚糖，另外還含有一些氨基酸、蛋白質(zhì)、脂肪等。其所含有的大量三萜類物質(zhì)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤和抗炎等作用，茯苓是醫(yī)家常用藥物，茯苓藥性緩和，能益心脾、利水濕、補(bǔ)而不峻、利而不濕，既能扶正又能祛邪，在我國醫(yī)藥寶庫中占有非常重要的地位。其中茯苓多糖和三萜為其主要活性成分，國內(nèi)外在茯苓多糖、三萜等成份及其藥理作用、生物活性方面作了較多的研究，并且有了較大的進(jìn)展。三萜酸具有減肥、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗肝損傷、抗菌消炎和抗病毒等多種生物學(xué)活性，開發(fā)前景廣闊。因此，開發(fā)研究茯苓三萜酸提取物具有重要的意義。
[0004]目前在靈芝在液體發(fā)酵過程中胞外三萜酸可以達(dá)到200mg/L，茯苓僅僅達(dá)到50mg/L，而通過該純小麥培養(yǎng)基進(jìn)行固體發(fā)酵，胞外三萜酸高達(dá)130mg/L。是液體發(fā)酵胞外三萜酸濃度的2倍以上。目前已有利用純小麥培養(yǎng)茯苓作為酸奶添加劑。但通過純小麥培養(yǎng)，測定其中三萜酸含量的變化以及最高積累量仍未見報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明主要是提供一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基及其測定方法，該方法在培養(yǎng)至25-30天時三萜酸濃度達(dá)到130mg/kg，本發(fā)明的另一個目的為后期飲料的開發(fā)提供依據(jù)。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案:
一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基，所述的培養(yǎng)基成分含量為:小麥粒120-125g。所述小麥粒含水量為50% ;經(jīng)過100-120°C下水煮30_60min。
[0007]使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基的測定方法，所述步驟包括如下:
(I)稱量小麥粒，將小麥粒使用自來水進(jìn)行清洗，取清洗后的小麥粒水煮，直至小麥粒軟而不裂內(nèi)部稍顯白色，泡10-20min后小麥粒飽滿內(nèi)部不顯白色，等量分裝入栽培瓶，封口后 121°C 滅菌 120min。
[0008](2)使用打孔器對制備好的菌種進(jìn)行打孔接種，接完中放入25°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng);
(3)每隔5天取樣研磨成碎末，準(zhǔn)確稱取20g研磨后的栽培料置于烘干箱進(jìn)行烘干，烘干后取1g栽培料至三角瓶，加入50mL的雙蒸水，60°C水浴2h，每隔半小時搖晃混勻；
(4)離心取上清液測定pH，并用考馬斯亮藍(lán)方法測定蛋白濃度；將剩余上清液70°C旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積無水乙醇4°C過夜靜置；
(5)離心分離上清與沉淀，取2mL上清液于烘干箱烘干，烘干后用ImL雙蒸水溶解，再添加Iml乙酸乙酯(99.5wt.%)進(jìn)行萃取兩遍；合并上層液烘干后使用香草醛-高氯酸顯色測定三萜酸濃度；沉淀加入1mL IM的NaOH溶液，60°C水浴2h后，取上清使用硫酸-苯酚法測定多糖濃度；
(6)準(zhǔn)確稱取5g烘干后的栽培料，加入50mL甲醇(99.5wt.%)置于37°C搖床中浸提5h，取4mL保存,取ImL于6000r/min, 4°C離心1min ;取0.5ml上清液于烘干箱烘干后使用香草醛-高氯酸方法測定總?cè)坪浚?br>
(7)精確稱取步驟3烘干栽培料Ig加入5mL離心管，再加入4mL石油醚(30-60°C)于40攝氏度水浴鍋水浴2h，冷卻后于9000r/min，4°C離心7min，等濾渣中石油醚揮發(fā)干后，連同濾洛濾紙至于5mL離心管,加入4mL水,沸水浴2h,冷卻后于4°C, 9000r/min,離心7min,定容到1ml之后吸取3mL蒸干其中的石油醚殘留，以蒸餾水洗滌3次，合并濾液于容量瓶，取100 μ L使用苯酚-硫酸法測定總糖。
[0009]本發(fā)明的優(yōu)點在于:目前國內(nèi)外中草藥三萜的研究主要集中在靈芝的液體發(fā)酵上，茯苓作為一種與靈芝代謝相似的中草藥，本身也會產(chǎn)生大量的三萜類物質(zhì)，但國內(nèi)外有關(guān)茯苓三萜的研究報道還是比較少見。本發(fā)明所針對的純小麥培養(yǎng)基在發(fā)酵過程中能夠產(chǎn)生較高的三職、胞外三職酸，分別高達(dá)1.6g/Kg與130mg/Kg,可以很好地提高獲茶三職類物質(zhì)的發(fā)酵提取、純化與利用。三萜酸具有減肥、降血糖、抗癌、抗腫瘤、抗肝損傷、抗菌消炎和抗病毒等多種生物學(xué)活性，其有效的開發(fā)利用具有很大的市場前景。
【具體實施方式】
[0010]實施例1
(1)稱量小麥粒，將小麥粒使用自來水進(jìn)行清洗，取清洗后的小麥粒水煮，直至小麥粒軟而不裂內(nèi)部稍顯白色，泡1min后小麥粒飽滿內(nèi)部不顯白色，等量分裝入栽培瓶，封口后121°C 滅菌 120min ；
(2)使用打孔器對制備好的菌種進(jìn)行打孔接種，接完中放入25°C培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)；
(3)每隔5天取樣研磨成碎末，準(zhǔn)確稱取20g研磨后的栽培料置于烘干箱進(jìn)行烘干，烘干后取1g栽培料至三角瓶，加入50mL的雙蒸水，60°C水浴2h，每隔半小時搖晃混勻；
(4)離心取上清液測定pH，并用考馬斯亮藍(lán)方法測定蛋白濃度；將剩余上清液70°C旋蒸濃縮10倍后加入3倍體積無水乙醇4°C過夜靜置；
(5)離心分離上清與沉淀，取2mL上清液于烘干箱烘干，烘干后用ImL雙蒸水溶解，再添加Iml乙酸乙酯(99.5%)進(jìn)行萃取兩遍；合并上層液烘干后使用香草醛-高氯酸顯色測定三萜酸濃度；沉淀加入1mL IM的NaOH溶液，60°C水浴2h后，取上清使用硫酸-苯酚法測定多糖濃度；
(6)準(zhǔn)確稱取5g烘干后的栽培料，加入50mL甲醇(99.5%)置于37°C搖床中浸提5h，取4mL保存，取ImL于6000r/min，4°C離心1min ;取0.5ml上清液于烘干箱烘干后使用香草醛-高氯酸方法測定總?cè)坪浚? (7)精確稱取步驟3烘干栽培料Ig加入5mL離心管，再加入4mL石油醚(30-60°C )于40攝氏度水浴鍋水浴2h，冷卻后于9000r/min，4°C離心7min，等濾渣中石油醚揮發(fā)干后，連同濾洛濾紙至于5mL離心管,加入4mL水,沸水浴2h,冷卻后于4°C, 9000r/min,離心7min,定容到一定體積1ml之后吸取3mL蒸干其中的石油醚殘留，以蒸餾水洗滌3次，合并濾液于容量瓶，取100 μ L使用苯酚-硫酸法測定總糖。
[0011]根據(jù)培養(yǎng)不同天數(shù)栽培料中的三萜酸測定，得到在培養(yǎng)到第25天時，每千克干栽培料中的總?cè)氝_(dá)到1.6g,三職酸量高達(dá)130mg。
[0012]以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應(yīng)屬本發(fā)明的涵蓋范圍。
【權(quán)利要求】
1.一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基，其特征在于:所述的培養(yǎng)基成分含量為:小麥粒120-125。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種使獲茶高產(chǎn)三職酸的純小麥培養(yǎng)基，其特征在于:所述小麥粒含水量為50% ；經(jīng)過100-1201下水煮30-60111111。
3.—種如權(quán)利要求1所述的一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基的制備方法，其特征在于:稱量小麥粒，將小麥粒使用自來水進(jìn)行清洗，取清洗后的小麥粒水煮，直至小麥粒軟而不裂內(nèi)部稍顯白色，泡10-20-！！后小麥粒飽滿內(nèi)部不顯白色，等量分裝入栽培瓶，封口后 121。。滅菌 1201111110
4.一種如權(quán)利要求1所述的一種使茯苓高產(chǎn)三萜酸的純小麥培養(yǎng)基在培養(yǎng)茯苓產(chǎn)三萜酸上的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P33/00GK104357524SQ201410530189
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年10月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月10日
【發(fā)明者】胡開輝, 林輝, 張燎原, 孫淑靜, 萬春和, 張職視 申請人:福建農(nóng)林大學(xué)