一種l-色氨酸發(fā)酵菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)l-色氨酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，公開L-色氨酸發(fā)酵菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法。本發(fā)明所述保藏編號(hào)為CGMCC No.7941的L-色氨酸發(fā)酵菌株具有鄰氨基苯甲酸耐受性。同出發(fā)菌株相比，該菌株具有更好的鄰氨基苯甲酸耐受性，能夠?qū)⒏嗟泥彴被郊姿徂D(zhuǎn)化為色氨酸，以使色氨酸能夠高濃度積累，提高L-色氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，滿足L-色氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。CGMCC No794120130719
【專利說(shuō)明】一種L-色氨酸發(fā)酵菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物領(lǐng)域，具體的說(shuō)是涉及一種L-色氨酸發(fā)酵菌株及其發(fā)酵生產(chǎn) L-色氨酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] L-色氨酸是人體和動(dòng)物生命活動(dòng)必需的氨基酸之一，對(duì)人和動(dòng)物的生長(zhǎng)發(fā)育、新 陳代謝起著重要的作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、食品和飼料等方面。在醫(yī)藥領(lǐng)域，色氨酸是氨基 酸輸液的重要組分和重要的醫(yī)藥中間體。在食品應(yīng)用領(lǐng)域，色氨酸可用于強(qiáng)化食品，提高風(fēng) 味，也可用于面包促進(jìn)發(fā)酵。在飼料添加領(lǐng)域，當(dāng)賴氨酸和蛋氨酸得以滿足之后，色氨酸成 為日糧重要限制性氨基酸，補(bǔ)充外源色氨酸可以提高畜、禽、魚類日糧內(nèi)色氨酸的含量，改 善日糧氨基酸組成和比例，提高日糧蛋白質(zhì)的價(jià)值和利用效率。
[0003] L-色氨酸可由化學(xué)合成法、蛋白質(zhì)水解法，酶促轉(zhuǎn)化法、直接發(fā)酵法、添加前體發(fā) 酵法進(jìn)行生產(chǎn)。
[0004] 早期，研究人員使用葡萄糖作為碳源，同時(shí)添加合成L-色氨酸所需的前體物 (如鄰氨基苯甲酸、吲哚、L-絲氨酸等），利用微生物的色氨酸合成酶系轉(zhuǎn)化前體來(lái)合成 L-色氨酸，這種方法同直接發(fā)酵法一樣，需要解除生物合成途徑中大部分酶所受到的反 饋調(diào)節(jié)，以使L-色氨酸能夠高濃度積累。1987年，Kenzo Yokozkei等以DL-5D引哚-甲 基乙內(nèi)酰脲為原料，利用黃桿菌Flavobacteruim-T523將其分解為L(zhǎng)-色氨酸，可產(chǎn)L-色 氨酸 7.lg/L (KenzoYokozeki et al. , Enzymatic Productionof L-tryptophan from DL-5-IndoIyImethylhydantoin by Mutants of Flavo bacrerium sp. T-523+. Agric. Biol. Chem. 1987,51 (2) :363-369)。1993年，北京的張素珍等研究報(bào)道，通過(guò)對(duì)北京棒桿 菌ASI. 299的誘變選育獲得一株能轉(zhuǎn)化吲哚、L-絲氨酸生產(chǎn)L-色氨酸能力較強(qiáng)的突變株 E298-63,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?5-30g/L，在適宜條件下轉(zhuǎn)化24h即可產(chǎn)L-色氨酸20-30g/L，最高 可達(dá)42. 8g/L，對(duì)底物的轉(zhuǎn)化率為80-90% (張素珍、劉英昊，用北京棒狀桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn) L-色氨酸，微生物學(xué)報(bào)，1993, 33 (1) : 69-73)。
[0005] 目前工業(yè)上較常用以葡萄糖、甘蔗糖蜜等廉價(jià)原料為碳源，利用優(yōu)良的L-色 氨酸生產(chǎn)菌種來(lái)生產(chǎn)L-色氨酸。Berry A在大腸桿菌中高表達(dá)去除反饋抑制的aroG, TrpEDCBA基因，發(fā)酵50小時(shí)，產(chǎn)色氨酸40-45g/L，對(duì)葡萄糖的過(guò)程轉(zhuǎn)化率超過(guò)22% (Barry A, Improving production of aromatic compounds in Escherichia coli by metabolic engineering.Trends Biotechnol, 14:250 - 256, 1996)。Ikeda M 等在產(chǎn)色氨酸的谷氨 酸棒桿菌PIK9960中過(guò)表達(dá)tktA，增加色氨酸合成前體E4P的含量，從而提高色氨酸的 合成產(chǎn)率，發(fā)酵80小時(shí)，色氨酸產(chǎn)量最高可達(dá)到58g/L(Ikead M等，Hyperproduction of tryptophan by corynebacterium glutamicum with the modified pentose phosphate pathway, Applied and environmental microbiology, 1999,51:201-206)〇
[0006] 盡管L-色氨酸的產(chǎn)量已有很大的提高，但仍存在發(fā)酵周期長(zhǎng)、糖酸轉(zhuǎn)化率低導(dǎo)致 生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。主要原因是從葡萄糖到L-色氨酸的生物合成途徑長(zhǎng)，需要多種來(lái)自 不同代謝流路的前體物（如PEP，E4P，L-絲氨酸，谷氨酰胺，PRPP等），尤其是PEP與L-絲 氨酸來(lái)源于EMP途徑，E4P與PRPP來(lái)源于HMP途徑，在強(qiáng)化代謝流路的同時(shí)，不易實(shí)現(xiàn)代謝 平衡。另外，L-色氨酸生物合成途徑中的代謝調(diào)控機(jī)制也比較復(fù)雜，存在多種反饋抑制和 反饋?zhàn)瓒簟＜?xì)菌由葡萄糖合成色氨酸的理論轉(zhuǎn)化率僅為23%左右，經(jīng)過(guò)基因工程改造的色 氨酸生產(chǎn)菌的理論轉(zhuǎn)化率也不超過(guò)35%。現(xiàn)有生產(chǎn)菌對(duì)葡萄糖的糖酸轉(zhuǎn)化率在13-20% 之間（Sprenger GA(2007)Aromatic amino acids. Amino acid biosynthesis-pathway s, regulation and metabolic engineering(VF ffendisch, ed). In: Steinbiichel A(ed) Microbiology monographs. Springer, Berlin)〇
[0007] 鄰氨基苯甲酸是色氨酸合成的中間產(chǎn)物。在以葡萄糖為碳源的培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)菌 利用中央代謝產(chǎn)物PEP與E4P合成DAHP，DAHP經(jīng)莽草酸途徑生成分支酸（CHA)，分支酸經(jīng) 特定的六步酶化學(xué)反應(yīng)合成色氨酸。其中第一步酶促反應(yīng)即由分支酸與谷氨酰胺生成鄰氨 基苯甲酸（ANTA)、丙酮酸及谷氨酸（圖1)。由鄰氨基苯甲酸出發(fā)合成色氨酸避免了合成芳 香環(huán)的高能耗，同時(shí)大大縮短了色氨酸合成路徑，所需底物少，不易代謝失衡生成其他副產(chǎn) 物，細(xì)菌由鄰氨基苯甲酸合成色氨酸的理論轉(zhuǎn)化率大于100%。同時(shí)鄰氨基苯甲酸可由石油 化工產(chǎn)品化學(xué)合成，成本低廉（0. 8-2. 5萬(wàn)元/噸）。因此在糧食短缺，玉米價(jià)格上漲，玉米 淀粉來(lái)源的葡萄糖成本逐步上升的預(yù)期下，由鄰氨基苯甲酸起始合成色氨酸具有經(jīng)濟(jì)可行 性。
[0008] 申請(qǐng)?zhí)枮镃N201010579428. 8的中國(guó)專利采用低流量添加鄰氨基苯甲酸的方式提 高L-色氨酸的產(chǎn)量，初始流加速度為0. 1-0. 3g/L/h，最大流加速度為0. 6-0. 8g/L/h，總添 加量6-8g/L，總產(chǎn)酸47g/L，按等摩爾比計(jì)算，來(lái)源于所添加的鄰氨基苯甲酸的色氨酸占總 產(chǎn)酸的25%。然而鄰氨基苯甲酸的流加量必須掌握在與色氨酸的轉(zhuǎn)化率基本平衡或略有剩 余的情況下，稍有流加不當(dāng)，就會(huì)影響發(fā)酵進(jìn)行。因此，提高色氨酸基因工程菌對(duì)于鄰氨基 苯甲酸的耐受性，獲得鄰氨基苯甲酸的耐受菌，將有利于發(fā)酵生產(chǎn)控制，進(jìn)一步增加鄰氨基 苯甲酸添加量，提高色氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009] 有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供L-色氨酸發(fā)酵菌株及其發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸的 方法，以提高L-色氨酸的產(chǎn)量和生產(chǎn)效率，滿足L-色氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0010] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了一種L-色氨酸發(fā)酵菌株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì) 普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941
[0012] 本發(fā)明同時(shí)提供了保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941L-色氨酸發(fā)酵菌株在生產(chǎn)L-色氨 酸中的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種L-色氨酸的生產(chǎn)方法，將保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色 氨酸發(fā)酵菌株接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵， 發(fā)酵期間添加鄰氨基苯甲酸并維持PH值為4-8。
[0014] 作為優(yōu)選，所述鄰氨基苯甲酸添加量為至終濃度2g/L?5g/L。
[0015] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵期間的pH值為6. 5-7. 0。
[0016] 作為優(yōu)選，所述種子培養(yǎng)基由20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、9. 5g/L ΚΗ2Ρ04、 5. Og/L (MM)2SO4、2· Og/L MgSO4 · 7H20 組成，pH 值為 7· 0-7. 2。
[0017] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由6(^/1葡萄糖、1.(^/1酵母提取物、5.(^/11^2?0 4、 2· 〇g/L 檸檬酸鈉、5· Og/L(NH4)2S04、2. Og/L MgSO4 · 7Η20、0· lg/L MnSO4 · Η20、0· lg/L FeSO4 · 7Η20、0· lg/L ZnSO4 · Η20、0· lg/L CoCl2 · 6Η20、0· 03g/L CuSO4 · 5H20、20g/L 碳酸鈣 組成，pH值為7. 0-7. 2。
[0018] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色氨酸發(fā)酵菌 株具有鄰氨基苯甲酸耐受性。同出發(fā)菌株相比，該菌株具有更好的鄰氨基苯甲酸耐受性，能 夠?qū)⒏嗟泥彴被郊姿徂D(zhuǎn)化為色氨酸，以使色氨酸能夠高濃度積累，提高L-色氨酸的產(chǎn) 量和生產(chǎn)效率，滿足L-色氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0019] 為了更清楚地說(shuō)明本發(fā)明實(shí)施例或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例或現(xiàn) 有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡(jiǎn)單地介紹。
[0020] 圖1示大腸桿菌中芳香族氨基酸生物合成途徑及其調(diào)控（Bongaerts J 等，Metabolic engineering for microbial production of aromatic amino acids and derived compounds. Metabolic Engineering 3:289-300,2001)；
[0021] 圖2示實(shí)施例2出發(fā)菌株和誘變菌株的生長(zhǎng)曲線圖，其中 示出發(fā)菌株SAOl 于M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線圖-·示出發(fā)菌株SAOl于含有鄰氨基苯甲酸（ANTN)的 M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線圖， 示誘變菌株SA16于M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線圖， 示出發(fā)菌株SA16于含有鄰氨基苯甲酸（ANTN)的M9培養(yǎng)基中培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線圖。
[0022] 生物保藏信息說(shuō)明
[0023] 菌株MHZ-0830 :分類命名：大腸埃希氏菌，Escherichia coli于2013年7月19 日保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路 1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941。
【具體實(shí)施方式】
[0024] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述， 顯然，所描述的實(shí)施例僅僅是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的 實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都 屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0025] 為實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0026] 本發(fā)明以色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800為出發(fā)菌株，以亞硝基胍（NTG)為誘變劑對(duì)其進(jìn) 行化學(xué)誘變，然后將經(jīng)誘變后的色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800的懸浮菌液在LB培養(yǎng)基平板上劃 線。挑取單菌落，LB培養(yǎng)基培養(yǎng)后分別涂布在含5g/L鄰氨基苯甲酸的M9培養(yǎng)基平板篩選 出鄰氨基苯甲酸耐受性較好的菌株，命名為菌株MHZ-0830 (pMG43/SA16)。
[0027] 其中，所述色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800為根據(jù)專利WO 87/01130及Mascarenhas D等 所描述的方法（Mascarenhas D等，Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in a genetically engineered strain of escherichia coli.Applied and Environmental Microbiology, 57:2995-2999,1991)構(gòu)建的色氨酸生產(chǎn)菌（CGMCC NO. 6863)，其宿主菌 SAOl 為 E. coli K-12(CICC 10303)衍生的 E. coli K-12CICC 10303tnaA serA，包含質(zhì)粒 PMG43,為pBR322來(lái)源的，包含有serA，及反饋抑制去除aroG和trpEDCBA操縱子的質(zhì)粒。
[0028] 本發(fā)明所述的亞硝基胍（nitrosoguanidin，NTG)屬燒化劑，是一類相當(dāng)有效的化 學(xué)誘變劑，具有一個(gè)或多個(gè)活性烷基，易取代DNA分子中活潑的氫原子，使DNA分子中的堿 基及磷酸部分被烷基化，DNA復(fù)制時(shí)導(dǎo)致堿基配對(duì)錯(cuò)誤而引起突變。
[0029] 對(duì)于上述L-色氨酸發(fā)酵菌株MHZ-0830,本發(fā)明 申請(qǐng)人:已于2013年7月19日保藏 在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址為北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院 3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，其保藏編號(hào)為CGMCCNo. 7941。
[0030] 本發(fā)明所述L-色氨酸發(fā)酵菌株MHZ-0830在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵培 養(yǎng)，較出發(fā)菌株能夠更有效的收集L-色氨酸。
[0031] 本發(fā)明所述L-色氨酸發(fā)酵菌株MHZ-0830與出發(fā)菌株MHZ-0800相比具有更好的 鄰氨基苯甲酸耐受性，在含2-5g/L的鄰氨基苯甲酸的M9培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)，該菌株具有明 顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，發(fā)酵周期縮短，能夠更有效的收集L-色氨酸。表明本發(fā)明所述L-色氨酸發(fā) 酵菌株MHZ-0830能夠應(yīng)用于生產(chǎn)L-色氨酸中，L-色氨酸產(chǎn)量和生產(chǎn)效率提高。因此，本 發(fā)明提供了 L-色氨酸發(fā)酵菌株MHZ-0830在生產(chǎn)L-色氨酸中的應(yīng)用，即保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色氨酸發(fā)酵菌株在生產(chǎn)L-色氨酸中的應(yīng)用。
[0032] 此外，本發(fā)明還提供了一種L-色氨酸生產(chǎn)方法，將保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的 L-色氨酸發(fā)酵菌株接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā) 酵，添加鄰氨基苯甲酸并維持PH值為4-8。
[0033] 其中，作為優(yōu)選，所述發(fā)酵期間鄰氨基苯甲酸在發(fā)酵6hr后添加。
[0034] 作為優(yōu)選，所述發(fā)酵期間鄰氨基苯甲酸添加量為至終濃度2g/L?5g/L。在一些實(shí) 施例為2g/L。在一些實(shí)施例為5g/L。
[0035] 作為優(yōu)選，發(fā)酵期間的pH值為6. 5-7. 0。
[0036] 本發(fā)明所述生產(chǎn)方法可以一直進(jìn)行到不再產(chǎn)生L-色氨酸為止，然后可根據(jù)本領(lǐng) 域常規(guī)方法對(duì)L-色氨酸進(jìn)行分離。
[0037] 對(duì)于擴(kuò)繁用的種子培養(yǎng)基以及發(fā)酵用的發(fā)酵培養(yǎng)基為本領(lǐng)域公知，本領(lǐng)域技術(shù)人 員均可采用合適的培養(yǎng)基進(jìn)行L-色氨酸的發(fā)酵。
[0038] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述種子培養(yǎng)基由20g/L葡萄糖、10g/L酵母提取物、9.5g/L ΚΗ 2Ρ04、5· 0g/L(NH4)2S04、2. 0g/L MgSO4 · 7H20 組成，pH 值為 7. 0-7. 2。
[0039] 作為優(yōu)選，本發(fā)明所述發(fā)酵培養(yǎng)基由60g/L葡萄糖、l.Og/L酵母提取物、5.0g/L ΚΗ 2Ρ04、2· 0g/L 檸檬酸鈉、5. 0g/L(_2S04、2. 0g/L MgSO4 · 7Η20、0· lg/L MnSO4 · Η20、0· lg/ L FeSO4 · 7Η20、0· lg/L ZnSO4 · Η20、0· lg/L CoCl2 · 6Η20、0· 03g/L CuSO4 · 5H20、20g/L 碳酸 鈣組成，pH值為7. 0-7. 2。
[0040] 在一些實(shí)施方案中，所述L-色氨酸生產(chǎn)方法為從凍存管中取L-色氨酸發(fā)酵菌 株MHZ-0830在LB平板上活化，37°C培養(yǎng)18-24hr，將菌體從平板上刮下一環(huán)，接種到裝有 50mL種子培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，37°C，150-240rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)5-10小時(shí)，OD 6tltl控 制在6-10 ;將2mL種子液轉(zhuǎn)接到裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，往復(fù)搖床37°C， 100-180rpm發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中流加稀氨水，控制發(fā)酵液pH值至6. 5-7. 0。在發(fā)酵培養(yǎng) IOhr后，補(bǔ)加鄰氨基苯甲酸至終濃度2g/L或5g/L，直至殘?zhí)呛谋M或發(fā)酵36hr。
[0041] 在另一些實(shí)施方案中，所述LB平板和種子培養(yǎng)基均含有四環(huán)素，所述四環(huán)素的添 加濃度優(yōu)選為10 μ g/mL。
[0042] 由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明所述保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色氨酸發(fā)酵菌 株具有鄰氨基苯甲酸耐受性。同出發(fā)菌株相比，該菌株具有更好的鄰氨基苯甲酸耐受性，能 夠?qū)⒏嗟泥彴被郊姿徂D(zhuǎn)化為色氨酸，以使色氨酸能夠高濃度積累，提高L-色氨酸的產(chǎn) 量和生產(chǎn)效率，滿足L-色氨酸的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。
[0043] 為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。
[0044] 實(shí)施例I :NTG誘變獲得鄰氨基苯甲酸耐受菌株
[0045] 出發(fā)菌株為根據(jù)專利WO 87/01130及Mascarenhas D等所描述的方法 (Mascarenhas D 等，Deletion of pgi alters tryptophan biosynthesis in a genetically engineered strain of escherichia coli. Applied and Environmental Microbiology, 57:2995-2999,1991)構(gòu)建的色氨酸生產(chǎn)菌MHZ-0800 (CGMCC NO. 6863)，其宿 主菌 SAOl 為 E. coli K-12(CICC 10303)衍生的 E. coli K-12 CICC 10303 tnaAserA，包含 質(zhì)粒pMG43,為pBR322來(lái)源的，包含有serA，及反饋抑制去除aroG和trpEDCBA操縱子的質(zhì) 粒。
[0046] 將出發(fā)菌株SAOl在LB平板上劃線，37°C培養(yǎng)16-24hr，從平板上挑取單菌落，接 種到裝有5mL LB培養(yǎng)基的的三角瓶中，37°C，150-240rpm震蕩培養(yǎng)2-6hr，至0D600值在 0· 1-0. 8之間，6000rpm離心5-10min，棄上清，0· 9 %生理鹽水重懸洗漆兩次，6000rpm離 心5-10min，棄上清，終濃度0· l-lmg/ml NTG室溫處理30min，6000rpm離心5-10min，棄上 清，0. 9 %生理鹽水重懸洗滌一次，6000rpm離心5-10min，棄上清，0. 9 %生理鹽水重懸，取 100 μ 1在含5g/L鄰氨基苯甲酸的M9平板上涂布，37°C生長(zhǎng)16-30hr后，挑取有生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的 單菌落保存，共獲得數(shù)百株耐受性菌株。
[0047] LB培養(yǎng)基組分及抗生素添加量為標(biāo)準(zhǔn)濃度，LB液體培養(yǎng)基與LB固體平板的差別 在于瓊脂是否添加。M9培養(yǎng)基組分為標(biāo)準(zhǔn)濃度。詳見《Molecular Cloning A laboratory Manual)) (Sambrook, J. , and Russell D. "Molecular Cloning A laboratory Manual, Third Edition，'，Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001) 〇
[0048] 實(shí)施例2 :NTG誘變菌株的鄰氨基苯甲酸耐受性篩選
[0049] 對(duì)所獲得的誘變菌株在含5g/L鄰氨基苯甲酸的M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，進(jìn)一步驗(yàn) 證其耐受性。將其在LB平板上活化，37°C培養(yǎng)16-24hr，挑取單菌落分別接種到裝有5mL LB 培養(yǎng)基的的三角瓶中，37°C，150-240rpm震蕩培養(yǎng)過(guò)夜，1:50轉(zhuǎn)接到含5g/L鄰氨基苯甲酸 的M9培養(yǎng)基中，37°C，150-240rpm震蕩培養(yǎng)，每4hr測(cè)其OD 6c?值，根據(jù)0D_值繪制各菌株 的生長(zhǎng)曲線。篩選獲得數(shù)十株有顯著生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)的誘變菌，其中耐受性較好菌株SA16,其生長(zhǎng) 曲線如圖2所示。
[0050] 由圖2可見，誘變獲得的菌株SA16較出發(fā)菌株SAOl，在含有5g/L鄰氨基苯甲酸的 培養(yǎng)基內(nèi)具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)。生長(zhǎng)相同時(shí)間后，誘變獲得的菌株SA16 0D600值明顯高于 出發(fā)菌株SA01，約是SAOl的3倍。
[0051] 實(shí)施例3 :鄰氨基苯甲酸耐受性菌株搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸
[0052] 從凍存管中取鄰氨基苯甲酸耐受性菌株菌株SA16在LB平板上活化，制作感受態(tài) 細(xì)胞，將質(zhì)粒PMG43轉(zhuǎn)化鄰氨基苯甲酸耐受性菌株SA16中，獲得數(shù)十株色氨酸生產(chǎn)菌。感 受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法參考《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南III》第1章96頁(yè)。
[0053] 其中工程菌株MHZ-0830(pMG43/SA16)被保藏于中國(guó)微生物菌種保藏中心，保藏 編號(hào)為 CGMCC No. 7941。
[0054] 通過(guò)搖瓶發(fā)酵方法驗(yàn)證其色氨酸生產(chǎn)能力。從凍存管中取E. coli菌株MHZ-0800 和鄰氨基苯甲酸耐受性工程菌株MHZ-0830在LB平板（10 μ g/mL四環(huán)素）上活化，37°C培 養(yǎng)18-24hr，將菌體從平板上刮下一環(huán)，接種到裝有50mL種子培養(yǎng)基（10 μ g/mL四環(huán)素） 的500mL錐形瓶中，37°C，150-240rpm震蕩培養(yǎng)培養(yǎng)5-10小時(shí)，0D600控制在6-10 ;將2mL 種子液轉(zhuǎn)接到裝有20mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL錐形瓶中，往復(fù)搖床37°C，100_180rpm發(fā)酵培 養(yǎng)，每菌株3個(gè)重復(fù)。培養(yǎng)過(guò)程中流加稀氨水，控制發(fā)酵液pH值至6. 5-7.0。直至殘?zhí)呛谋M 或發(fā)酵36hr，發(fā)酵終了還原發(fā)酵液體積至25mL，記錄過(guò)程參數(shù)，測(cè)樣品0D600,并用HPLC的 方法測(cè)定發(fā)酵液色氨酸含量，用生物傳感儀測(cè)定發(fā)酵液葡萄糖含量。結(jié)果見表1。其中發(fā)酵 的種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基的組分如下。
【權(quán)利要求】
1. 一種L-色氨酸發(fā)酵菌株，保藏在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心， 保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941。
2. 保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色氨酸發(fā)酵菌株在生產(chǎn)L-色氨酸中的應(yīng)用。
3. -種L-色氨酸的生產(chǎn)方法，其特征在于，將保藏編號(hào)為CGMCC No. 7941的L-色氨酸 發(fā)酵菌株接種于種子培養(yǎng)基進(jìn)行擴(kuò)繁，然后將擴(kuò)繁后的培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基發(fā)酵，發(fā)酵 期間添加鄰氨基苯甲酸并維持pH值為4-8。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述鄰氨基苯甲酸添加量為至終濃度 2g/L ?5g/L〇
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵期間的pH值為6. 5-7. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基由20g/L葡萄糖、10g/L 酵母提取物、9. 5g/L KH2P04、5. 0g/L(NH4)2S04、2. Og/L MgS04 ? 7H20 組成，pH 值為 7. 0-7. 2。
7. 根據(jù)權(quán)利要求3所述生產(chǎn)方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基由60g/L葡萄糖、1. 0g/ 1^酵母提取物、5.(^/1腿2?04、2.(^/1檸檬酸鈉、5.(^/1(順4) 2504、2.(^/11%504*71120、 0? lg/L MnS04 ? H20、0. lg/L FeS04 ? 7H20、0. lg/L ZnS04 ? H20、0. lg/L CoCl2 ? 6H20、0. 03g/L CuS04 ? 5H20、20g/L 碳酸鈣組成，pH 值為 7. 0-7. 2。
【文檔編號(hào)】C12P13/22GK104388330SQ201410500206
【公開日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年9月26日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月26日
【發(fā)明者】毛賢軍, 趙津津, 吳濤 申請(qǐng)人:廊坊梅花生物技術(shù)開發(fā)有限公司