一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑及其制備方法

一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑及其制備方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑及其制備方法，屬于益生菌制備【技術(shù)領(lǐng)域】。所述益生菌劑是由糞腸球菌HEW-A131活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保護劑按質(zhì)量比0.1-0.8∶1-2.5∶0.1-0.5∶1均勻混合，經(jīng)制粒、干燥、包被等工藝制備而成；所述益生菌劑不但可以提高動物的飼料利用效率，節(jié)約成本，而且大大改善了動物體內(nèi)消化道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進營養(yǎng)的吸收利用，促進動物生長，顯著提高了動物的生產(chǎn)性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟效益。
CGMCC NO9353
2014.06.17
【專利說明】一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑及其制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及雞飼料益生菌劑，具體是一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑及其制備 方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在現(xiàn)代飼養(yǎng)業(yè)中，飼料中添加抗生素始于五十年代，對防治疾病，促進生長，節(jié)省 飼料，提高養(yǎng)殖經(jīng)濟效益起到重要作用。但是，隨著飼料中長期大量地添加抗生素及化學(xué)合 成藥物，在養(yǎng)殖生產(chǎn)中出現(xiàn)了動物體內(nèi)病原微生物產(chǎn)生耐藥性，應(yīng)用效果降低，生產(chǎn)成本加 大；動物體內(nèi)產(chǎn)生藥物依賴，自身的免疫機能抑制，免疫力和抗病力降低；動物體內(nèi)有益菌 被抑制，菌群失調(diào)，形成內(nèi)源性感染；動物產(chǎn)品及排泄物藥物殘留，危及人體健康；動物體 內(nèi)耐藥菌的擴散，引起公共安全等重大問題，亟待解決。
[0003] 因此，從八十年代始，有關(guān)益生菌在養(yǎng)殖業(yè)的應(yīng)用研究快速發(fā)展。目前，國內(nèi)外益 生菌研究涉列有益菌80余個品種。我國頒布的《飼料添加劑品種目錄（2006)》準(zhǔn)予使用菌 共有16個。國內(nèi)市場推廣的芽孢桿菌制劑有促菌生、整腸生、抑菌生、乳康生等；乳酸菌制 劑以乳酸菌屬和雙歧桿菌屬為主。益生菌作為一種新型天然的生物活性添加劑，無毒，無抗 藥性，無殘留，并具有增強免疫力，促進生長，提高飼料利用率的功效，替代抗生素應(yīng)用養(yǎng)殖 生產(chǎn)中。
[0004] 乳酸菌是一類重要的益生菌，是動物腸道中一類重要的優(yōu)勢菌群。乳酸菌制劑作 為一種新型的綠色動物微生態(tài)制劑，因其無毒、無抗藥性、無殘留、無副作用而備受飼料界 的廣泛關(guān)注。采用乳酸菌作為益生菌飼喂動物，除了由于乳酸菌具有一定的營養(yǎng)作用和對 腸道的粘附作用外，主要在于乳酸菌對于一些腐敗菌和有害菌具有抑制作用。第一，乳酸菌 可以產(chǎn)生乳酸，創(chuàng)造酸性環(huán)境抑制有害菌及不耐酸的腐敗菌生長；第二，乳酸菌產(chǎn)生H 2O2, 激活過氧化氫酶-硫氰酸系統(tǒng)，抑制和殺滅革蘭氏陰性菌、過氧化氫酶陽性細菌等；第三， 部分乳酸菌可以產(chǎn)生抑菌性的細小蛋白質(zhì)或肽類，稱為細菌素，對大腸桿菌等致病菌有拮 抗作用。而且，有了產(chǎn)生抑菌蛋白的乳酸菌，就可以生產(chǎn)細菌素，可以替代抗生素，使動物生 產(chǎn)更安全。分離篩選可以產(chǎn)生細菌素的乳酸菌成為現(xiàn)在益生菌開發(fā)的研究熱點。
[0005] 糞鏈球菌又叫糞腸球菌（Enterococcus faecalis)，是乳酸菌中的一種，其菌體形 態(tài)為鏈球或球狀，菌體直徑大小〇. 3 y m?0. 7 y m，無芽孢；稀釋后在肉湯瓊脂平板上形成 的菌落圓形、乳白色，表面凸起濕潤，有光澤，邊緣整齊，大多數(shù)成雙或短鏈狀排列，通常不 運動。糞鏈球菌是目前微生物青貯接種劑主要菌種之一，它經(jīng)過系列工藝制成的微生物制 劑直接投喂養(yǎng)殖動物后，有利于改善腸道內(nèi)微生態(tài)平衡，防治動物腸道菌叢區(qū)系紊亂，還 能分解蛋白質(zhì)為小肽、合成B族維生素等功效。它也能增強巨嗜細胞的活性，促進動物的免 疫反應(yīng)，提高抗體水平。糞鏈球菌的生理特性有如下幾點：（1)糞鏈球菌分泌的乳酸為L型 乳酸，又稱為自然乳酸或生理乳酸，可全被動物吸收利用。乳酸桿菌分泌的乳酸L型和D型 都有，但D型則不能被動物吸收利用。在動物的腸道里。糞鏈球菌可在腸內(nèi)形成生物薄膜 附著在腸道粘膜上，可以在腸道內(nèi)發(fā)育、生長、繁殖，繁殖時問很短，19min分裂一次。糞鏈 球菌還可把部分蛋白質(zhì)分解成酰胺和氨基酸，把大部分的碳水化合物的無氮浸出物轉(zhuǎn)化為 乳酸，而且能使飼料里的纖維變軟，所以飼料的轉(zhuǎn)化吸收率就比較高。糞鏈球菌分解的這些 特殊營養(yǎng)成分彌補了常規(guī)餌料的營養(yǎng)缺陷，對各種養(yǎng)殖動物幼體起到了十分重要的營養(yǎng)強 化和促生長作用。（2)糞鏈球菌產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)大多是肽或蛋白質(zhì)，被稱為細菌素。糞鏈 球菌可分泌兩類細菌素，一類僅只是對相關(guān)的菌有抑制作用，抗菌譜較窄，可阻礙病原微生 物接觸腸粘膜細胞；另一類具有廣譜抗菌活性，它們對致病菌如：沙門氏菌、致賀氏病和假 單孢菌都有很好的抑制作用。所以，長期在飼料中添加糞鏈球菌可以減少養(yǎng)殖動物腸炎等 疾病的發(fā)生。糞鏈球菌在生長和代謝過程中產(chǎn)生對養(yǎng)殖動物有益的營養(yǎng)物質(zhì)，如乳酸、氨基 酸、維生素、酶及抑菌物質(zhì)。在畜禽養(yǎng)殖過程中，添加了糞鏈球菌不僅有利于提高飼料的消 化率，同時也相應(yīng)降低了排泄物中的氨態(tài)氮的濃度，減少了排泄物的不消化物，改善了飼養(yǎng) 環(huán)境，減少了污染，既有防腐作用又增加飼料的風(fēng)味，促進養(yǎng)殖動物的食欲。（3)由于飼料中 餅柏、麥麩等農(nóng)副產(chǎn)品中的植酸磷含量較高，對鈣等礦物質(zhì)元素利用造成影響，而在糞鏈球 菌的生理作用下通過催化、水解等反應(yīng)分泌出的L-乳酸，它可以對鈣質(zhì)合成L-乳酸鈣，促 進養(yǎng)殖動物對鈣質(zhì)的吸收。所以飼料中添加糞鏈球菌可減少養(yǎng)殖中有機物和礦物質(zhì)排泄量 有效地減少水質(zhì)污染。
[0006] 目前，益生菌制劑以廣泛應(yīng)用于養(yǎng)殖生產(chǎn)，但在制備技術(shù)方面尚存在諸多問題： (1)產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)不統(tǒng)一，生產(chǎn)企業(yè)自行設(shè)立標(biāo)準(zhǔn)，缺乏科學(xué)依據(jù)，益生菌含量過高或過低，影響 使用效果；（2)生產(chǎn)菌種來源不明，大多數(shù)企業(yè)生產(chǎn)用菌種相互轉(zhuǎn)接，沒有經(jīng)過分離選育， 菌種退化嚴(yán)重，生理活性降低；（3)菌種配伍缺乏科學(xué)依據(jù)，單一菌株，雙菌株，甚至多菌株 隨意配比，不能說明菌株間配伍的合理性，達不到菌株優(yōu)良性狀，通過合理配伍而互補，協(xié) 同性差；（4)生產(chǎn)工藝混亂，不能按菌種的不同生理特性區(qū)別培養(yǎng)，不少生產(chǎn)企業(yè)采用多菌 種混合培養(yǎng)，不用發(fā)酵罐，甚者采用堆集發(fā)酵，致使益生菌生長少，雜菌叢生。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了解決上述益生菌劑菌種退化嚴(yán)重，生物活性低等問題，本發(fā)明提供一種含糞 腸球菌的高效雞飼料益生菌劑。
[0008] 本發(fā)明另一目的是提供一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑的制備方法。
[0009] 為了達到上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：
[0010] 所述益生菌劑是由糞腸球菌（Enterococcus faecal is)活性菌泥、枯草芽孢桿菌 (Bacillus su btilis)活性菌泥、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)活性 菌泥和穩(wěn)定化保護劑制備而成；
[0011] 所述奠腸球菌（Enterococcus faecalis)活性菌泥、枯草芽抱桿菌（Bacillus subtilis)活性菌泥、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae Hansen)活性菌泥和穩(wěn)定化 保護劑混合的質(zhì)量比為0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1。
[0012] 所述糞腸球菌為糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131，該菌株耐熱性強、 耐酸堿范圍寬泛、抗逆性、益生性更加顯著，已于2014年6月17日保藏于中國微生物菌種 保藏管理委員會普通微生物中心（簡稱CGMCC，地址為：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號 中國科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼：100101)，保藏編號為CGMCC NO. 9353,分類命名為糞 腸球菌 Enterococcus faecalis。
[0013] 所述糞腸球菌（Enterococcus faecalis)HEW_A131具有以下微生物學(xué)特征：糞腸 球菌HEW-A131是革蘭氏陽性菌，在腸球菌瓊脂培養(yǎng)基上生長迅速，35°C培養(yǎng)24h形成白色、 圓形、邊緣光滑整齊、凸起、直徑為1?I. 5_的菌落，并且周圍有藍黑色環(huán)帶，，顯微鏡下 菌體呈卵圓形、成對成鏈存在、無芽孢，兼性厭氧生長；糞腸球菌HEW-A131生長適宜溫度范 圍：41：-651：，最適生長溫度 ：201：-451：;生長適宜？111.5-11，最適？11值為6-8。
[0014] 所述糞腸球菌HEW-A131具有顯著的益生性，能顯著抑制大腸桿菌（Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus)、沙門氏菌（Salmonella sp.)、肺 炎克雷伯氏菌（Klebsiella peneumoniae)、志賀氏菌屬（Shigella sp.)、韋榮氏球菌 (Veillonella sp.)、綠胺桿菌（Pseudomonas aeruginosa)、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila)、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida)等病原菌的生長繁殖，具有廣譜 抑菌性。
[0015] 所述糞腸球菌HEW-A131具有較強的抗逆性，能夠耐受模擬胃酸、模擬膽鹽以及高 溫環(huán)境，并且能保持較高的活菌存活率，其活菌存活率可達到93-99%，更加適合飼料工業(yè) 和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的要求。
[0016] 所述糞腸球菌活性菌泥的制備方法如下：
[0017] 將經(jīng)活化的糞腸球菌HEW-A131斜面菌種挑取1-2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基35°C、 180r/min培養(yǎng)3-5h，得到種子液（活菌濃度為10 9CFU/mL);取3mL種子液接種于300mL搖 瓶種子培養(yǎng)基中35°C、180r/min培養(yǎng)6h，得到搖瓶種子液；取0. 30L搖瓶種子液接種于裝 有30L發(fā)酵種子培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，35°C、I lOr/min發(fā)酵3-5h，得到發(fā)酵罐種子液；取 30L發(fā)酵罐種子液接種于裝有3000L發(fā)酵培養(yǎng)基的5000L發(fā)酵罐中，5-38°C，80-100r/min， 培養(yǎng)6-12h得到發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心20-40min即得糞腸球菌活性菌 泥；
[0018] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)彡I. I X 101QCFU/mL ;
[0019] 所述斜面培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：葡萄糖2%，蛋白胨1 %，酵母提取物 0.5%，檸檬酸二銨 0.2%，醋酸鈉 0.5%，牛肉膏 1%，吐溫-80 0? 1%，K2HPO4O. 2%， MgSO4 ? 7H200. 0058%，MnSO4 ? 4H200. 025%，瓊脂粉 L 5%，余量為水，pH 7. 0±0. 2 ;
[0020] 所述液體種子培養(yǎng)基、搖瓶種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：蔗 糖 2. 5 %，大豆蛋白胨 L 8 %，酵母提取物 0? 4 %，MgSO4 ? 7H200. 2 %，MnSO4 ? 4H200. 045 %， NaClO. 2 %，檸檬酸二銨 0? 2 %，CaCO3O. 6 %，余量為水，pH7. 0 ±0? 2 ;
[0021] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：紅糖1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母提取物 0. 4 %，硫酸鎂0. 2 %，硫酸錳0. 045 %，氯化鈉0. 2 %，檸檬酸二銨0. 5 %，碳酸鈣0. 1 %，消泡 劑 0? 005%，余量為水，pH5. 5-6. 8。
[0022] 所述枯草芽孢桿菌活性菌泥的制備方法如下：
[0023] 取經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種1-2環(huán)接種于300mL -級種子培養(yǎng)基中，進行 搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為20-45°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時間10-20h，得到一級種子液。將 一級種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為1-2 %，裝液量為30L、發(fā)酵溫度 為20-45°C、拌轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)5-10h得到二級種子液，將二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，接種量2-6 %，接種后，溫度控制在20-45°C，攪拌轉(zhuǎn)速120-180r/m，培養(yǎng)30-48h得到 枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心20-40min即得枯草芽孢桿菌活性 菌泥；
[0024] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)彡I. OX 101(lCFU/mL。
[0025] 所述斜面培養(yǎng)基為牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基；
[0026] 所述一級、二級種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：葡萄糖2%，玉米漿干粉0. 6%，豆柏 粉 2%，酵母提取物 0? 5%，MgS04 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量為水，pH7. 0±0. 2 ;
[0027] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：紅糖1.5%，酵母粉0.5%，玉米粉1.5%，NaClO. 5%， MgSO4 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量為水，pH70±0. 2。
[0028] 所述釀酒酵母菌活性菌泥的制備方法如下：
[0029] 取經(jīng)活化的釀酒酵母菌斜面菌種1-2環(huán)接種于300mL -級種子培養(yǎng)基中，進行搖 瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為20-35°C、轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵時間8-15h，得到一級種子液。將一 級種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為1-2 %，裝液量為30L、發(fā)酵溫度為 20-35°C、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)5-10h得到二級種子液，將二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng) 基中，接種量5-10%，接種后，溫度控制在20-35°C，攪拌轉(zhuǎn)速100_150r/m，培養(yǎng)30-72h得 到釀酒酵母菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心20-40min即得釀酒酵母菌活性菌 泥；
[0030] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)彡8. 0 X IO9CFUAiL ;
[0031] 所述斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；
[0032] 所述一級、二級種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為；葡萄糖2%，酵母粉1%，大豆蛋白胨 2%，余量為水，pH7.0±0.2 ;
[0033] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為；糖蜜2%，酵母提取物0. 7%，黃豆餅粉1. 2%， 余量為水，pH7. 0±0. 2。
[0034] 所述穩(wěn)定化保護劑的制備方法如下：
[0035] 以重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取玉米淀粉40-60份，微晶纖維素5-25份，羧甲基纖維素鈉 1-8份，葡聚糖3-5份，甘油2-4份，乳糖1-3份，取原料總重量20-35%的水，首先將微晶纖 維素、羧甲基纖維素鈉和葡聚糖均勻混合得混合物，將混合物加入水中室溫浸泡3-5h，邊升 溫邊攪拌，80-90°C保溫20-30min，攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌邊依次加入乳糖、甘油 和玉米淀粉，充分攪拌，混合5-10min即得穩(wěn)定化保護劑。
[0036] 上述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑的制備方法，包括如下步驟：
[0037] 將糞腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保 護劑按質(zhì)量比0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1置于攪拌罐中，啟動攪拌器，均勻混合 15-30min，攪拌轉(zhuǎn)速30-60r/m，接著加水調(diào)節(jié)混合料濕度為32-35%，得微囊菌濕粉；將微 囊菌濕粉投入制粒機內(nèi)，調(diào)節(jié)粒度為20-40目，然后投入旋流流化床制粒包衣機中干燥，干 燥進風(fēng)溫度控制在55-65°C，出風(fēng)溫度控制在28-32°C，干燥時間50-70min ;最后啟動側(cè)噴 包衣裝置，進風(fēng)溫度控制在45-65 °C，霧化壓力為0. 1-0. 2MPa，將包被劑溶液以10-30mL/ min速度分三個噴頭噴向旋流狀態(tài)的物料，在微粒物料中形成包衣膜層，經(jīng)30-60min得到 20-40目雞飼料益生菌劑。
[0038] 所述包被劑溶液由如下質(zhì)量組分的原料均勻混合、充分溶解制備：玉米淀粉 1-3 %、海藻酸鈉1-15 %、羥丙基甲基纖維素4-8 %、果膠3-5 %、卡拉膠3-5 %、甘露聚糖 1-10%、低聚異麥芽糖2-8%、脫脂奶粉2-10%、麥芽糊精5-20%、余量為水。
[0039] 本發(fā)明還有一個目的是所述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用。 其是將益生菌劑作為添加劑，添加到家禽的飲水或飼料中。其中，所述糞腸球菌HEW-A131 在飲水中的添加量為l〇 6-l〇8CFU/L飲水；所述糞腸球菌HEW-A131在飼料中的添加量為 105-10 7CFU/kg 飼料。
[0040] 有益效果：
[0041] 1.本發(fā)明的益生菌劑不但可以提高動物的飼料利用效率，節(jié)約成本，而且大大改 善了動物體內(nèi)消化道內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進營養(yǎng)的吸收利用，促進動物生長，顯著提高了動 物的生產(chǎn)性能、免疫性能和繁殖性能，降低了生產(chǎn)成本，提高了經(jīng)濟效益。
[0042] 2.本發(fā)明的益生菌劑用量較少，例如在飼料中僅為106CFU/kg時即可發(fā)揮顯著作 用，具體表現(xiàn)在：
[0043] 1)可顯著提高種雞的生產(chǎn)性能及繁殖性能：與對照組相比，試驗組料蛋比降低 24. 81 %，死淘率降低57. 14%，種蛋合格率提高2. 02 %，種蛋受精率提高2. 5 %，健雛率提 聞 2. 49!%。
[0044] 2)可顯著提高白羽肉雞的生產(chǎn)性能及免疫性能，與對照組相比，料肉比降低 35. 77%，死淘率降低56%。
[0045] 3)可顯著提高蛋雞的生產(chǎn)性能、免疫性和雞蛋品質(zhì)，有效替代抗生素添加劑，適合 大規(guī)模推廣使用。其中，料蛋比抗生素組降低14. 98%，比普通組降低25. 11 %;死淘率比抗 生素組降低13. 54%，比普通組降低34. 65%;雞蛋質(zhì)量指標(biāo)光澤、蛋殼厚度、哈氏單位、蛋黃 顏色明顯優(yōu)于抗生素組和普通組。
[0046] 4)可顯著提高羅斯308肉雞的生產(chǎn)性能，出欄只均重較對照組提高10. 11%，料肉 比降低了 0. 17,且成活率較對照組提高2. 18%，表明通過飼用益生菌劑后，動物機體抗病 力和抗應(yīng)激能力得到很大提升。
[0047] 5)可顯著提高櫻桃谷肉鴨的生產(chǎn)性能，與對照組相比分別提高肉鴨0?21日齡、 22?42日齡、1-42日齡肉鴨日增重7. 60%、4. 04%、5. 35%，分別降低料肉比0? 09、0. 2、 0. 17 (P < 0. 05)。顯著提高了櫻桃谷肉鴨前期、后期和全期的日增重（P < 0. 05)，顯著降低 各階段料肉比（P < 〇. 05)。還可提高肉鴨成活率。

【具體實施方式】
[0048] 下面通過具體的實施方案敘述本發(fā)明。除非特別說明，本發(fā)明中所用的技術(shù)手段 均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的方法。另外，實施方案應(yīng)理解為說明性的，而非限制本發(fā)明的 范圍，本發(fā)明的實質(zhì)和范圍僅由權(quán)利要求書所限定。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，在不背離本 發(fā)明實質(zhì)和范圍的前提下，對這些實施方案中的物料成分和用量進行的各種改變或改動也 屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0049] 實施例1原料制備
[0050] 1?糞腸球菌活性菌泥的制備
[0051] 所述糞腸球菌活性菌泥的制備方法如下：
[0052] 將經(jīng)活化的糞腸球菌HEW-A131斜面菌種挑取2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng)基35°C、 180r/min培養(yǎng)4h，得到活菌濃度為IO 9CFUAiL的種子液；取3mL種子液接種于300mL搖瓶 種子培養(yǎng)基中35°C、180r/min培養(yǎng)6h，得到搖瓶種子液；取0. 30L搖瓶種子液接種于裝有 30L發(fā)酵種子培養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，35°C、I lOr/min發(fā)酵4h，得到發(fā)酵罐種子液；取30L發(fā) 酵罐種子液接種于裝有3000L發(fā)酵培養(yǎng)基的5000L發(fā)酵罐中，35°C，90r/min，培養(yǎng)8h得到 發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)16000r/min離心20min即得糞腸球菌活性菌泥；
[0053] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)I. 4X 101QCFU/mL ;
[0054] 所述斜面培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：葡萄糖2%，蛋白胨1 %，酵母提取物 0.5%，檸檬酸二銨 0.2%，醋酸鈉 0.5%，牛肉膏 1%，吐溫-80 0? 1%，K2HPO4O. 2%， MgSO4 ? 7H200. 0058%，MnSO4 ? 4H200. 025%，瓊脂粉 L 5%，余量為水，pH 7. 0±0. 2。
[0055] 所述液體種子培養(yǎng)基、搖瓶種子培養(yǎng)基、發(fā)酵罐種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：蔗 糖 2. 5 %，大豆蛋白胨 L 8 %，酵母提取物 0? 4 %，MgSO4 ? 7H200. 2 %，MnSO4 ? 4H200. 045 %， NaClO. 2 %，檸檬酸二銨 0? 2 %，CaCO3O. 6 %，余量為水，pH7. O ;
[0056] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：紅糖1.5%，大豆蛋白胨0.5%，酵母提取物 0. 4 %，硫酸鎂0. 2 %，硫酸錳0. 045 %，氯化鈉0. 2 %，檸檬酸二銨0. 5 %，碳酸鈣0. 1 %，消泡 劑0. 005%，余量為水，pH6. 0。
[0057] 2.枯草芽孢桿菌活性菌泥的制備
[0058] 所述枯草芽孢桿菌活性菌泥的制備方法如下：
[0059] 取經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種2環(huán)接種于300mL -級種子培養(yǎng)基中，進行搖 瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為37°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時間15h，得到一級種子液。將一級種子 液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為2%，裝液量為30L、發(fā)酵溫度為37°C、拌 轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)8h得到二級種子液，將二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量4%， 接種后，溫度控制在37°C，攪拌轉(zhuǎn)速150r/m，培養(yǎng)40h得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng) 16000r/min離心20min即得枯草芽孢桿菌活性菌泥；
[0060] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)2. I X 101(lCFU/mL。
[0061] 所述斜面培養(yǎng)基為牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基；
[0062] 所述一級、二級種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為：葡萄糖2%，玉米漿干粉0. 6%，豆柏 粉 2%，酵母提取物 0? 5%，MgS04 ? 7H200. 1%，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量為水，pH7. 0 ;
[0063] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：紅糖1.5%，酵母粉0.5%，玉米粉1.5%，NaClO. 5%， MgSO4 ? 7H200. 1 %，MnSO4 ? 4H200. 02%，余量為水，pH7. 0 ;
[0064] 3.釀酒酵母菌活性菌泥的制備
[0065] 所述釀酒酵母菌活性菌泥的制備方法如下：
[0066] 取經(jīng)活化的釀酒酵母菌斜面菌種2環(huán)接種于300mL -級種子培養(yǎng)基中，進行搖瓶 發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為28°C、轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵時間12h，得到一級種子液。將一級種子 液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為2%，裝液量為30L、發(fā)酵溫度為28°C、 攪拌轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)8h得到二級種子液，將二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量 8 %，接種后，溫度控制在28°C，攪拌轉(zhuǎn)速120r/m，培養(yǎng)48h得到釀酒酵母菌發(fā)酵液，發(fā)酵液 經(jīng)16000r/min離心20min即得釀酒酵母菌活性菌泥；
[0067] 所述發(fā)酵液活菌數(shù)I. 5 X 101(lCFU/mL ;
[0068] 所述斜面培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基；
[0069] 所述一級、二級種子培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為；葡萄糖2%，酵母粉1%，大豆蛋白胨 2%，余量為水，pH7. 0 ;
[0070] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基質(zhì)量組分組成為；糖蜜2%，酵母提取物0. 7%，黃豆餅粉I. 2%， 余量為水，PH7. 0。
[0071] 4.穩(wěn)定化保護劑的制備
[0072] 所述穩(wěn)定化保護劑的制備方法如下：
[0073] 以重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取玉米淀粉50份，微晶纖維素15份，羧甲基纖維素鈉5份， 葡聚糖4份，甘油3份，乳糖2份，取原料總重量30%的水，首先將微晶纖維素、羧甲基纖維 素鈉和葡聚糖均勻混合得混合物，將混合物加入水中室溫浸泡4h，邊升溫邊攪拌，85°C保溫 25min，攪拌，充分溶解，繼續(xù)保溫，邊攪拌邊依次加入乳糖、甘油和玉米淀粉，充分攪拌，混 合8min即得穩(wěn)定化保護劑。
[0074] 實施例2
[0075] -種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：
[0076] 將糞腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保 護劑按質(zhì)量比0.5 : 1.8 : 0.3 : 1置于攪拌罐中，啟動攪拌器，均勻混合22min，攪拌轉(zhuǎn) 速50r/m，接著加水調(diào)節(jié)混合料濕度為33 %，得微囊菌濕粉；將微囊菌濕粉投入制粒機內(nèi)， 調(diào)節(jié)粒度為30目，然后投入旋流流化床制粒包衣機中干燥，干燥進風(fēng)溫度60°C，出風(fēng)溫度 控制在30°C，干燥時間60min ;最后啟動側(cè)噴包衣裝置，進風(fēng)溫度控制在55°C，霧化壓力為 0. 15MPa，將包被劑溶液以20mL/min速度分三個噴頭噴向旋流狀態(tài)的物料，在微粒物料中 形成包衣膜層，經(jīng)50min得到30目雞飼料益生菌劑；
[0077] 所述包被劑溶液由如下質(zhì)量組分的原料均勻混合、充分溶解制備：玉米淀粉2%、 海藻酸鈉8%、羥丙基甲基纖維素6%、果膠4%、卡拉膠4%、甘露聚糖8%、低聚異麥芽糖 6%、脫脂奶粉6%、麥芽糊精15%、余量為水。
[0078] 實施例3
[0079] -種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：
[0080] 將糞腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保 護劑按質(zhì)量比0.1 : 1 : 0.1 : 1置于攪拌罐中，啟動攪拌器，均勻混合15min，攪拌轉(zhuǎn) 速60r/m，接著加水調(diào)節(jié)混合料濕度為32 %，得微囊菌濕粉；將微囊菌濕粉投入制粒機內(nèi)， 調(diào)節(jié)粒度為20目，然后投入旋流流化床制粒包衣機中干燥，干燥進風(fēng)溫度55°C，出風(fēng)溫度 28°C，干燥時間50min ;最后啟動側(cè)噴包衣裝置，進風(fēng)溫度控制在45°C，霧化壓力為0. IMPa， 將包被劑溶液以lOmL/min速度分三個噴頭噴向旋流狀態(tài)的物料，在微粒物料中形成包衣 膜層，經(jīng)30min得到20目雞飼料益生菌劑；
[0081] 所述包被劑溶液由如下質(zhì)量組分的原料均勻混合、充分溶解制備：玉米淀粉1%、 海藻酸鈉1%、羥丙基甲基纖維素4%、果膠3%、卡拉膠3%、甘露聚糖1%、低聚異麥芽糖 2 %、脫脂奶粉2 %、麥芽糊精5 %、余量為水。
[0082] 實施例4
[0083] 一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其制備方法包括如下步驟：
[0084] 將糞腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保 護劑按質(zhì)量比0.8 : 2.5 : 0.5 : 1置于攪拌罐中，啟動攪拌器，均勻混合30min，攪拌轉(zhuǎn) 速30r/m，接著加水調(diào)節(jié)混合料濕度為35%，得微囊菌濕粉；將微囊菌濕粉投入制粒機內(nèi)， 調(diào)節(jié)粒度為40目，然后投入旋流流化床制粒包衣機中干燥，干燥進風(fēng)溫度65°C，出風(fēng)溫度 32°C，干燥時間70min ;最后啟動側(cè)噴包衣裝置，進風(fēng)溫度控制在65°C，霧化壓力為0. 2MPa， 將包被劑溶液以30mL/min速度分三個噴頭噴向旋流狀態(tài)的物料，在微粒物料中形成包衣 膜層，經(jīng)60min得到40目雞飼料益生菌劑；
[0085] 所述包被劑溶液由如下質(zhì)量組分的原料均勻混合、充分溶解制備：玉米淀粉3%、 海藻酸鈉15%、羥丙基甲基纖維素8%、果膠5%、卡拉膠5%、甘露聚糖10%、低聚異麥芽糖 8%、脫脂奶粉10%、麥芽糊精20%、余量為水。
[0086] 實施例5肉種雞生產(chǎn)性能和繁殖性能試驗
[0087] 選用30周齡AA父母代肉種雞4000只，隨機分成2處理，每處理4個重復(fù)，每個重 復(fù)500只雞。試驗日糧飼喂階段30-39周齡。對照組為原基礎(chǔ)日糧組，試驗組基礎(chǔ)日糧添加 本發(fā)明實施例2制備的雞飼料益生菌劑（每千克飼料含2X 106CFU糞腸球菌HEW-A131)。
[0088] 表1雞飼料益生菌劑對種雞生產(chǎn)性能的影響
[0089]

【權(quán)利要求】
1. 一種含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述益生菌劑是由糞腸球菌 (Enterococc us faecalis)活性菌泥、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)活性菌泥、釀酒 酵母菌（Saccharomyce s cerevisiae Hansen)活性菌泥和穩(wěn)定化保護劑制備而成； 所述糞腸球菌保藏編號為CGMCC NO. 9353 ; 所述穩(wěn)定化保護劑的制備方法如下：以重量份數(shù)計，準(zhǔn)確稱取玉米淀粉40-60份，微晶 纖維素5-25份，羧甲基纖維素鈉1-8份，葡聚糖3-5份，甘油2-4份，乳糖1-3份，取原料總 重量20-35%的水，首先將微晶纖維素、羧甲基纖維素鈉和葡聚糖均勻混合得混合物，將混 合物加入水中室溫浸泡3-5h，邊升溫邊攪拌，80-90°C保溫20-30min，攪拌，充分溶解，繼續(xù) 保溫，邊攪拌邊依次加入乳糖、甘油和玉米淀粉，充分攪拌，混合5-10min即得穩(wěn)定化保護 劑。
2. 如權(quán)利要求1或2所述的含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述糞腸球菌 活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化保護劑混合的質(zhì)量比為 0· 1-0. 8 : 1-2. 5 : 0· 1-0. 5 : 1。
3. 如權(quán)利要求1或2所述的含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述糞腸球菌 活性菌泥的制備方法如下：將經(jīng)活化的糞腸球菌斜面菌種挑取1-2環(huán)接種于液體種子培養(yǎng) 基35°C、180r/min培養(yǎng)3-5h，得到種子液；取3mL種子液接種于300mL搖瓶種子培養(yǎng)基中 35°C、180r/min培養(yǎng)6h，得到搖瓶種子液；取0. 30L搖瓶種子液接種于裝有30L發(fā)酵種子培 養(yǎng)基的50L發(fā)酵罐中，35°C、1 lOr/min發(fā)酵3-5h，得到發(fā)酵罐種子液；取30L發(fā)酵罐種子液 接種于裝有3000L發(fā)酵培養(yǎng)基的5000L發(fā)酵罐中，5-38°C，80-100r/min，培養(yǎng)6-12h得到發(fā) 酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心20-40min即得糞腸球菌活性菌泥。
4. 如權(quán)利要求3所述的含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基 質(zhì)量組分組成為：紅糖1. 5 %，大豆蛋白胨0. 5 %，酵母提取物0. 4 %，硫酸鎂0. 2 %，硫酸 錳0. 045 %，氯化鈉0. 2 %，檸檬酸二銨0. 5 %，碳酸鈣0. 1 %，消泡劑0. 005 %，余量為水， ρΗ5· 5-6. 8。
5. 如權(quán)利要求1所述的含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述枯草芽孢 桿菌活性菌泥的制備方法如下：取經(jīng)活化的枯草芽孢桿菌斜面菌種1-2環(huán)接種于300mL 一級種子培養(yǎng)基中，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為20-45°C、轉(zhuǎn)速200r/min，發(fā)酵時間 10-20h，得到一級種子液。將一級種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為 1-2%，裝液量為30L、發(fā)酵溫度為20-45°C、拌轉(zhuǎn)速150r/min，培養(yǎng)5-10h得到二級種子液， 將二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量2-6 %，接種后，溫度控制在20-45°C，攪拌轉(zhuǎn) 速120-180r/m，培養(yǎng)30-48h得到枯草芽孢桿菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心 20-40min即得枯草芽孢桿菌活性菌泥。
6. 如權(quán)利要求1或2所述的含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑，其特征在于，所述釀酒酵 母菌活性菌泥的制備方法如下：取經(jīng)活化的釀酒酵母菌斜面菌種1-2環(huán)接種于300mL -級 種子培養(yǎng)基中，進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵溫度為20-35°C、轉(zhuǎn)速120r/min，發(fā)酵時間8-15h， 得到一級種子液。將一級種子液轉(zhuǎn)接到50L發(fā)酵罐二級種子培養(yǎng)基中，接種量為1-2%， 裝液量為30L、發(fā)酵溫度為20-35°C、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min，培養(yǎng)5-10h得到二級種子液，將 二級種子液轉(zhuǎn)接到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5-10%，接種后，溫度控制在20-35°C，攪拌轉(zhuǎn) 速100-150r/m，培養(yǎng)30-72h得到釀酒酵母菌發(fā)酵液，發(fā)酵液經(jīng)10000-16000r/min離心 20-40min即得釀酒酵母菌活性菌泥。
7. 如權(quán)利要求1或2所述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑的制備方法，其特征在于，包 括如下步驟：將糞腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥、釀酒酵母菌活性菌泥和穩(wěn)定化 保護劑按質(zhì)量比0.1-0. 8 : 1-2. 5 : 0.1-0. 5 : 1置于攪拌罐中，啟動攪拌器，均勻混合 15-30min，攪拌轉(zhuǎn)速30-60r/m，接著加水調(diào)節(jié)混合料濕度為32-35%，得微囊菌濕粉；將微 囊菌濕粉投入制粒機內(nèi)，調(diào)節(jié)粒度為20-40目，然后投入旋流流化床制粒包衣機中干燥，干 燥進風(fēng)溫度控制在55-65°C，出風(fēng)溫度控制在28-32°C，干燥時間50-70min ;最后啟動側(cè)噴 包衣裝置，進風(fēng)溫度控制在45-65 °C，霧化壓力為0. 1-0. 2MPa，將包被劑溶液以10-30mL/ min速度分三個噴頭噴向旋流狀態(tài)的物料，在微粒物料中形成包衣膜層，經(jīng)30-60min得到 20-40目雞飼料益生菌劑。
8. 如權(quán)利要求7所述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑的制備方法，其特征在于，所述 包被劑溶液由如下質(zhì)量組分的原料均勻混合、充分溶解制備：玉米淀粉1-3 %、海藻酸鈉 1-15 %、羥丙基甲基纖維素4-8 %、果膠3-5 %、卡拉膠3-5 %、甘露聚糖1-10 %、低聚異麥芽 糖2-8%、脫脂奶粉2-10%、麥芽糊精5-20%、余量為水。
9. 如權(quán)利要求7所述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑的制備方法，其特征在于，所述糞 腸球菌活性菌泥、枯草芽孢桿菌活性菌泥和釀酒酵母菌活性菌泥在制備過程中發(fā)酵液活菌 數(shù)分別大于等于 1. lXl〇lclCFU/mL、l· 0X10lclCFU/mL 和 8. 0X109CFU/mL。
10. 如權(quán)利要求1或2所述含糞腸球菌的雞飼料益生菌劑在家禽養(yǎng)殖中的應(yīng)用，其 是將益生菌劑作為添加劑，添加到家禽的飲水或飼料中，其中，所述糞腸球菌HEW-A131 在飲水中的添加量為l〇 6-l〇8CFU/L飲水；所述糞腸球菌HEW-A131在飼料中的添加量為 105-10 7CFU/kg 飼料。
【文檔編號】C12R1/865GK104293697SQ201410476593
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月16日
【發(fā)明者】李雪平 申請人:李雪平