利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，可有效解決飼用沼澤紅假單胞菌的制備，以滿足飼料養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)的需要，技術(shù)方案是，包括以下步驟：制備菌種、種子培殖、制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基、接種、發(fā)酵培養(yǎng)、載體吸附、烘干，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要為白玉米面等資源豐富，價(jià)格低、簡(jiǎn)單易得；2.發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，自動(dòng)液體發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方便，生長(zhǎng)速度快，發(fā)酵周期大大縮短，只有72～96h；3.能制備飼用沼澤紅假單胞菌；4.飼用沼澤紅假單胞菌，應(yīng)用效果好，經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益顯著；5.采用我國農(nóng)業(yè)部許可微生物菌株沼澤紅假單胞菌AS1.2352進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，安全性高，是綠色飼用添加劑。
【專利說明】利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】，特別是一種利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅 假單胞菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 按照東秀珠（2001)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》分類，沼澤紅假單胞菌 Rhodopseudomonas palustris屬于紫色非硫細(xì)菌、紅假單胞菌屬，在自然界的碳素、氮素、 硫素轉(zhuǎn)化循環(huán)中起重要作用，是所在環(huán)境物質(zhì)循環(huán)及能量流動(dòng)的主要參加者之一，具有富 集多種微量元素的能力，菌體營養(yǎng)豐富，蛋白質(zhì)含量高，且富含多種生物活性物質(zhì)，并且活 性菌株含有某些抗病抗逆性物質(zhì)，并具有適應(yīng)性強(qiáng)，能耐受高濃度的有機(jī)廢水和較強(qiáng)的分 解轉(zhuǎn)化能力，對(duì)酚、氰等毒物也有一定的耐受和分解能力等特點(diǎn)。沼澤紅假單胞菌的用途很 多，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、漁業(yè)、環(huán)保等領(lǐng)域，可用于水質(zhì)凈化、污水處理、飼料級(jí)微生物添加 劑等。關(guān)于飼用微生物方面，沼澤紅假單胞菌是我國農(nóng)業(yè)部允許在飼料中直接添加的活性 微生物之一，是優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑，在畜禽養(yǎng)殖方面，沼澤紅假單胞菌可作為一種飼料蛋白 補(bǔ)充，還可以起到益生素的作用，它作為益生菌對(duì)有害菌起到抑制和排斥作用，能保持正常 的菌群，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，參與消化酶生成及B族維生素的合成，減少氨及有害物 質(zhì)的產(chǎn)生，提高局部免疫力和抗病力；在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面，具有改善水質(zhì)，促進(jìn)生長(zhǎng)，預(yù)防魚病 的作用，對(duì)產(chǎn)量和成活率均有明顯的提高，是優(yōu)質(zhì)的飼料添加劑。
[0003] 沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)方式是利用各種有機(jī)化合物作碳源和電子供體進(jìn)行光照厭 氧生長(zhǎng)，也可好氧黑暗條件下進(jìn)行化能異養(yǎng)生長(zhǎng)。國內(nèi)生產(chǎn)沼澤紅假單胞菌一般采用塑 料桶等，利用沼澤紅假單胞菌在光照厭氧條件下生長(zhǎng)的特性生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，一般7天以 上，沼澤紅假單胞菌的發(fā)酵培養(yǎng)基配方成分的配搭較復(fù)雜，一般需要碳源、氮源、磷源、微量 元素、維生素等幾種或十幾種營養(yǎng)成分，調(diào)節(jié)酸堿度，實(shí)際配制操作過程繁瑣，因此，難以有 效推廣應(yīng)用，滿足不了飼料養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)上的需要，其創(chuàng)新勢(shì)在必行。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004] 本發(fā)明的目的是提供一種利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法， 可有效解決飼用沼澤紅假單胞菌的制備，以滿足飼料養(yǎng)殖業(yè)對(duì)飼料生產(chǎn)的需要。
[0005] 為了實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是提供一種利用白玉米面為原料制 備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，包括以下步驟：
[0006] A.制備菌種，方法是：
[0007] (1)菌種活化，米用沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris)AS1. 2352，將 沼澤紅假單胞菌ASL 2352菌株接入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基液面 上滴加液體石蠟封注液面，在28?30°C下，用40W白熾燈距燈最下端距離15-25cm處照射， 厭氧靜置培養(yǎng)5d?7d，得活化菌種；
[0008] (2)種子培殖，方法是：首先配制種子用培養(yǎng)基，將甘油I. Og、酵母膏I. Og、磷酸氫 二鉀0. 3g，微量元素溶液0. 05mL，維生素溶液0. 15mL，水IOOOmL混合配制成培養(yǎng)基，將培養(yǎng) 基裝入培養(yǎng)皿中，每250ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基lOOmL，在0. IMpa滅菌30min，滅菌后冷卻 至30°C備用；然后，將步驟（1)得到的活化菌種接種于已滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為 每250mL的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的3?5%，在轉(zhuǎn)速80r/min，28?30°C條件下培養(yǎng)60? 72h，得到種子，革蘭氏染色陰性，鏡檢無雜菌，種子液OD 66tl值達(dá)到0. 5以上，沼澤紅假單胞 菌菌數(shù)達(dá)到0. 5 X IO8個(gè)/mL以上；
[0009] B.制備飼用沼澤紅假單胞菌，方法是：
[0010] (1)制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基：白玉米面2. 0g、酵母膏I. Og和水IOOOmL,其中，白玉米 面過0. 42mm孔徑篩，用部分水潤濕，酵母膏再取部分水溶解成酵母膏溶液，然后潤濕的白 玉米面及酵母膏溶液混合均勻加入10L發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加入剩余的水，罐壓控制在0. 1? 0. I IMpa之內(nèi)，在位滅菌30min得滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0011] (2)接種，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，罐內(nèi)壓力減至0? OlMpa以下，接入步驟 A中得到的種子，接種比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的3?5% ;
[0012] (3)發(fā)酵培養(yǎng)，將已冷卻接種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入10L發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng) 基的裝液量為7L，使罐壓保持在0. 03?0. 05Mpa之間，控制調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度28?30°C，攪拌 轉(zhuǎn)速100r/min，通入發(fā)酵罐的無菌空氣流量為I. 5NL/min，發(fā)酵時(shí)間72?96h，得沼澤紅假 單胞菌發(fā)酵液，鏡檢無雜菌，發(fā)酵液OD66tl值達(dá)到1. 5以上，沼澤紅假單胞菌菌數(shù)達(dá)到5 X IO8 個(gè)/mL以上；
[0013] (4)載體吸附，用麩皮為載體，吸附沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，得固體飼用沼澤紅假 單胞囷；
[0014] (5)烘干，在溫度35-50°C下將固體飼用沼澤紅假單胞菌烘干，粉碎：過0. 42mm孔 徑篩，分裝即可。
[0015] 所述的步驟A第（1)步中的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基是由磷酸氫二鉀K2HPO 4 I. 0g， 氯化鈣 CaCl2 0. lg，碳酸氫鈉 NaHCO3 3. 0g，乙酸鈉 CH3COONa I. 0g，氯化鎂 MgCl2 0. 5g，氯 化銨NH4Cl l.Og，氯化鈉 NaCl l.Og，微量元素溶液l.OmL，維生素溶液l.OmL，琥珀酸鈉 1. 〇g，酵母提取物〇. 5g，蛋白胨0. 5g和蒸饋水IOOOmL混合均勻制成的；所述的微量元素 溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl2 ? 4H20 I. 8g，六水合氯化鈷CoCl2 ? 6H20 0. 25g，六水合二 氯化鎳 NiCl2 ? 6H20 0? 01g，二水合氯化銅 CuCl2 ? 2H20 0? 01g，四水合氯化錳 MnCl2 ? 4H20 0. 70g，氯化鋅 ZnCl2 0. lg，硼酸 H3BO3 0. 5g，二水合鑰酸鈉 Na2MoO4 ? 2H20 0. 03g，五水亞硒 酸鈉Na2SeO3 ? 5H20 0. Olg和蒸饋水IOOOmL混合均勻制成的；所述的維生素溶液是由生物 素0. Ig,煙酸0. 35g，鹽酸硫胺素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸0. 2g，鹽酸批多胺0. Ig,泛酸I丐0. lg、 維生素B120. 05g和蒸饋水IOOOmL混合均勻制成的。
[0016] 所述的步驟A第（2)步中的微量元素溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl2 *4H20 I. 8g， 六水合氯化鈷CoCl2，6H20 0.25g，六水合二氯化鎳NiCl2，6H20 O.Olg，二水合氯化銅 CuCl2 ? 2H200. 01g，四水合氯化錳 MnCl2 ? 4H20 0? 70g，氯化鋅 ZnCl2 0? lg，硼酸 H3BO3 0? 5g， 二水合鑰酸鈉 Na2MoO4 ? 2H20 0? 03g，五水亞硒酸鈉 Na2SeO3 ? 5H20 0? Olg和蒸餾水IOOOmL 混合均勻制成的。
[0017] 所述的步驟A第（2)步中的維生素溶液是由生物素0. lg，煙酸0.35g，鹽酸硫胺 素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸0. 2g，鹽酸批多胺0. Ig,泛酸I丐0. lg、維生素B120. 05g和蒸饋水 IOOOmL混合均勻制成的。
[0018] 所述的沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris) ASL 2352來自中國微生 物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心CGMCC，為公知技術(shù)。
[0019] 所述的酵母膏又稱酵母浸膏，酵母提取物，為市售產(chǎn)品。
[0020] 所述的白玉米面為公知技術(shù)，玉米面沒有等級(jí)之分，只有粗細(xì)之別。玉米面含有豐 富的營養(yǎng)素，按顏色區(qū)分有黃玉米面和白玉米面；本發(fā)明使用的是過0.42mm孔徑篩的白玉 米面；我國玉米資源非常豐富，粗磨的白玉米面中含有豐富的營養(yǎng)素，其蛋白質(zhì)、氨基酸、維 生素含量高，還含有豐富的微量元素等，作為發(fā)酵培養(yǎng)基能夠滿足沼澤紅假單胞菌生長(zhǎng)的 需要。每100克白玉米面的營養(yǎng)成分：蛋白質(zhì)8克；脂肪4. 5克；碳水化合物73. 1克；膳食 纖維6. 2克；硫胺素0. 34暈克；核黃素0. 06暈克；煙酸3暈克；維生素E6. 89暈克；興12暈 克；磷187毫克；鉀276毫克；鈉0. 5毫克；鎂111毫克；鐵1. 3毫克；鋅1. 22毫克；硒1. 58 微克；銅〇. 23暈克；猛0. 4暈克。
[0021] 本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：1.發(fā)酵培養(yǎng)基原料主要為白玉米面等資源豐富，價(jià)格低、 簡(jiǎn)單易得；2.發(fā)酵培養(yǎng)基配方簡(jiǎn)單，自動(dòng)液體發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，操作簡(jiǎn)單，培養(yǎng)方便，生長(zhǎng) 速度快，發(fā)酵周期大大縮短，只有72?96h;3.能制備飼用沼澤紅假單胞菌；4.飼用沼澤紅 假單胞菌，應(yīng)用效果好，經(jīng)濟(jì)社會(huì)效益顯著；5.采用我國農(nóng)業(yè)部許可微生物菌株沼澤紅假 單胞菌ASL 2352進(jìn)行發(fā)酵生產(chǎn)，安全性高，是綠色飼用添加劑。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 以下結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作詳細(xì)說明。
[0024] 由附圖給出，本發(fā)明在具體實(shí)施中是由以下步驟實(shí)現(xiàn)的：
[0025] A.制備菌種，方法是：
[0026] (1)菌種活化，米用沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris)ASL 2352，將 沼澤紅假單胞菌ASL 2352菌株接入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基液面 上滴加滅菌的液體石蠟封注液面，在29°C下，用40W白熾燈距燈最下端距離20cm處照射， 厭氧靜置培養(yǎng)6d，得活化菌種；所述的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基的配方為磷酸氫二鉀K 2HPO4 I. 〇g，氯化鈣 CaCl2 0. lg，碳酸氫鈉 NaHCO3 3. 0g，乙酸鈉 CH3COONa I. 0g，氯化鎂 MgCl2 0. 5g，氯化銨NH4Cl I. 0g，氯化鈉NaCl I. 0g，微量元素溶液I. OmL，維生素溶液I. OmL，琥珀 酸鈉I. Og,酵母提取物0. 5g，蛋白胨0. 5g和蒸饋水IOOOmL混合均勻制成的，混合均勻后將 pH調(diào)至6. 8即得；
[0027] (2)種子培殖，方法是：首先配制種子用培養(yǎng)基，將甘油I. 0g、酵母膏I. 0g、磷酸氫 二鉀0. 3g，微量元素溶液0. 05mL，維生素溶液0. 15mL，水IOOOmL混合配制成培養(yǎng)基，混合 均勻后將pH調(diào)至6. 8即得，將培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)皿中，每250ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基IOOmL, 在0. IMpa滅菌30min，滅菌后冷卻至30°C備用；然后,將步驟（1)得到的活化菌種接種于已 滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為每250mL的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的3?5%，在轉(zhuǎn)速為 80r/min旋轉(zhuǎn)式全溫培養(yǎng)搖床上，28?30°C條件下培養(yǎng)66h，得到種子，革蘭氏染色陰性，鏡 檢無雜菌，種子液OD66tl值達(dá)到0. 5以上，沼澤紅假單胞菌菌數(shù)達(dá)到0. 5 X IO8個(gè)/mL以上；
[0028] 所述的微量元素溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl2 ? 4H20 I. 8g，六水合氯化鈷 CoCl2 ? 6H200. 25g，六水合二氯化鎳 NiCl2 ? 6H20 0? Olg，二水合氯化銅 CuCl2 ? 2H20 0? Olg， 四水合氯化錳MnCl2，4H20 0.70g，氯化鋅ZnCl2 O.lg，硼酸H3BO3 0.5g，二水合鑰酸鈉 Na2MoO4 ? 2H20 0. 03g，五水亞硒酸鈉Na2SeO3 ? 5H20 0. Olg和蒸餾水IOOOmL混合均勻制成 的；
[0029] 所述的維生素溶液是由生物素0. lg，煙酸0. 35g，鹽酸硫胺素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸 〇. 2g，鹽酸批多胺0. Ig,泛酸|丐0. lg、維生素B120. 05g和蒸饋水IOOOmL混合均勻制成的；
[0030] B.制備飼用沼澤紅假單胞菌，方法是：
[0031] (1)制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基：白玉米面2. 0g、酵母膏I. Og和水IOOOmL,其中，白玉米 面過0. 42mm孔徑篩，用部分水潤濕，酵母膏再取部分水溶解成酵母膏溶液，然后潤濕的白 玉米面及酵母膏溶液混合均勻加入10L發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加入剩余的水，罐壓控制在0. 1? 0. I IMpa之內(nèi)，在位滅菌30min得滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基；
[0032] (2)接種，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，罐內(nèi)壓力減至0? OlMpa以下，接入步驟 A中的種子，接種比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的4% ;
[0033] (3)發(fā)酵培養(yǎng)，將已冷卻接種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入10L發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng) 基的裝液量為7L，使罐壓保持在0. 03?0. 05Mpa之間，控制調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度28?30°C，攪拌 轉(zhuǎn)速100r/min，無菌空氣通入發(fā)酵罐，調(diào)控?zé)o菌空氣流量使轉(zhuǎn)子流量計(jì)指示I. 5NL/min，發(fā) 酵時(shí)間84h，得沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，鏡檢無雜菌，發(fā)酵液OD66tl值達(dá)到1. 5以上，沼澤紅假 單胞菌菌數(shù)達(dá)到5 X IO8個(gè)/mL以上；
[0034] (4)載體吸附，用麩皮為載體，吸附沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，得固體飼用沼澤紅假 單胞囷；
[0035] (5)烘干，在溫度50°C下將固體飼用沼澤紅假單胞菌烘干，粉碎：過0? 42mm孔徑 篩，經(jīng)檢測(cè)合格后分裝即可。
[0036] 所述的發(fā)酵罐為鎮(zhèn)江東方生物工程設(shè)備技術(shù)有限責(zé)任公司⑶JS-10C自動(dòng)液體發(fā) 酵罐。
[0037] 本發(fā)明采用以下分析方法對(duì)所得沼澤紅假單胞菌AsL 2352的菌數(shù)進(jìn)行測(cè)定：
[0038] A.采用紫外可見光分光光度計(jì)對(duì)沼澤紅假單胞菌ASL 2352發(fā)酵液OD66tl值的測(cè) 定：
[0039] 發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)充分震蕩搖勻后，采用紫外可見光分光光度計(jì)，以培養(yǎng)初期剛接入 菌種的液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，于660nm處測(cè)定的發(fā)酵培養(yǎng)液OD 66tl值。
[0040] B.采用雙層平板計(jì)數(shù)方法對(duì)沼澤紅假單胞菌ASL 2352菌數(shù)含量的測(cè)定：
[0041] 采用雙層平板計(jì)數(shù)方法進(jìn)行。雙層平板計(jì)數(shù)培養(yǎng)基配制，底層固體平板培養(yǎng) 基：NH4Cl I. 0g、K2HPO4 0? 2g、CH3COONa 3. 0g、NaHCO3 I. 0g、酵母膏 0? 2g、NaCl I. 0g、 MgCl2 0. 20g、T.M儲(chǔ)液1.5mL，8.0g瓊脂，蒸餾水lOOOmL，pH 6.8 ;上層固體平板培養(yǎng)基： NH4Cl I. 0g、K2HPO4 0.2g、CH3COONa 3. 0g、NaHCO3 I. 0g、酵母膏 0.2g、NaCl I. 0g、MgCl2 0? 20g、T. M 儲(chǔ)液 I. 5mL，10. Og 瓊脂，蒸餾水 lOOOmL，pH 6. 8 ;其中 T. M 儲(chǔ)液：FeCl3 5. Omg、 CuSO4 ? 5H200. 05mg、H3BO3 I. Omg、MnCl2 ? 5H20 0? 05mg、ZnSO4 ? 7H20 I. Omg、Co (NO3)2 ? 6H20 0? 5mg、蒸饋水 IOOOmL ;
[0042] 稱取沼澤紅假單胞菌菌劑I. Og(mL)，無菌條件下用無菌水采用常規(guī)方法將其稀釋 至1〇'1〇'1〇'分別吸取〇.1!^不同稀釋度的沼澤紅假單胞菌菌液均勻涂布于已倒入培 養(yǎng)皿凝固后的底層固體平板培養(yǎng)基上，置50°C下0. 5h烘去水分后，加入冷卻至50°C的上層 固體平板培養(yǎng)基15mL，凝固后置28?30°C，40瓦白熾燈照射，距燈泡12cm處，光照下培養(yǎng) 5d，選取菌落數(shù)在30?300的培養(yǎng)皿計(jì)算測(cè)定菌落數(shù)。
[0043] 與國內(nèi)外同類技術(shù)比較：沼澤紅假單胞菌是一種兼性光合厭氧細(xì)菌，國內(nèi)外生產(chǎn) 沼澤紅假單胞菌制劑一般采用塑料桶或生物反應(yīng)器，利用沼澤紅假單胞菌在光照厭氧條件 下生長(zhǎng)的特性生產(chǎn)，生產(chǎn)周期長(zhǎng)，一般7天以上，菌體得率低，較難規(guī)?；a(chǎn)，未見大規(guī)模 化生產(chǎn)的報(bào)道。本發(fā)明發(fā)酵培養(yǎng)基配比簡(jiǎn)單，自動(dòng)液體發(fā)酵罐發(fā)酵生產(chǎn)，方法簡(jiǎn)單，易于生 產(chǎn)，費(fèi)用低，生產(chǎn)周期短，應(yīng)用效果好，是綠色的飼用添加劑，并經(jīng)試驗(yàn)取得了滿意的效果， 有關(guān)試驗(yàn)資料如下：
[0044] 1.在畜禽水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用
[0045] (1)在鯉成魚水產(chǎn)養(yǎng)殖上的應(yīng)用
[0046] 試驗(yàn)材料：選擇相鄰的兩口池塘，面積分別為7. 10畝和7. 16畝，相同水源，池深均 為2. 0米，水深1. 5米。魚種采用上年夏花當(dāng)年養(yǎng)成魚為大商品規(guī)格的大規(guī)格二齡建鯉魚 種，投放密度和投放平均規(guī)格分別為1300尾/畝和275g。
[0047] 試驗(yàn)結(jié)果：（1)經(jīng)過59天養(yǎng)殖，在投餌率相同的情況下，試驗(yàn)組飼料中按0. 5%添 加本發(fā)明沼澤紅假單胞菌制劑，共添加15. 25Kg(ll元/Kg)，增加成本167. 75元，總增產(chǎn)量 479. 9Kg，增加產(chǎn)值3119. 36元；對(duì)照組未添加。（2)成活率：試驗(yàn)組比對(duì)照組高4. 1個(gè)百分 點(diǎn)。（3)生長(zhǎng)速度：試驗(yàn)組比對(duì)照組高3. 6個(gè)百分比。
[0048] 表1投放和收獲情況
[0049]
【權(quán)利要求】
1. 一種利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，其特征在于，包括以下 步驟： A. 制備菌種，方法是： (1) 菌種活化，采用沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris)ASl. 2352,將沼澤 紅假單胞菌AS1. 2352菌株接入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基液面上滴 加液體石蠟封注液面，在28?30°C下，用40W白熾燈距燈最下端距離15-25cm處照射，厭氧 靜置培養(yǎng)5d?7d，得活化菌種； (2) 種子培殖，方法是：首先配制種子用培養(yǎng)基，將甘油1. Og、酵母膏1. Og、磷酸氫二鉀 〇. 3g，微量元素溶液0. 05mL，維生素溶液0. 15mL，水lOOOmL混合配制成培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基 裝入培養(yǎng)皿中，每250ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基100mL，在0. IMpa滅菌30min，滅菌后冷卻至 30°C備用；然后，將步驟（1)得到的活化菌種接種于已滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為每 250mL的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的3?5%，在轉(zhuǎn)速80r/min，28?30°C條件下培養(yǎng)60? 72h，得到種子，革蘭氏染色陰性，鏡檢無雜菌，種子液0D_值達(dá)到0. 5以上，沼澤紅假單胞 菌菌數(shù)達(dá)到0. 5X 108個(gè)/mL以上； B. 制備飼用沼澤紅假單胞菌，方法是： (1) 制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基：白玉米面2. 0g、酵母膏1. 0g和水lOOOmL，其中，白玉米面過 0. 42mm孔徑篩，用部分水潤濕，酵母膏再取部分水溶解成酵母膏溶液，然后潤濕的白玉米面 及酵母膏溶液混合均勻加入10L發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加入剩余的水，罐壓控制在0. 1?0. llMpa 之內(nèi)，在位滅菌30min得滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基； (2) 接種，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，罐內(nèi)壓力減至0· OIMpa以下，接入步驟A中 得到的種子，接種比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的3?5% ; (3) 發(fā)酵培養(yǎng)，將已冷卻接種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入10L發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 裝液量為7L，使罐壓保持在0. 03?0. 05Mpa之間，控制調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度28?30°C，攪拌轉(zhuǎn)速 100r/min，通入發(fā)酵罐的無菌空氣流量為1. 5NL/min，發(fā)酵時(shí)間72?96h，得沼澤紅假單胞 菌發(fā)酵液，鏡檢無雜菌，發(fā)酵液〇D66(l值達(dá)到1. 5以上，沼澤紅假單胞菌菌數(shù)達(dá)到5 X 108個(gè)/ mL以上； (4) 載體吸附，用麩皮為載體，吸附沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，得固體飼用沼澤紅假單胞 菌； (5) 烘干，在溫度35-50°C下將固體飼用沼澤紅假單胞菌烘干，粉碎：過0. 42mm孔徑篩， 分裝即可。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，其特 征在于，所述的步驟A第（1)步中的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基是由磷酸氫二鉀K 2HP04 l.Og，氯 化鈣CaCl2 0. lg，碳酸氫鈉 NaHC03 3. 0g，乙酸鈉 CH3C00Na l.Og，氯化鎂MgCl2 0. 5g，氯化銨 NH4C1 1. 0g，氯化鈉 NaCl 1. 0g，微量元素溶液1. OmL，維生素溶液1. OmL，琥珀酸鈉1. 0g，酵 母提取物〇. 5g，蛋白胨0. 5g和蒸饋水1000mL混合均勻制成的； 所述的微量元素溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl2 · 4H20 1.8g，六水合氯化鈷 CoCl2 · 6Η200· 25g，六水合二氯化鎳 NiCl2 · 6Η20 (λ 01g，二水合氯化銅 CuCl2 · 2Η20 (λ 01g， 四水合氯化錳MnCl2,4H20 0. 70g，氯化鋅ZnCl2 0. lg，硼酸Η3Β03 0. 5g，二水合鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H20 0. 03g，五水亞硒酸鈉 Na2Se03 · 5H20 0. 01g和蒸餾水lOOOmL混合均勻制成 的； 所述的維生素溶液是由生物素0. lg，煙酸0. 35g，鹽酸硫胺素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸 〇. 2g，鹽酸批多胺0. lg，泛酸|丐0. lg、維生素 B12 0. 05g和蒸饋水1000mL混合均勻制成的。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，其特 征在于，所述的步驟A第（2)步中的微量元素溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl 2*4H20 1.8g， 六水合氯化鈷C〇C12,6H20 0. 25g，六水合二氯化鎳NiCl2,6H20 0. Olg，二水合氯化銅 CuCl2 · 2Η200· Olg，四水合氯化錳 MnCl2 · 4H20 0· 70g，氯化鋅 ZnCl2 0· lg，硼酸 Η3Β03 (λ 5g， 二水合鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H20 0· 03g，五水亞硒酸鈉 Na2Se03 · 5H20 0· Olg和蒸餾水lOOOmL 混合均勻制成的。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，其 特征在于，所述的步驟A第（2)步中的維生素溶液是由生物素 O.lg，煙酸0.35g，鹽酸硫胺 素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸0. 2g，鹽酸批多胺0. lg，泛酸|丐0. lg、維生素 B12 0. 05g和蒸饋水 1000mL混合均勻制成的。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的利用白玉米面為原料制備飼用沼澤紅假單胞菌的方法，其特 征在于，包括以下步驟： A. 制備菌種，方法是： (1) 菌種活化，采用沼澤紅假單胞菌（Rhodopseudomonas palustris)AS1.2352,將沼 澤紅假單胞菌AS1. 2352菌株接入玻璃培養(yǎng)皿內(nèi)滅菌后的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基 液面上滴加滅菌的液體石蠟封注液面，在29°C下，用40W白熾燈距燈最下端距離20cm處照 射，厭氧靜置培養(yǎng)6d，得活化菌種；所述的ATYP瓊脂液體培養(yǎng)基的配方為磷酸氫二鉀Κ 2ΗΡ04 1. 〇g，氯化鈣 CaCl2 0. lg，碳酸氫鈉 NaHC03 3. 0g，乙酸鈉 CH3C00Na 1. 0g，氯化鎂 MgCl2 0. 5g，氯化銨NH4C1 1. 0g，氯化鈉 NaCl 1. 0g，微量元素溶液1. OmL，維生素溶液1. OmL，琥珀 酸鈉 1. 0g，酵母提取物0. 5g，蛋白胨0. 5g和蒸饋水lOOOmL混合均勻制成的，混合均勻后將 pH調(diào)至6. 8即得； (2) 種子培殖，方法是：首先配制種子用培養(yǎng)基，將甘油l.Og、酵母膏l(xiāng).Og、磷酸氫二 鉀〇. 3g，微量元素溶液0. 05mL，維生素溶液0. 15mL，水lOOOmL混合配制成培養(yǎng)基，混合均 勻后將pH調(diào)至6. 8即得，將培養(yǎng)基裝入培養(yǎng)皿中，每250ml的容積內(nèi)裝入培養(yǎng)基100mL，在 0. IMpa滅菌30min，滅菌后冷卻至30°C備用；然后,將步驟（1)得到的活化菌種接種于已 滅菌冷卻后的培養(yǎng)基中，接種量為每250mL的容積內(nèi)接入培養(yǎng)基重量的3?5%，在轉(zhuǎn)速為 80r/min旋轉(zhuǎn)式全溫培養(yǎng)搖床上，28?30°C條件下培養(yǎng)66h，得到種子，革蘭氏染色陰性，鏡 檢無雜菌，種子液〇D_值達(dá)到0. 5以上，沼澤紅假單胞菌菌數(shù)達(dá)到0. 5 X 108個(gè)/mL以上； 所述的微量元素溶液是由四水合氯化亞鐵FeCl2 · 4H20 1.8g，六水合氯化鈷 CoCl2 · 6Η200· 25g，六水合二氯化鎳 NiCl2 · 6Η20 (λ 01g，二水合氯化銅 CuCl2 · 2Η20 (λ 01g， 四水合氯化錳MnCl2,4H20 0. 70g，氯化鋅ZnCl2 0. lg，硼酸Η3Β03 0. 5g，二水合鑰酸鈉 Na2Mo04 · 2H20 0. 03g，五水亞硒酸鈉 Na2Se03 · 5H20 0. Olg和蒸餾水lOOOmL混合均勻制成 的。 所述的維生素溶液是由生物素0. lg，煙酸0. 35g，鹽酸硫胺素0. 3g，對(duì)氨基苯甲酸 〇. 2g，鹽酸批多胺0. lg，泛酸|丐0. lg、維生素 B12 0. 05g和蒸饋水lOOOmL混合均勻制成的； B. 制備飼用沼澤紅假單胞菌，方法是： (1) 制備液體發(fā)酵培養(yǎng)基：白玉米面2. Og、酵母膏1. Og和水lOOOmL，其中，白玉米面過 0. 42mm孔徑篩，用部分水潤濕，酵母膏再取部分水溶解成酵母膏溶液，然后潤濕的白玉米面 及酵母膏溶液混合均勻加入10L發(fā)酵罐內(nèi)，并補(bǔ)加入剩余的水，罐壓控制在0. 1?0. llMpa 之內(nèi)，在位滅菌30min得滅菌后的液體發(fā)酵培養(yǎng)基； (2) 接種，將液體發(fā)酵培養(yǎng)基冷卻至30°C，罐內(nèi)壓力減至0· OIMpa以下，接入步驟A中 的種子，接種比例為液體發(fā)酵培養(yǎng)基重量的4% ; (3) 發(fā)酵培養(yǎng)，將已冷卻接種的液體發(fā)酵培養(yǎng)基裝入10L發(fā)酵罐中，液體發(fā)酵培養(yǎng)基的 裝液量為7L，使罐壓保持在0. 03?0. 05Mpa之間，控制調(diào)節(jié)發(fā)酵溫度28?30°C，攪拌轉(zhuǎn)速 100r/min，無菌空氣通入發(fā)酵罐，調(diào)控?zé)o菌空氣流量使轉(zhuǎn)子流量計(jì)指示1. 5NL/min，發(fā)酵時(shí) 間84h，得沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，鏡檢無雜菌，發(fā)酵液0D_值達(dá)到1. 5以上，沼澤紅假單胞 菌菌數(shù)達(dá)到5X 108個(gè)/mL以上； (4) 載體吸附，用麩皮為載體，吸附沼澤紅假單胞菌發(fā)酵液，得固體飼用沼澤紅假單胞 菌； (5) 烘干，在溫度50°C下將固體飼用沼澤紅假單胞菌烘干，粉碎：過0. 42mm孔徑篩，經(jīng) 檢測(cè)合格后分裝即可。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104293715SQ201410523952
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月8日
【發(fā)明者】劉德海, 解復(fù)紅, 權(quán)淑靜, 王躍先, 殷圓圓, 韓磊, 郝益民, 馬煥, 謝紅霞, 吳華軍, 楊東杰, 劉海軍, 丁芳, 賈彬, 陳國參 申請(qǐng)人:河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司