一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法

一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法
【專利摘要】本發(fā)明為動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，涉及綿羊遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)。一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，包括：根據(jù)綿羊吲哚胺2,3-二氧化酶1(IDO1)基因序列設(shè)計(jì)一對引物；從綿羊血液中提取基因組DNA，利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nhe Ⅰ酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離，根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定；構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型；依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型，選擇AA基因型個(gè)體進(jìn)行組群，完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記。本發(fā)明操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、是一種更有效、準(zhǔn)確的綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，可提高選種的準(zhǔn)確性。
【專利說明】一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于動(dòng)物分子遺傳學(xué)領(lǐng)域，屬于綿羊遺傳育種及分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)， 具體涉及綿羊一般抗病力遺傳標(biāo)記的篩選和應(yīng)用，特別是涉及一種預(yù)示綿羊一般抗病力的 分子標(biāo)記方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 當(dāng)前，綿羊育種的主要目的是根據(jù)特定的育種目標(biāo)，充分提升肉用、毛用等特定 的生產(chǎn)性能，以獲得最大的生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)效益。隨著集約化飼養(yǎng)方式的普及，以及選育程度的 提高，對綿羊重要經(jīng)濟(jì)性狀施加選擇壓的加大，綿羊抗病力隨之降低，導(dǎo)致疾病發(fā)生率的增 力口，尤其是傳染性疾病。目前，對畜禽疾病的控制措施主要采用疫苗接種和抗生素類藥物治 療，然而，由于病菌類型繁多且變異較快，免疫接種、藥物治療、衛(wèi)生隔離等防治手段不能完 全有效控制疾病的流行，抗生素的濫用也會(huì)導(dǎo)致畜禽產(chǎn)品攜帶大量殘留藥物，造成食品污 染，對人類的健康產(chǎn)生不良影響，嚴(yán)重影響現(xiàn)代畜牧業(yè)健康、可持續(xù)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計(jì)，由疾病 造成的經(jīng)濟(jì)損失約占畜牧業(yè)產(chǎn)值的12-15%，這一巨大的經(jīng)濟(jì)損失主要是由于綿羊死亡、生 產(chǎn)效率降低、醫(yī)藥費(fèi)用增加、管理費(fèi)用增加及產(chǎn)品損失造成的。因此，在培育高產(chǎn)綿羊品種 的同時(shí)，尋找一條安全可靠且經(jīng)濟(jì)可行的疾病防治控制途徑已是當(dāng)務(wù)之急。
[0003] 疾病的發(fā)生一般是動(dòng)物的遺傳背景與其環(huán)境之間相互作用的結(jié)果，若綿羊在遺傳 方面對某些疾病存在易感性，采用的治療方法可能不能完全治愈環(huán)境條件所引發(fā)的疾病。 在這種的情況下，抗病育種的作用就顯得尤為重要，針對綿羊的抗病力進(jìn)行選擇性育種已 成為一種更為有效的可取代常規(guī)治療的方法。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同品種、同品種不同個(gè)體之 間存在著抗病力的遺傳差異，這種遺傳差異是由遺傳變異引起的，從而構(gòu)成了機(jī)體對疾病 抗性選擇的遺傳基礎(chǔ)。因此，可以借助現(xiàn)代分子遺傳育種學(xué)方法針對綿羊抗病力進(jìn)行選擇， 以提高機(jī)體的免疫力和抗病力。
[0004] 抗病力也受遺傳和環(huán)境的共同作用，抗病力根據(jù)遺傳基礎(chǔ)的不同可以分為一般抗 病力和特殊抗病力。一般抗病力不限于某一種病原體，它受多基因和環(huán)境共同的影響，病原 體的抗原性差異對一般抗病力的影響很小。特殊抗病力是指綿羊?qū)δ撤N特定疾病或病原體 的抗性，主要受一個(gè)主效基因控制，同時(shí)也可能不同程度的受其它基因位點(diǎn)（包括調(diào)控元 件）和環(huán)境因素的影響，特殊抗病力可以通過特殊病原體直接攻毒試驗(yàn)進(jìn)行測定。由于一 般抗病力體現(xiàn)了機(jī)體對疾病的整體防御能力，是維持機(jī)體在不良環(huán)境中生存和生產(chǎn)的必要 條件，因此確定綿羊一般抗病力的遺傳標(biāo)記已成為培育具有一般抗病力綿羊的關(guān)鍵因素。 研究表明，提1?機(jī)體的整體免疫機(jī)能可以提1? 一般抗病力，因此，機(jī)體的固有免疫在提1? 一 般抗病力中就顯得尤為重要。
[0005] 動(dòng)物在長期的進(jìn)化過程中形成了比較完善的免疫系統(tǒng)，以抵御外來病原微生物的 感染和侵襲，同時(shí)清除體內(nèi)衰老死亡的細(xì)胞，維持機(jī)體穩(wěn)定狀態(tài)。研究表明，免疫應(yīng)答可作 為抗病力的間接指標(biāo)，免疫力強(qiáng)的個(gè)體表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗病力，在明確免疫性狀遺傳特性的 基礎(chǔ)上進(jìn)行多向選育，有望培育出一般抗病力較強(qiáng)的綿羊品種（系）。細(xì)胞因子在機(jī)體免疫 應(yīng)答中發(fā)揮著重要的輔助作用，細(xì)胞因子的分泌水平是機(jī)體免疫應(yīng)答能力和一般抗病力的 重要標(biāo)志。研究表明，IFN-α和IFN-Y具有免疫調(diào)節(jié)和抗病毒、抗腫瘤的作用，在動(dòng)物先 天性免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，能直接反映動(dòng)物正常狀態(tài)下的免疫狀態(tài)。IgG是人和動(dòng)物 血清中含量最高的免疫球蛋白，在動(dòng)物體內(nèi)不僅含量高而且持續(xù)時(shí)間長，可發(fā)揮抗菌、抗病 毒、抗毒素等免疫學(xué)活性。IL-Iβ是單核細(xì)胞-巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的細(xì)胞因子，參與免疫反應(yīng)與 炎癥反應(yīng)。IL-2是體內(nèi)最主要、最強(qiáng)的T細(xì)胞生長因子，是機(jī)體免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的核心物 質(zhì)，在細(xì)胞及體液免疫中均有重要的調(diào)節(jié)作用，可促進(jìn)T細(xì)胞和B細(xì)胞的增殖和分化，促進(jìn) 多種細(xì)胞因子及其受體的表達(dá)。IL-5能夠促進(jìn)B細(xì)胞增殖與分化，誘導(dǎo)IgA的合成。IL-6 能夠促進(jìn)IL-2及其受體的表達(dá)，在免疫應(yīng)答、急性期反應(yīng)、造血調(diào)節(jié)中起重要作用。IL-8具 有趨化作用和炎癥反應(yīng)作用，趨化和激活中性粒細(xì)胞和趨化嗜堿性粒細(xì)胞。IL-IO是一個(gè)抗 炎性因子，參與機(jī)體天然免疫調(diào)節(jié)，可以抑制巨噬細(xì)胞、Thl細(xì)胞分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)B細(xì)胞 增殖和抗體生成，促進(jìn)胸腺和肥大細(xì)胞增殖。IL-12協(xié)同IL-2促進(jìn)細(xì)胞毒T細(xì)胞（TC)、NK 和LaK細(xì)胞分化，誘導(dǎo)Thl細(xì)胞、抑制Th2細(xì)胞和促進(jìn)B細(xì)胞Ig產(chǎn)生，在細(xì)胞免疫和I型細(xì) 胞介導(dǎo)的抗腫瘤免疫中起作用。
[0006] 卩引哚胺2, 3二氧化酶（indoleamine-2, 3_diogenase，ID0)是一種細(xì)胞內(nèi)含亞鐵 血紅素的酶，是肝臟以外唯一可催化色氨酸分子中吲哚環(huán)氧化裂解，是沿犬尿酸途徑分解 代謝的限速酶。近年來，研究發(fā)現(xiàn)，IDO或其相關(guān)代謝產(chǎn)物的表達(dá)細(xì)胞主要分布于胸腺髓 質(zhì)和次級(jí)淋巴器官的T細(xì)胞區(qū)，且都特異性地表達(dá)在巨噬細(xì)胞或樹突狀細(xì)胞（dendritic cells，DC)上。IDO廣泛表達(dá)于免疫系統(tǒng)，包括胸腺、胎盤、消化道粘膜、眼前房、附睪等免疫 耐受或免疫特惠部位，特別在一些抑制性抗原遞呈細(xì)胞上表達(dá)上調(diào)，如某些單核巨噬細(xì)胞 和樹突狀細(xì)胞（DC)的亞群。在移植免疫的研究中，IDO對T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞、巨噬細(xì) 胞和樹突狀細(xì)胞均有免疫調(diào)節(jié)作用。IDO的表達(dá)可以降低機(jī)體的免疫應(yīng)答反應(yīng)，保護(hù)細(xì)胞和 組織移植物，參與同種異體移植免疫耐受，在維持周邊免疫耐受、自身免疫性疾病、器官移 植、腫瘤免疫和妊娠免疫中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。
[0007]IDO廣泛分布于人和其他哺乳類動(dòng)物肝外組織，正常狀態(tài)下呈低水平表達(dá)，在炎癥 或感染過程中，IDO的表達(dá)顯著增加。細(xì)胞因子Y-干擾素（IFN-Y)是最強(qiáng)的IDO表達(dá)誘 導(dǎo)物，腫瘤壞死因子a(TNF-α)、腫瘤壞死因子β(TNF-β)與脂多糖（LPS)也能在一定程 度上誘導(dǎo)IDO的產(chǎn)生。
[0008] 目前，國內(nèi)外主要開展了人類IDO基因的多態(tài)性與疾病的抗性/易感性的相關(guān) 研究，證明IDO基因rs9657182位點(diǎn)與高加索人IFN-α誘導(dǎo)的抑郁癥有關(guān)。IDO基因 IVS3+562delC、IVS6+61G-A和IVS9+2431G-A位點(diǎn)突變不是導(dǎo)致伊朗人重復(fù)自發(fā)性流 產(chǎn)的原因。IDO基因的突變影響Treg功能，能誘發(fā)自身免疫性疾病。而對于IDO基因的多 態(tài)性與綿羊疾病的抗性/易感性的相關(guān)研究沒有報(bào)道。
[0009]近年來，基因SNP檢測方法和相關(guān)儀器的研發(fā)進(jìn)展很快，已報(bào)道并建立了多種SNP檢測方法。Taqman方法是針對SNP位點(diǎn)變異設(shè)計(jì)特異性的探針，探針標(biāo)記成本較高，導(dǎo)致 檢測成本也較高。DHPLC技術(shù)和質(zhì)譜分析均需要用到高效液相色譜儀與質(zhì)譜儀，設(shè)備昂貴， 難以大規(guī)模應(yīng)用。單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析（SSCP)技術(shù)很難滿足自動(dòng)化的需要，難以大規(guī)模應(yīng) 用。等位基因特異的寡聚核苷酸雜交（ASO)目前已很少使用。DNA芯片由于高通量等優(yōu)點(diǎn) 在SNP檢測中得到大量應(yīng)用，但在進(jìn)行多位點(diǎn)同時(shí)檢測時(shí)條件難以控制、可重復(fù)性差，易出 現(xiàn)假陽性及假陰性結(jié)果。微測序作為一種基于陣列的突變分析，目前還面臨著如何降低假 陰性率和祀核苷酸序列組成的變異等關(guān)鍵問題。高溫連接酶檢測反應(yīng)（ligasedetection reaction,LDR)是近幾年的一種新型基因多態(tài)性檢測方法，結(jié)果可靠，但還需進(jìn)一步驗(yàn)證。 SNaPshot法基于熒光標(biāo)記單堿基延伸原理的分型技術(shù)，通常適用于10-30個(gè)SNP位點(diǎn)分析。 DNA測序法相對準(zhǔn)確，價(jià)格較貴。高分辨率熔解曲線法（HRM)是近幾年興起的SNP研究工具 該方法，無需設(shè)計(jì)探針，成本低，但結(jié)果準(zhǔn)確度較低。而限制性片段長度多態(tài)性（RFLP)檢測 準(zhǔn)確性高，費(fèi)用低，特別適合單位點(diǎn)的檢測。因此，本專利針對IDOl基因的多態(tài)性位點(diǎn)，建 立一種能準(zhǔn)確預(yù)測綿羊一般抗病力的PCR-RFLP分子標(biāo)記選擇方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的在于提供一種操作方便、經(jīng)濟(jì)實(shí)用、更為有效、準(zhǔn)確的綿羊一般抗病 力的分子標(biāo)記方法，為提高綿羊一般抗病力和免疫應(yīng)答能力提供了一種有效的分子標(biāo)記育 種手段，可輔助選育適應(yīng)性和抗病力強(qiáng)的優(yōu)質(zhì)種羊，加速育種進(jìn)程，提高選種的準(zhǔn)確性。 [0011] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0012] 一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征主要包括以下步驟：
[0013] (1)所述根據(jù)綿羊吲哚胺2, 3-二氧化酶I(IDOl)基因序列設(shè)計(jì)一對引物：
[0014] INF: 5 ' -TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3 ' ；
[0015] INR: 5 '-CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTA@TAG-3 ' ；
[0016] 為符合force-RFLP的檢測分析，根據(jù)限制性內(nèi)切酶NheI識(shí)別序列GCTAGC，在下 游引物INR中強(qiáng)制引入GC堿基突變，即IDOl基因編碼區(qū)1076和1077位的AA兩個(gè)堿基 突變?yōu)镚C堿基，引入的突變堿基以框表示，從而形成NheIforced-RFLP-PCR檢測分析。 IDOl基因外顯子9的引物INF如序列表中SEQIDNO: 1所示，引物INR如序列表中SEQID N0:2所示；
[0017] (2)從綿羊血液中提取基因組DNA，利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
[0018] (3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶NheI酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳 分離，根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定，基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)為：電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為 232bp，則綿羊IDOl基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)發(fā)生突變，PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶NheI 切開，將其命名為AA基因型；電泳呈現(xiàn)兩條帶，大小為232bp和191bp，則綿羊IDOl基因編 碼區(qū)1072位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶NheI完全切開，將其命名為 AG基因型；電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為191bp，則綿羊IDOl基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)無突變，PCR 產(chǎn)物能被限制性內(nèi)切酶NheI完全切開，將其命名為于GG基因型；
[0019] (4)根據(jù)實(shí)驗(yàn)綿羊群體特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型：Υ=μ+G+B+A+S+F+e，其 中μ為群體均值，G為基因型效應(yīng)，B為品種效應(yīng)，A為年齡效應(yīng)，S為性別效應(yīng)，F(xiàn)為場別 效應(yīng)，e為隨機(jī)誤差；利用JMP4. 0統(tǒng)計(jì)軟件將基因型效應(yīng)與綿羊免疫指標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分 析，并估計(jì)性狀的最小二乘均值，分析結(jié)果表明，IDOl基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)突變引起的基 因型效應(yīng)與綿羊外周血中IFN-α、IL-2和IL-12水平極顯著相關(guān)（P〈0. 01);多重比較結(jié)果 表明，AA和AG基因型個(gè)體的IFN-α和IL-2水平均極顯著高于GG基因型個(gè)體，AA基因型 個(gè)體的IL-12水平極顯著高于AG和GG基因型個(gè)體；
[0020] (5)依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型，選擇AA基因型個(gè)體進(jìn)行組群，從而實(shí) 現(xiàn)綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記輔助育種，即完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法；
[0021] 其中步驟⑵中PCR擴(kuò)增條件為94 °C變性5min;94°C30sec，60°C30sec， 72°C30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min;4°C保溫。
[0022] 其中步驟（3)中限制性內(nèi)切酶NheI所識(shí)別的堿基序列為GCTAGC。
[0023] 所述瓊脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5% -3%。
[0024] 本發(fā)明為從抗病育種方面提高綿羊一般抗病力和免疫應(yīng)答提供了有效的分子標(biāo) 記。
[0025] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在：
[0026] (1)本發(fā)明為綿羊抗病育種工作的分子標(biāo)記輔助選擇提供了一個(gè)更加高效、準(zhǔn)確 的分子遺傳標(biāo)記，為提高綿羊一般抗病力提供了一種有效的分子標(biāo)記育種手段，用該遺傳 標(biāo)記對綿羊一般抗病力進(jìn)行標(biāo)記輔助選擇，開展綿羊的抗病育種，提高綿羊的免疫應(yīng)答能 力，可以更加有效的減少綿羊遺傳性疾病的發(fā)生，降低諸多疾病的發(fā)病率，提高綿羊的環(huán)境 適應(yīng)性，增加放牧和舍飼養(yǎng)殖條件下的綿羊存活率。
[0027] (2)使用1個(gè)變異位點(diǎn)作為標(biāo)記，應(yīng)用forcedPCR-RFLP為主要檢測方法，具有成 本低、實(shí)用性強(qiáng)、準(zhǔn)確性高、更易操作的優(yōu)點(diǎn)，為加速改善綿羊的抗病分子遺傳育種工作奠 定了基礎(chǔ),從而加快育種進(jìn)程。
[0028] (3)本發(fā)明的檢測方法操作簡單，檢測費(fèi)用低，準(zhǔn)確性高，并可以實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化的直 接檢測，本發(fā)明將在綿羊的抗病育種中發(fā)揮重要作用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0029] 圖1為IDOl基因PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中M為pUC19DNA/MspI(Hpa II)marker，C泳道為空白對照；1-7泳道為不同綿羊個(gè)體IDOl基因PCR產(chǎn)物。
[0030] 圖2為IDOl基因PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切，酶切產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電 泳圖；其中M為pUC19DNA/MspI(HpaII)marker，第 1，3,7,9，12，15泳道為66基因型； 第4,8,10,14泳道為AG基因型；第2, 5,6,11，13,16泳道為AA基因型。

【具體實(shí)施方式】
[0031] 實(shí)施例：下面實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)地描述：
[0032] 一、綿羊IDOl基因第9外顯子變異位點(diǎn)的檢測分析
[0033] 1、樣品采集
[0034] 采用一次性注射器從綿羊頸靜脈抽取約ImL的血液，注入經(jīng)高壓滅菌并裝有約 2004 1^2%無菌EDTA(Ethylenediaminetetraaceticacid，EDTA)抗凝劑的 1.5mL離心管 中，輕輕搖勻，記錄羊號(hào)，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0035] 2、藥品和酶
[0036] 三輕甲基氨基甲燒（Tris),SigmaChemicalsCo;Tris飽和酚、EDTA-Na2 北京鼎 國生物技術(shù)發(fā)展中心；蛋白酶K(ProteinaseK),MERCKCo;dNTP(dATP;dTTP;dCTP;dGTP)、 Taq酶（配套IOXTaqbuffer, 25mmol/LMg2+)，大連寶生物公司；瓊脂糖（AgaroseH)、 pUC19DNA/Msp(HpaII)Marker，生工生物工程（上海）有限公司；限制性內(nèi)切酶NheI， Fermentas(MBI)公司。
[0037] 3、主要儀器
[0038] IcyclerPCR儀（Bio-Rad公司）、Gel2000 凝膠成像系統(tǒng)、UltrospeclOOO紫外分 光光度計(jì)、Sigma3K30高速冷凍離心機(jī)、Milli-Q超純水儀、Bio-Rad穩(wěn)壓電泳儀及配套電泳 槽。
[0039] 4、引物的設(shè)計(jì)與合成
[0040] 根據(jù)綿羊IDOl基因（GenBank登錄號(hào)：NM_001141953)第9外顯子序列以及限制 性內(nèi)切酶NheI識(shí)別序列GCTAGC，設(shè)計(jì)上游引物INF和下游引物INR，引物由生工生物工程 (上海）有限公司合成：
[0041] INF: 5，-TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3，；
[0042] INR: 5 ' -CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTAGCTAG-3 '。
[0043] 5、綿羊基因組DNA的小量提取
[0044] 方法一：
[0045] (1)取20μL抗凝血液，加入500μL血細(xì)胞裂解液，加入蛋白酶K至終濃度為 100-200μg/mL，混勻55°C消化12h，直至溶液中不再有粘稠的團(tuán)塊。
[0046] (2)將溶液冷卻至室溫，加入5MNaCl至終濃度I. 5M，混勻lOmin。加入等體積酚 /氯仿，反復(fù)顛倒離心管混勻lOmin。
[0047] (3) 12,OOOrpm，室溫離心lOmin。取上清，加等體積氯仿混勻lOmin。
[0048] (4) 12,OOOrpm，室溫離心lOmin。取上清2倍體積無水乙醇沉淀DNA。
[0049] (5)將DNA挑出放到I. 5mL離心管中，用70%乙醇洗1次。
[0050] (6) 7, 5OOrpm,室溫離心δη?η，棄上清。
[0051] (7)將DNA干燥后溶于200μLTE中。
[0052] 方法二：
[0053] (1)將20μL全血加入裝有700μLIXSET的I. 5mL離心管中，輕輕混勻。
[0054] (2)加入蛋白酶K(10mg/mL)至終濃度100-200μg/μL和10%的SDS至終濃度 0· 5%，55°C消化 12h。
[0055] (3)待消化完全后，加入等體積的Tris飽和酚，來回顛倒，使其混勻。
[0056] (4) 12,OOOrpm離心lOmin，用剪去尖端的吸頭將上層水相小心移入另一個(gè)離心管 中，棄去有機(jī)相。重復(fù)第三和第四步驟一次。
[0057] (5)向水相中加入等體積的酚、氯仿、異戊醇混合液（體積比為24 :23 :1)，混合 lOmin。12,OOOrpm,離心IOmin,移出水相到另一個(gè)離心管。
[0058] (6)向水相中加入等體積的氯仿、異戊醇混合液（23 :1)，來回顛倒混合lOmin， 12,OOOrpm，離心lOmin，移出水相到另一個(gè)離心管。
[0059] (7)向水相中加入1/10體積NaAc(3M，pH5. 2)和2倍體積的無水乙醇，來回顛倒， 沉淀DNA。
[0060] (8)將DNA挑出放到I. 5mL離心管中，用70%乙醇洗1次。
[0061] (9)7, 500rpm離心5min。小心倒掉管中乙醇，將倒置在濾紙上，讓乙醇流盡，置于 空氣中干燥。
[0062] (10)加入200yL的TE，置50°C水浴中過夜溶解DNA。溶解后貯存于-20°C備用。
[0063] 方法三：
[0064] 根據(jù)生工生物工程（上海）有限公司的Ezup柱式基因組DNA抽提試劑盒說明書 (SK8252)或其他生物技術(shù)公司的基因組DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行操作。
[0065] 6、PCR反應(yīng)
[0066] (1)以綿羊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，目的基因PCR產(chǎn)物大小為232bp。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物中綿羊基因組序列如SEQ3所示。
[0067] 25μL反應(yīng)體系中包含以下溶液或試劑：
[0068] IOXPCRreactionbuffer 2. 5μL dNTPMixture(各 2. 5mM) 2. 0μL 引物INF(10μΜ) 0.5UL 引物INR(10μΜ) 0.5PL EX-Taq(5U/μL) 0. 25μL
[0069] 去禺子水 18. 25μL 基因組DNA(50ng/uL) LOpL
[0070] (2)將上述溶液混合并按以下條件進(jìn)行PCR反應(yīng)。
[0071] MO變性5min;94°C3〇sec，6(TC3〇sec，72°C3Osec,35 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 5min。
[0072] (3)反應(yīng)結(jié)束后，使用2 %瓊脂糖凝膠對PCR產(chǎn)物（5?10μL)進(jìn)行電泳檢測，電 泳結(jié)果見圖1。
[0073] 7、IDOl基因的RFLP分析
[0074] 應(yīng)用Fermentas(MBI)限制性內(nèi)切酶NheI進(jìn)行酶切，酶切體系為10μL，反應(yīng)體 系及條件如下：
[0075] NheI內(nèi)切酶（IOU/μL) 0. 5μL IOXBufferTangoIpL PCR產(chǎn)物 5μL 加去離子水至 IOuL
[0076] 將上述反應(yīng)液混勻，于37°C水域中消化3?5h，消化之后將全部反應(yīng)液進(jìn)行2. 5% 瓊脂糖凝膠電泳，檢測PCR產(chǎn)物酶切效果及片段多態(tài)性。
[0077] 8、IDOl基因變異位點(diǎn)的分析
[0078] IDOl基因232bp的PCR產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶NheI酶切，經(jīng)2. 5 %瓊脂糖凝膠電 泳分離，檢測出IDOl基因外顯子中的C. 1072G>A的堿基轉(zhuǎn)換變異位點(diǎn)，根據(jù)酶切電泳圖譜 對不同基因型綿羊個(gè)體進(jìn)行命名，分別為AA基因型（232bp)、AG基因型（232bp和191bp) 和GG基因型（191bp)三種基因型（圖2)。
[0079] 二、綿羊一般抗病力指標(biāo)的測定：
[0080] 采集不同品種健康的343只10月齡羔羊前腔靜脈血2mL，其中薩福克羊62只 (26?，36早），多胎薩?？搜?18只（36?，82早），哈薩克羊64只（25?，39早），湖羊 59只（13?，46早），多胎薩福克羊和哈薩克羊Fl雜交羔羊40只（以下簡稱薩哈Fl;7古， 33早）。常規(guī)方法分離血清，于2500r/min離心15min，取上清分裝。應(yīng)用綿羊IgG、IFN-a、 IFN-γ、IL-Iβ、IL-2、IL-5、IL-6、IL-8、IL-10 和IL-12ELISA檢測試劑盒（上海藍(lán)基生 物科技有限公司，中國）進(jìn)行免疫應(yīng)答指標(biāo)測定，嚴(yán)格按照試劑盒說明書處理血清樣本，將 標(biāo)準(zhǔn)品做5個(gè)濃度稀釋梯度，在酶標(biāo)儀（Model550,美國Bio-Rad) 450nm波長處檢測吸光度 (0D值），然后根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算血清中IgG、IFN-α、IFNi、IL-Ιβ、IL-2、IL-5、IL-6、 IL-8、IL-10 和IL-12 的濃度。
[0081] 三、綿羊IDOl基因第9外顯子多態(tài)性及其與一般抗病力指標(biāo)間的關(guān)系分析及抗性 標(biāo)記確定。
[0082] 分別對薩?？搜颉⒍嗵ニ_?？搜颉⒐_克羊、湖羊和薩哈Fl綿羊IDOl基因第9外 顯子PCR-RFLP帶型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，并進(jìn)行基因型頻率和等位基因頻率的計(jì)算（表1)。
[0083] 表1綿羊IDOl基因C. 1072G>A位點(diǎn)的基因型頻率和基因頻率
[0084]

【權(quán)利要求】
1. 一種預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征主要包括以下步驟： (1) 根據(jù)綿羊吲哚胺2, 3-二氧化酶1 (ID01)基因序列設(shè)計(jì)一對引物： INF:5' -TGCTGCTGAATTTCTCCAGG-3' ； INR:5, -CACCTTGGATTGCCGGCTTGCAGGAATCATGATGTAGCTAG-3,； (2) 從綿羊血液中提取基因組DNA，利用上述引物INF和引物INR對綿羊的基因組DNA 進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶Nhe I酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分 離，根據(jù)電泳分離結(jié)果進(jìn)行基因型判定，基因型判定的標(biāo)準(zhǔn)為：電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為 232bp，則綿羊ID01基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)發(fā)生突變，PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶Nhe I 切開，將其命名為AA基因型；電泳呈現(xiàn)兩條帶，大小為232bp和191bp，則綿羊ID01基因編 碼區(qū)1072位點(diǎn)處于雜合狀態(tài)，PCR產(chǎn)物不能被限制性內(nèi)切酶Nhe I完全切開，將其命名為 AG基因型；電泳呈現(xiàn)一條帶，大小為191bp，則綿羊ID01基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)無突變，PCR 產(chǎn)物能被限制性內(nèi)切酶Nhe I完全切開，將其命名為于GG基因型； (4) 根據(jù)實(shí)驗(yàn)綿羊群體特點(diǎn)，構(gòu)建基因型效應(yīng)統(tǒng)計(jì)模型：Y= y+G+B+A+S+F+e，其中y 為群體均值，G為基因型效應(yīng)，B為品種效應(yīng)，A為年齡效應(yīng)，S為性別效應(yīng)，F(xiàn)為場別效應(yīng)， e為隨機(jī)誤差；利用JMP4. 0統(tǒng)計(jì)軟件將基因型效應(yīng)與綿羊免疫指標(biāo)性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，并 估計(jì)性狀的最小二乘均值，分析結(jié)果表明，ID01基因編碼區(qū)1072位點(diǎn)突變引起的基因型效 應(yīng)與綿羊外周血中IFN-a、IL-2和IL-12水平極顯著相關(guān)（P〈0.01);多重比較結(jié)果表明， AA和AG基因型個(gè)體的IFN- a和IL-2水平均極顯著高于GG基因型個(gè)體，AA基因型個(gè)體的 IL-12水平極顯著高于AG和GG基因型個(gè)體； (5) 依據(jù)基因型將綿羊群體分為三種類型，選擇AA基因型個(gè)體進(jìn)行組群，從而實(shí)現(xiàn)綿 羊一般抗病力的分子標(biāo)記輔助育種，即完成綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記。
2. 如權(quán)利要求1所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征在于其中步驟 (2)中 PCR擴(kuò)增條件為 94°C變性 5min ;94°C 30sec，60°C 30sec，72°C 30sec，35 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸5min ;4°C保溫。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征在于其中步 驟⑶中限制性內(nèi)切酶Nhe I所識(shí)別的堿基序列為GCTAGC。
4. 如權(quán)利要求1或2所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征在于所述瓊 脂糖凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%?3%。
5. 如權(quán)利要求3所述的預(yù)示綿羊一般抗病力的分子標(biāo)記方法，其特征在于所述瓊脂糖 凝膠電泳分離酶切產(chǎn)物，所使用的瓊脂糖凝膠濃度為2. 5%?3%。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104357548SQ201410498552
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2014年9月25日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月25日
【發(fā)明者】楊華, 楊永林, 鐘發(fā)剛, 趙文娟, 康立超 申請人:新疆農(nóng)墾科學(xué)院