一種用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體的制作方法

一種用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)胞永生化過程中所使用的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18及其制備方法。該載體由微環(huán)質(zhì)粒與豬的MRPS18基因重組構(gòu)建，其堿基序列如序列表所示。該載體通過Tubofect試劑轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞可制備永生化細(xì)胞。本發(fā)明特異性的結(jié)合了Minicircle質(zhì)粒載體與MRPS18基因的優(yōu)點，所制備的真核重組微環(huán)表達(dá)載體，具有轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)時間長；不會引起真核細(xì)胞的應(yīng)激非病毒式誘導(dǎo)系統(tǒng)，低免疫源性，安全穩(wěn)定的優(yōu)點；且該質(zhì)粒表達(dá)載體表達(dá)GFP，便于跟蹤反應(yīng)；同時具備轉(zhuǎn)染效率高、簡單易用等優(yōu)點，可以獲得較好的永生化細(xì)胞制備效果。
【專利說明】—種用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種細(xì)胞永生化過程中所使用的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18及其制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]永生化細(xì)胞是指細(xì)胞在自然條件下或人為誘導(dǎo)條件下，從衰老的風(fēng)險中逃脫而擁有無盡增殖能力的細(xì)胞。由于永生化細(xì)胞可以作為細(xì)胞生物學(xué)和組織學(xué)等學(xué)科研究的標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞，并且具有相對穩(wěn)定的增殖特性和功能，因而具有廣闊的應(yīng)用前景。
[0003]MRP S18 (mitochondrial ribosome protein S18)蛋白是一種線粒體核糖體蛋白，它能夠翻譯線粒體蛋白，現(xiàn)有研究表明，MRP S18基因與多種線粒體疾病存在密切的分子遺傳學(xué)聯(lián)系，并且與細(xì)胞的生長調(diào)控也有密切的關(guān)系。已有研究發(fā)現(xiàn)，MRP S18基因的過表達(dá)能夠引起小鼠胚胎成纖維細(xì)胞永生化(Kashuba E, Yenamandra S P, Darekar SD, et al.；MRPS18 - 2 protein immortalizes primary rat embryonic fibroblasts andendows them with stem cell-like properties ；Proceedings of the Nat1nal Academyof Sciences, 2009,106(47): 19866?19871) ;Elena 等發(fā)現(xiàn) MRP S18 能特異性地結(jié)合視網(wǎng)膜蛋白(retinoblastoma，Rb)的磷酸化和去磷酸化形式，但它不與其它的口袋蛋白結(jié)合，如pl07和pl30，從而參與Rb通路的調(diào)控。在EB病毒轉(zhuǎn)染的小淋巴細(xì)胞中，EBNA-6蛋白能將MRPS18轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核，替換E2F1結(jié)合Rb，導(dǎo)致游離的E2F1增加，促進(jìn)Rb依賴的細(xì)胞周期進(jìn)程，且MRPS18轉(zhuǎn)染的細(xì)胞發(fā)生了永生化(Kashuba E, Yurchenko M, Yenamandra S P,et al.；EBV-encoded EBNA-6 binds and targets MRSI8-2 to the nucleus, resultingin the disrupt1n of pRb-E2Fl complexes ；Proceedings of the Nat1nal Academy ofSciences,2008，105(14):5489?5494)。
[0004]由于體外培養(yǎng)細(xì)胞發(fā)生自發(fā)永生化的機(jī)率很低，因此，目前普遍采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)將外源基因整合到細(xì)胞的染色體上，以增加永生化的發(fā)生機(jī)率。由于脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法較其他方法的應(yīng)用簡單易用，且轉(zhuǎn)染效率較高，可以轉(zhuǎn)染其他化學(xué)方法不容易轉(zhuǎn)染的細(xì)胞系，因而使用較為普遍。
[0005]載體是將外源基因?qū)胨拗骷?xì)胞的運載工具，基因表達(dá)載體系統(tǒng)包括病毒與非病毒兩種。病毒載體的應(yīng)有常有一定安全隱患存在，主要原因在于病毒容易整合到基因組，具有免疫原性。傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體雖然比病毒載體安全，但是轉(zhuǎn)染效率卻很低，而且用于轉(zhuǎn)染的用量很大，達(dá)到毫克級，因而成本較高；其次傳統(tǒng)的質(zhì)粒載體含有細(xì)菌的復(fù)制原點、抗性基因、未甲基化的CpG序列以及有些可能隱蔽的表達(dá)信號，雖然這些序列在質(zhì)粒的復(fù)制時是必需的，但在目的基因的表達(dá)、治療中可能誘發(fā)非常嚴(yán)重的生物安全性問題。
微環(huán)DNA (Minicircle DNA,MC DNA)是一種環(huán)狀的DNA結(jié)構(gòu),Minicircle的原始質(zhì)粒MP是美國SBI公司開發(fā)的一種新型真核表達(dá)載體，通過MP自身的特異性位點，在阿拉伯糖的誘導(dǎo)下可以使其轉(zhuǎn)變?yōu)槲h(huán)載體Minicircle，它既沒有細(xì)菌的復(fù)制原點，又不含抗性基因，和其它載體相比長度更小。研究表明，Minicircle載體功能很強，在體內(nèi)或體外的細(xì)胞和組織中能夠長期表達(dá)轉(zhuǎn)基因，和其他載體相比，轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)的時間是其他載體的10-1000倍。同時并不會引發(fā)真核細(xì)胞的應(yīng)激非病毒式誘導(dǎo)系統(tǒng)，而且表達(dá)綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP),便于觀察跟蹤,具備轉(zhuǎn)染效率高、體內(nèi)長期表達(dá)等優(yōu)點，并且簡單易用。
[0006]現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于豬的MRP S18基因的真核表達(dá)載體研究使用過pcDNA3.1 (+)、PEGFP-Nl等載體，然而這些載體中都含有細(xì)菌復(fù)制起始位點和抗性基因，這些元件可能會使外源基因沉默，因而并不適于制備永生化細(xì)胞，而現(xiàn)有技術(shù)中，尚未見到較好的載體與MRP S18基因的重組微環(huán)表達(dá)載體的有關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明目的在于提供一種Minicircle質(zhì)粒(也稱微環(huán)質(zhì)粒)與豬的MRP S18基因構(gòu)建的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18,該表達(dá)載體可以轉(zhuǎn)染相關(guān)細(xì)胞用于制備永生化細(xì)胞。
[0008]本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下:
一種用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18,由微環(huán)質(zhì)粒與豬的MRP S18基因重組構(gòu)建，其喊基序列如序列表所不。
[0009]所述用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18,其制備過程為:首先PCR克隆豬MRP S18基因，然后將克隆的MRP S18基因與質(zhì)粒pMD19_T連接，構(gòu)建PMD19-T-MRPS18重組質(zhì)粒，將構(gòu)建好的pMD19_T_MRPS18重組質(zhì)粒和微環(huán)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性菌落進(jìn)行菌液PCR和測序鑒定，將鑒定正確的載體收集即為重組微環(huán)表達(dá)載體 Minicircle-MRP S18 ；
詳細(xì)制備過程包括如下步驟:
(1)PCR克隆豬的MRP S18基因；
(2)將步驟(I)中克隆的MRPS18基因與pMD19-T質(zhì)粒連接，構(gòu)建pMD19_T_MRPS18重組質(zhì)粒；
(3)將重組質(zhì)粒pMD19-T-MRPS18與Minicircle質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，鑒定，獲得真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18。
[0010]所述述用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18,通過Tubofect試劑轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)化進(jìn)入轉(zhuǎn)染細(xì)胞用于制備永生化細(xì)胞。
[0011]所述轉(zhuǎn)染細(xì)胞為Hela細(xì)胞。
[0012]本發(fā)明采用的外源永生化基因是豬線粒體核糖體蛋白MRP S18基因，該基因在豬的各個組織均有分布，相對其它外源基因來說容易獲得，因而是一個安全的、表達(dá)穩(wěn)定的外源基因。本發(fā)明所提供的用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPSIS，特異性地結(jié)合了 Minicircle質(zhì)粒載體與MRP S18基因各自的優(yōu)點，所制備的真核重組微環(huán)表達(dá)載體，具有轉(zhuǎn)基因持續(xù)表達(dá)時間長；不會引起真核細(xì)胞的應(yīng)激非病毒式誘導(dǎo)系統(tǒng)，低免疫源性，安全穩(wěn)定的優(yōu)點；且該質(zhì)粒表達(dá)載體表達(dá)GFP，便于跟蹤反應(yīng)；同時具備轉(zhuǎn)染效率高、簡單易用等優(yōu)點，因而適于轉(zhuǎn)染相關(guān)細(xì)胞，可以獲得較好的永生化細(xì)胞制備效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18的構(gòu)建流程示意圖；
圖2為MRP S18基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，2—4為MRPS18基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；
圖3為pMD19-T-MRP S18質(zhì)粒的菌液PCR結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，2—4為pMD19-T-MRP S18質(zhì)粒的菌液PCR結(jié)果；
圖4為PMT19-MRP S18克隆載體的雙酶切結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，2為PMT19-MRP S18克隆載體的雙酶切結(jié)果；3為PMT19-MRP S18 ； 4為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Wide Range DL15000 ；
圖5為Minicircle載體的雙酶切結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Wide RangeDL15000 ； 2 為 Minicircle 載體的雙酶切結(jié)果；3 為 Minicircle ；
圖6為真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18的菌液PCR結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)DL2000，2—5為真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18的菌液PCR結(jié)果；圖7為真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18的誘導(dǎo)結(jié)果，其中I為DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)Wide Range DL15000，2為Minicircle-MRP S18的單酶切鑒定結(jié)果，3— 4為Minicircle-MRP S18 的誘導(dǎo)結(jié)果；
圖8為Hela細(xì)胞中MRPS18基因的mRNA表達(dá)水平結(jié)果；
圖9為Hela細(xì)胞中GFP基因的mRNA表達(dá)水平結(jié)果；
圖10為Minicircle-MRP S18在HeLa細(xì)胞的持續(xù)時間表達(dá)；其中A為試驗組48h (1X)，B為試驗組第8d(10X)，C為試驗組第15d(10X)，D為試驗組第22d (1X)，E為陰性對照組48h (10X)，F(xiàn)為陰性對照組第22d(10X)；
圖11為MTT法繪制細(xì)胞生長曲線結(jié)果；
圖12為β_半乳糖苷酶活性檢測結(jié)果，其中A為試驗組(1X)，B為空白對照組(1X)，C為陽性對照組(1X)，D為陰性對照組(1X)；
圖13為免疫化學(xué)實驗檢測細(xì)胞中TERT的表達(dá)情況結(jié)果；其中A為試驗組48h (1X)，B為空白對照組48h (1X)，C為陰性對照組48h (1X)；
圖14為端粒酶TRAP結(jié)果；其中I為試驗組，2為空白對照組，3為陽性對照組。

【具體實施方式】
[0014]下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進(jìn)一步的解釋說明，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員便于理解和實施本發(fā)明。
[0015]介紹具體實施例前，對實施例中所用樣品來源、主要試劑、設(shè)備簡要介紹如下，未述及內(nèi)容以本領(lǐng)域常用設(shè)備或試劑為準(zhǔn)。
[0016]豬的MRP S18基因:取豬的肝臟組織，組織采用液氮速凍后保存于_80°C。
[0017]菌株和質(zhì)粒:pMD19-T載體(Code N0.3271)、E.coli DH5 α 菌株(即 DH5a 感受態(tài)細(xì)胞，Code N0.9057)購自大連寶生物工程有限公司(TAKARA) ;MP質(zhì)粒、ZYCY10P3S2TE.coli菌株購自美國SBI公司。
[0018]主要儀器:
溫度梯度PCR分析儀，B1metra, Germany ；
JY600C電泳儀與JY-SCZ-2電泳槽，北京君意東方電泳設(shè)備有限公司； 凝膠成像分析系統(tǒng)，UVP, Germany ；
微量紫外分光光度計，Thermo NAN0DR0P 1000 ；
VD-850型桌上式樣潔凈工作臺，蘇州凈化；
HH-S2數(shù)顯電熱恒溫水浴鍋，金怡；
臺式小型離心機(jī) 5424R, Eppendorf, Germany ；
申能博彩高精度數(shù)控?fù)u床，上?？蚌蝺x器設(shè)備有限公司；
自動高壓滅菌鍋，SANYO, Japan ；
恒溫孵育器，Eppendorf, Germany ；
微量移液器，Eppendorf, Germany。
[0019]主要試劑及配制:
質(zhì)粒小量提取試劑盒(AxyPrep Plasmid Miniprep Kit)購自AXYGEN公司；
山羊抗兔抗體為日本中杉金橋公司產(chǎn)品；
SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒來自上海生工生物工程有限公司；
20% L-阿拉伯糖購自美國SBI公司；
Nhe I (Code No: 1622), Bam HI (Code No:1605), T4 DNA 連接酶、rTaq 酶(Code No:RR902A)、DL5000、DL2000、Wide Range DNA Markerl5000、Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑、5 X M-MLVBuffer (lot::A801A)>1mM dNTP mix (lot:BH2701A)、Ribonuclease Inhibitor (lot:Κ68010Α,40υ/μ? , M-MLV Reverse Transcriptase (lot:CK3401A，200U/^L)、oligo(dT)(lot:T401AA，14nmol)、Solut1n ICCode N0.6023)、10XGreen BufferCCode No:1605)、T4 DNA連接酶(Code No:2040A)U0XT4 DNA Ligase BufferCCode No:2040A),SYBR Greenmix (lot:AK3803)購自 TAKARA 公司；
轉(zhuǎn)染試劑TurboFect購自Thermo公司；
質(zhì)粒中提試劑盒購自QIAGEN公司；
DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清、0.25%胰酶為Gibco公司產(chǎn)品； β-半乳糖苷酶報告基因檢測試劑盒為碧云天生物技術(shù)研究所產(chǎn)品；
阿霉素購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司；
兔抗人hTERT抗體購自武漢博士德生物工程有限公司；
DEPC 水(lot:3A600180)，北京鼎國；
切膠純化試劑盒(編號:SK8132)，上海生工生物工程有限公司。
[0020]LB 液體培養(yǎng)基:Tryptone (胰蛋白胨)10g, Yeast Extract (酵母提取物)5g,NaCl5g。配制方法，按照配方分別稱量，加入800ml去離子水，混勻使其充分溶解，隨后加入去離子水定容至100mL,用NaOH (5mol/L)溶液調(diào)pH值至7.0,高壓蒸汽滅菌30min。
[0021]氨芐青霉素(Ampicillin)貯存液:稱取Ig氨芐青霉素于15mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至1ml (終濃度為100mg/mL)，用0.22mm過濾膜進(jìn)行過濾除菌，分裝，-20°C保存。使用時每ImL LB液體培養(yǎng)基加入IyL Amp貯存液，使用終濃度為
100μ g/mL。
[0022]卡那霉素(Kanamycin)忙存液:稱取0.5g Kanamycin置于15mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至1mL (終濃度為50mg/mL)，用0.22mm過濾膜進(jìn)行過濾除菌，分裝(ImL/管)，-20°C保存。使用時每ImL LB液體培養(yǎng)基加入WL該Kana貯存液，使用終濃度為50Pg/mL。
[0023]IPTG (異丙基硫代_β -D半乳糖苷)貯存液:稱取1.2g IPTG置于50mL離心管中，加入適量滅菌水，充分溶解后，定容至50mL,終濃度為24mg/mL,用0.22mm過濾膜進(jìn)行過濾除菌，分裝，_20°C保存。
[0024]X-gal (5-溴_4_氫_3_吲哚-β -D-半乳糖苷)貯存液:稱取Ig X-gal于50mL離心管中，加入40ml DMF (二甲基甲酰胺)，充分溶解后，定容至50mL，終濃度為(20mg/mL)，用0.22mm過濾膜進(jìn)行過濾除菌，分裝，置于_20°C保存。
[0025]Amp+/LB固體培養(yǎng)基:按照配方先配制IL LB液體培養(yǎng)基,然后加入15g瓊脂粉(Agar powder),高壓蒸汽滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻至60°C時,加入Ampicilin忙存液，至終濃度為100 μ g/mL,充分混勻，鋪制平板培養(yǎng)皿，35mL/90mm培養(yǎng)皿。
[0026]Kana +/LB固體培養(yǎng)基:按照配方先配制IL LB液體培養(yǎng)基，然后加入15g瓊脂粉(Agar powder),高壓蒸汽滅菌30min。待培養(yǎng)基冷卻至60°C時,加入Kanamycin忙存液，至終濃度為50 μ g/mL,充分混勻，鋪制平板培養(yǎng)皿，35mL/90mm培養(yǎng)皿。
[0027]50 X TAE 電泳緩沖液(ρΗ8.0):稱取 242g Tris 和 37.2g EDTA置于 IL燒杯中，加雙蒸水800mL，充分溶解，加入57.1mL冰醋酸，充分混勻后調(diào)pH值為8.0，然后加入雙蒸水定容至1L。
[0028]5mg/ml的MTT溶液:稱取50mgMTT溶解于1ml磷酸鹽緩沖液中，配成5mg/ml濃度，抽濾除菌，分裝避光-20度保存。
[0029]10%胎牛血清培養(yǎng)基:900mlDMEM中加入已滅活的胎牛血清100ml，混勻后，調(diào)PH值為7.0，0.45um微孔濾膜過濾除菌，4°C保存。
[0030]大腸桿菌DH5a和ZYCY10P3S2T E.coli感受態(tài)細(xì)胞采用CaCl2法擴(kuò)增培養(yǎng)，具體為:
(1)挑取原菌種，在LB瓊脂板上劃線，37°C培養(yǎng)過夜(12?16h)；
(2)從活化的菌平板上挑取一個單菌落，接種于2mLLB液體培養(yǎng)基中，于37°C搖床培養(yǎng)過夜；次日將該菌液以1%體積比例接種于50mL LB液體培養(yǎng)基中，37°C搖床2?3h，擴(kuò)大培養(yǎng)；混濁后，每30min測一次OD6tltl,至OD6tltl為0.3左右，停止培養(yǎng)；
(3)冰浴lOmin，轉(zhuǎn)入 50mL 離心管中，4°C、4000r/min 離心 1min ；
(4)棄去上清液，用1mL冰浴的0.lmol/L CaCl2溶液(已高壓滅菌)重懸細(xì)胞后，冰浴30min ;然后于 4°C、4000r/min 離心 1min ；
(5)棄去上清液，加入2mL預(yù)冷的0.1 mo I/L CaCl2 (含15 %甘油，已高壓滅菌)，小心懸浮細(xì)胞；
(6)置于冰浴中，以ΙΟΟμ?ν管分裝于小管，置于_80°C保存。
[0031]注:以上工作在超凈工作臺中操作，以避免污染。
[0032]實施例1
本發(fā)明所提供的用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18,由微環(huán)質(zhì)粒與豬的MRP S18基因重組構(gòu)建，其喊基序列如序列表所不。
[0033]真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18，其制備過程如圖1所示，具體為:首先PCR克隆豬MRP S18基因，然后將克隆的MRP S18基因與質(zhì)粒pMD19_T連接，構(gòu)建PMD19-T-MRPS18重組質(zhì)粒，將構(gòu)建好的pMD19_T_MRPS18重組質(zhì)粒和微環(huán)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，連接，轉(zhuǎn)化，挑取陽性菌落進(jìn)行菌液PCR和測序鑒定，將鑒定正確的載體收集即為重組微環(huán)表達(dá)載體 MinicireIe-MRPS 18 ο
[0034]詳細(xì)制備過程介紹如下:
(I) PCR克隆豬的MRP S18基因；
①引物的設(shè)計和合成
根據(jù)MRP S18基因的核苷酸序列和表達(dá)載體克隆位點的要求,設(shè)計引物,引物由上海生工生物工程有限公司設(shè)計合成，具體序列如下:
F: 5 ’ -CTAGCTAGCGCCACCATGGCTGCCTCCATATTGAACGTG-3，，
R:5’ -CGGGATCCCTACAGAGCACTTTGCGG-3’。
[0035]②豬肝臟組織中總RNA的提取
總RNA提取采用TRIZOL法，步驟簡要介紹如下:
從液氮中取出保存的組織，于錫箔紙上取約lOOmg，放入2ml離心管中，加入I mLTrizol，用組織勻漿機(jī)冰浴下充分破碎45s，室溫靜置5min ;加入200 μ L氯仿，劇烈震蕩3min,室溫靜置2min ；4°C 12000 rpm離心15min,可觀察到樣品分為三層，小心吸取上層水相(約400 μ L)轉(zhuǎn)移至一新1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，上下緩慢顛倒混勻后，室溫靜置20 min，沉淀RNA ;4°C 12000 rpm離心10 min，棄去上清，沉淀用ImL 75%乙醇(DEPC水配制)洗漆,彈起沉淀；4°C 12000 rpm離心10 min,棄去上清,沉淀用ImL無水乙醇懸浮；4°C 12000rpm離心5min,棄去上清,倒扣于吸水紙上，自然晾干；根據(jù)沉淀的多少用適量的DEPC水20?100 μ L溶解，_80°C保存。
[0036]③提取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA
反轉(zhuǎn)錄:模版RNAl μ g, oligo (dT) I μ L,加DEPC水至6 μ L,混勻并瞬離,70°C 1min后立即冰浴5min，加入以下反轉(zhuǎn)錄體系:
5 X M-MLV Buffer,2μ? ；
1mM dNTP mix，0.5μ? ；
Ribonuclease Inhibitor，0.25μ? ;
M-MLV Reverse Transcriptase，I μ L ；
DEPC 水，0.25 μ L0
[0037]將以上配制好的產(chǎn)物放入PCR儀中，按以下反應(yīng)程序進(jìn)行:30°C 10 min,42°CIh，720C 1min，140C pause。
[0038]反應(yīng)結(jié)束后，加50 μ L的DEPC水，將所得cDNA稀釋6倍，所得的cDNA置于_20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0039]④PCR擴(kuò)增目的片段 PCR體系:
ddH20，8.5I^L ；
rTaq 酶，12.5I^L ；
步驟①中 Primer F (10 pmol/KL)，?μ? ;
步驟①中 Primer R (10 pmol/KL)，?μ? ;
步驟③中cDNA，2KL ；
反應(yīng)條件:95°C 5min，95°C 30s、56°C 30s、72°C 70s，反應(yīng) 39 個循環(huán)，72°C 1min0
[0040]PCR產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖2，用切膠純化試劑盒進(jìn)行回收。
[0041](2)將步驟(I)中克隆的MRP S18基因與pMD19-T質(zhì)粒連接，構(gòu)建pMD19-T-MRPS18
重組質(zhì)粒
按照TaKaRa寶生物工程有限公司pMD_19T載體說明，將MRP S18基因與pMD_19T載體連接。
[0042]反應(yīng)體系如下:
步驟(I)中PCR擴(kuò)增后MRP S18基因，1.5μ?;
PMD-19T (50 ng /uL),?μ? ；
Solut1n I (TAKARA, Code N0.6023),5μ? ；
雙蒸水，2.5μ? ；
連接溫度16°C，時間12h，冰上放置5min。
[0043]取連接完成后取1PL液體轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂在含氨芐青霉素(100 μ g/mL)的LB培養(yǎng)平板上(37°C、12?16h)。挑取單個菌落于含氨芐青霉素的(100 μ g/mL) LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)(37°〇、511)，進(jìn)行菌液PCR鑒定。
[0044]PCR鑒定體系如下: ddH20,8.5M-L ；
rTaq 酶，12.5M-L ；
步驟(I)中 Primer F (10 pmol/M-L), IM-L ；
步驟(I)中 Primer R (10 pmol/M-L), IM-L ；
菌液，2μ?。
[0045]反應(yīng)條件:95°C 5min,95 °C 30s,56 °C 30s,72 °C 70s，反應(yīng) 39 個循環(huán)，72°C 1min。
[0046]PCR產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖3。
[0047](3)構(gòu)建重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle_MRPS18
分別將重組質(zhì)粒PMD19-T-MRPS18與Minicircle質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，鑒定，構(gòu)建重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18。具體如下:
①Minicircle質(zhì)粒和pMD19_T_MRP S18重組質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切酶切體系:
NheI，?μ? ；
Bam HI, IM-1 ；
1XGreen Buffe, 2M-1 ；
Minicircle 質(zhì)?；虿襟E(2)中 pMD19T- MRP S18 (100ng/>L，9μ? ；
高壓雙蒸水，up to 20? ；
酶切溫度37°C，時間30min。
[0048]酶切產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖4和圖5。用切膠純化試劑盒進(jìn)行回收酶切產(chǎn)物。
[0049]②酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接連接體系:
T4 DNA 連接酶，?μ? ；
10XT4 DNA Ligase Buffer, 2.5? ；
步驟①中雙酶切MRP S18片段(20ng/^L)，WL ;
步驟①中雙酶切Minicircle質(zhì)粒片段(32.1ng/μι), 3.5μ? ；
滅菌水，12μ? ；
連接溫度16°C，時間12h，冰上放置5min。
[0050]取1PL連接體系轉(zhuǎn)化入DH5 α感受態(tài)細(xì)胞中，均勻涂在含卡那霉素(5(^g/mL)的LB培養(yǎng)平板上。挑取單個菌落于含卡那霉素(5(^g/mL)的LB培養(yǎng)液中培養(yǎng)，進(jìn)行菌液PCR鑒定。
[0051]PCR鑒定體系如下: ddH20,8.5M-L ；
rTaq 酶，12.5M-L ；
步驟(I)中 Primer F (10 pmol/M-L), IM-L ；
步驟(I)中 Primer R (10 pmol/M-L), IM-L ；
菌液，2μ?。
[0052]反應(yīng)條件:95°C 5min,95°C 30s、56°C 30s,72 °C 70s，反應(yīng) 39 個循環(huán)，72 °C1min0 PCR產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖6。
[0053]③微環(huán)質(zhì)粒Minicircle質(zhì)粒誘導(dǎo)表達(dá)效果鑒定
將步驟②中構(gòu)建得到的Minicircle-MRP S18重組微環(huán)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入ZYCY10P3S2T感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)20% L-阿拉伯糖誘導(dǎo)后，用NheI酶切來鑒定微環(huán)誘導(dǎo)的效果。
[0054]酶切體系:
NheI, Iμ? ；
1XGreen Buffer, 2M-L ；
pMD19T- MRP S18(lOOng/μ? ,9μ? ；
高壓雙蒸水，up to 20μ1 ；
酶切溫度37°C，時間30min。
[0055]酶切產(chǎn)物跑1%的瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果見圖7。結(jié)果表明微環(huán)質(zhì)粒Minicircle質(zhì)粒正確表達(dá)，所構(gòu)建的Minicircle-MRP S18重組微環(huán)表達(dá)載體可以用來轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
[0056]實施例2
為檢驗實施例1所構(gòu)建的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18在細(xì)胞永生化方面的具體技術(shù)效果，發(fā)明人將Minicircle-MRP S18轉(zhuǎn)染人子宮癌細(xì)胞Hela cell后，在細(xì)胞水平上進(jìn)一步檢測了該基因的表達(dá)情況及對相關(guān)的細(xì)胞永生化指標(biāo)進(jìn)行了檢測(細(xì)胞永生化指標(biāo)有:實時定量PCR檢測基因的表達(dá)以及Minicircle中GFP的表達(dá)，熒光持續(xù)時間觀察，MTT法細(xì)胞生長曲線繪制，細(xì)胞衰老標(biāo)志β-半乳糖苷酶活性檢測，免疫化學(xué)實驗檢測細(xì)胞中TERT的表達(dá)，端粒酶活性的檢測)，具體介紹如下。
[0057]①重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞
用含10%滅活胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，在5% CO2、37°C條件下培養(yǎng)人子宮癌細(xì)胞Hela細(xì)胞，采用Tubofect試劑轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染；同時設(shè)置了 Minicircle轉(zhuǎn)染的Hela細(xì)胞作為對照。
[0058]②實時熒光定量PCR檢測MRP S18基因、GFP在Hela細(xì)胞中的表達(dá)
為檢驗MRP S18基因、GFP在Hela細(xì)胞中的表達(dá)情況，發(fā)明人分別從轉(zhuǎn)染Minicircle-MRP S18的Hela細(xì)胞、轉(zhuǎn)染Minicircle的Hela細(xì)胞、未轉(zhuǎn)染的正常的Hela細(xì)胞中提取了總RNA并進(jìn)行RT-PCR合成cDNA，通過Real time Q-PCR進(jìn)行基因mRNA表達(dá)水平的檢測。mRNA相對表達(dá)量結(jié)果用GraphPad Prism 5統(tǒng)計軟件分析處理。
[0059]如圖8所示，針對MRP S18基因表達(dá)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Minicircle-MRP S18的Hela細(xì)胞與轉(zhuǎn)染Minicircle的Hela細(xì)胞相比，MRP S18基因表達(dá)水平顯著升高。
[0060]如圖9所示，針對GFP的表達(dá)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染Minicircle-MRP S18的Hela細(xì)胞與轉(zhuǎn)染Minicircle的Hela細(xì)胞相比，GFP的表達(dá)水平無顯著差異。
[0061]具體步驟如下:
分別將轉(zhuǎn)染真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18的Hela細(xì)胞、Minicircle的Hela細(xì)胞及正常Hela細(xì)胞培養(yǎng)48h后提總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，將各樣品的cDNA原液用DEPC-H2O進(jìn)行50倍稀釋，將稀釋后的cDNA作為反應(yīng)模板，單個樣品的每個基因均作3孔重復(fù)以減少試驗誤差，分別以MRP S18、Minicircle質(zhì)粒片段中的GFP Q-PCR為引物，以人β-actin為內(nèi)參，進(jìn)行Real Time PCR0引物由大連寶生物工程有限公司合成。
[0062]MRP S18 Q-PCR 引物序列:
上游為 GGGACCTTGACTTCAGTACCACTC，
下游為 GCTCTCTCTCTGGTGGCTGTTT ；
GFP Q-PCR引物序列:
上游為 CGCATGACCAACAAGATGAAG，
下游為 GGTAGGTGCCGAAGTGGGATA ； β -actin Q-PCR 引物序列:
上游為 GGGTCAGA AGGATTCCTATG,
下游為 GGTCTCAAACATGATCTGGG。
[0063]熒光定量PCR檢測相關(guān)基因:以稀釋后各樣品的cDNA作為反應(yīng)模板，每個樣品的單個基因做3孔重復(fù)用來減少試驗中的誤差，每一個樣品均有管家基因β -actin作為對照。反應(yīng)體系如下:
SYBR Green mix，5 μ L ;
上游引物(20 pmol/μ?,Ο.1yL5 下游引物(20 pmol/μ?,Ο.1yL5 cDNA,1.25uL ；
DEPC 水，3.55 μ L0
[0064]最佳反應(yīng)程序為:95°C2min,95°C 15s、60°C 20s，40 個循環(huán)，72°C 20s。
[0065]熒光信號的采集設(shè)置在PCR反應(yīng)的延伸階段，閾值及基線由軟件自動生成。擴(kuò)增程序設(shè)置后，再插入熔解曲線的反應(yīng)程序，具體程序為:95°C 15s,60°C 15s，95°C 15s。
[0066]③Minicircle-MRP S18真核重組微環(huán)表達(dá)載體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后熒光持續(xù)時間的觀察轉(zhuǎn)染前8h將處于對數(shù)生長期的Hela細(xì)胞以IX 15/孔的密度接種于12孔板，待細(xì)胞生長達(dá)40%_60%融合度時，按Tubofect轉(zhuǎn)染試劑盒說明書進(jìn)行轉(zhuǎn)染，設(shè)置不轉(zhuǎn)質(zhì)粒的Hela細(xì)胞作為陰性對照組，24 h后觀察各自的熒光情況，持續(xù)觀察直至熒光消失。
[0067]用熒光顯微鏡拍照結(jié)果如圖10所示。
[0068]從圖中可以看到,轉(zhuǎn)入Minicircle-MRP S18重組微環(huán)表達(dá)載體的細(xì)胞出現(xiàn)了綠色熒光(圖A)，表明微環(huán)表達(dá)載體成功轉(zhuǎn)染入細(xì)胞中，持續(xù)觀察到第22d時，熒光消失(圖D)，表明表達(dá)效果較為持久。
[0069]④MTT法細(xì)胞生長曲線的繪制
實驗分為3組:轉(zhuǎn)染Minicircle的空白對照組，轉(zhuǎn)染Minicircle-MRP S18基因組，未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的正常的Hela細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6個小時后每孔加入MTT液(5mg/mL) 10uL，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4h后，棄上清，每孔加入150uL 二甲基亞楓(saikeb1，CAS:67685)。震蕩使結(jié)晶充分溶解，在多功能酶標(biāo)儀上測定吸收度A492nmt5連續(xù)檢測5天后，分析吸收度A492nm值，以時間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D值為縱坐標(biāo)作生長曲線圖，如圖11所示。結(jié)果表明豬MRPS18基因?qū)ela細(xì)胞的生長有抑制，但生長趨勢正常。
[0070]⑤β -半乳糖苷酶報告基因檢測
β -半乳糖苷酶是一種常用的衰老標(biāo)志物的報告基因，可以進(jìn)行原位染色，在光學(xué)顯微鏡下就能夠觀察到細(xì)胞或組織中的β-半乳糖苷酶的表達(dá)。
[0071]以β-半乳糖苷酶原位染色試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所，編號:C0602)對了β -半乳糖苷酶報告基因的表達(dá)情況進(jìn)行了檢測鑒定。實驗分為4組:轉(zhuǎn)染Minicircle的空白對照組，轉(zhuǎn)染Minicircle-MRP S18試驗組，正常的Hela的未刺激的陰性對照組和正常的Hela刺激細(xì)胞衰老后的陽性對照組。
[0072]β -半乳糖苷酶原位染色試劑盒以X-Gal為底物，β -半乳糖苷酶能夠催化其生成深藍(lán)色產(chǎn)物，這樣在普通顯微鏡下就能觀察到變成藍(lán)色的衰老的細(xì)胞?？筛鶕?jù)細(xì)胞染色情況觀察，細(xì)胞染色成藍(lán)色說明細(xì)胞衰老，染色越深說明衰老越明顯。結(jié)果如圖12所示，結(jié)果顯示MRP S18對細(xì)胞的衰老有抑制作用。
[0073]⑥免疫化學(xué)實驗檢測細(xì)胞中TERT的表達(dá)情況
將Iyg Minicircle-MRP S18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中作為試驗組，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染即正常的Hela細(xì)胞的陰性對照組,轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Minicircle的空白對照組做免疫化學(xué)實驗觀察TERT的表達(dá)情況。
[0074]48h后做免疫組化，觀察細(xì)胞中的TERT的表達(dá)，染色越深代表細(xì)胞中的TERT表達(dá)量越高。結(jié)果顯示，MRPS18能促進(jìn)細(xì)胞中TERT的表達(dá)。如圖13。
[0075]具體步驟如下:
固定:吸出培養(yǎng)基，PBS (博士德，0.1M)洗2次，冷丙酮(煙臺市雙雙化工有限公司，批號265141)固定 1min0
[0076]吸出丙酮，加PBS清洗5min。玻片取出晾干。
[0077]滴加1:300 (PBS)稀釋的兔抗人TERT抗體(武漢博士德生物工程有限公司)，置濕盒中，37°C，lh。
[0078]取出玻片，PBS震洗3次，每次5min，吹干。
[0079]滴加1:1OO(PBS)稀釋的山羊抗兔抗體(日本中杉金橋公司)，置于濕盒中，37°C，Ih0
[0080]取出玻片，PBS震洗3次，每次5min，吹干。
[0081]DAB (中杉金橋，ZL1-9017/9018/9019)顯色 lOmin，室溫。
[0082]自來水沖洗(終止DAB染色)。
[0083]中性樹脂(中國上海標(biāo)本模型廠)封片、拍照。
[0084]⑦端粒酶活性的檢測
將Iyg Minicircle-MRP S18重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入Hela細(xì)胞中作為試驗組，同時設(shè)置未轉(zhuǎn)染即正常Hela細(xì)胞陽性對照組，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒Minicircle的空白對照組，培養(yǎng)48h后進(jìn)行細(xì)胞端粒酶活性的檢測，結(jié)果如圖14。端粒酶試劑盒(南京凱基生物，CAT N0.KGA413)在凝膠電泳上顯示間隔6bp階梯狀分離的陽性結(jié)果，端粒酶活性的大小可由條帶得深淺及多少來說明。結(jié)果表明MRP S18能增強端粒酶的活性。具體操作如下。
[0085]轉(zhuǎn)染體系:
質(zhì)粒，IPg ；
DMEM(無血清)(Gibco 公司，lot N0.1233130), ΙΟΟμ? ；
轉(zhuǎn)染試劑，2PL ；
將質(zhì)粒和DMEM混勻后靜置5min，加入轉(zhuǎn)染試劑混勻，靜置15min，滴加到12孔板中，邊加邊緩慢搖動，12h換液。
【權(quán)利要求】
1.一種用于細(xì)胞永生化的真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18,其特征在于，該重組微環(huán)表達(dá)載體由微環(huán)質(zhì)粒Minicircle與豬的MRP S18基因重組構(gòu)建，其堿基序列如序列表所示。
2.權(quán)利要求1所述真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18的制備方法,其特征在于，包括如下步驟: (1)PCR克隆豬的MRP S18基因; (2)將步驟(I)中克隆的MRPS18基因與pMD19-T質(zhì)粒連接，構(gòu)建pMD19-T-MRPS18重組質(zhì)粒； (3)將重組質(zhì)粒pMD19-T-MRPS18與Minicircle質(zhì)粒分別進(jìn)行雙酶切，雙酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，鑒定，獲得重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18。
3.權(quán)利要求1所述真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18在制備永生化細(xì)胞方面的應(yīng)用。
4.如權(quán)利要求3所述真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRPS18在制備永生化細(xì)胞方面的應(yīng)用，其特征在于，將真核重組微環(huán)表達(dá)載體Minicircle-MRP S18通過Tubofect試劑轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞。
【文檔編號】C12N15/66GK104293832SQ201410525855
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】王月影, 張君, 楊國宇, 李和平, 鐘凱, 朱河水, 郭豫杰, 魯維飛, 韓立強, 張超, 焦顯芹 申請人:河南農(nóng)業(yè)大學(xué)