一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法，屬于生物工程【技術領域】。本發(fā)明采用獸疫鏈球菌來源的透明質酸合酶hasA和枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD，重組Pichia pastoris GS115宿主中表達，實現(xiàn)了透明質酸的生產；同時，采用水蛭來源的透明質酸酶整合至畢赤酵母基因組上，分別置于不同強度的組成型啟動子下分泌表達，通過控制透明質酸酶的分泌表達量來制備不同分子量大小的小分子透明質酸產物，制備的產物分子量范圍有差異，對于微生物直接生產特定范圍的小分子透明質酸具有重要的指導借鑒意義。本發(fā)明為高效制備小分子透明質酸奠定了一定的基礎，適合于工業(yè)化生產應用。
【專利說明】一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母及其構建方法，屬于生物工程
【技術領域】。
【背景技術】
[0002] 透明質酸（Hyaluronic Acid, HA)，是一種高分子粘性多糖，以其獨特的分子結構 和理化性質，使其具有良好的保濕性、粘彈性、滲透性和延展性，是目前發(fā)現(xiàn)的自然界中保 濕性最好的物質，同時無任何免疫原性和毒性，被廣泛應用于化妝品、食品和醫(yī)藥等行業(yè)領 域。近年來研究發(fā)現(xiàn)，低分子量的HA(低于IXlO 4)和透明質酸寡糖具有獨特的生物學功 能。低分子量的HA(低于IXlO4)和寡聚透明質酸，表現(xiàn)出非常強的生物活性，具有抑制 腫瘤擴散、促進創(chuàng)傷愈合、促進骨和血管生成、免疫調節(jié)等作用，且易于滲透到真皮中，免疫 細胞、細胞因子的激活劑。HAlO(K)糖單位）和HA8 (8糖單位）可以刺激成纖維細胞增殖、 膠原合成以及可以通過破壞大分子透明質酸與細胞受體的相互作用而選擇性殺死癌細胞； HA6和HA4可以誘導體內樹突細胞的成熟以及新血管合成。此外，HA寡糖容易被人體吸收 而用于人體自身HA等多糖合成的前體，因此，HA寡糖在食品保健以及醫(yī)藥領域具有重要的 應用前景。
[0003] 目前，雖然已有報道采用從頭合成的方法來制備HA寡糖，但由于化學合成存在底 物昂貴、步驟繁瑣以及合成效率低等多問題，難以實現(xiàn)HA寡糖制備應用。相比較，酶法催化 合成HA寡糖是一種很有潛力的方法，但需要制備大量的透明質酸酶液和控制反應條件。因 此，將微生物發(fā)酵生產HA和透明質酸酶（Hyaluronidase，HAase)相偶聯(lián)，實現(xiàn)一菌發(fā)酵直 接生產獲取HA寡糖和透明質酸酶兩種產物，具有一定的研究意義和工業(yè)化潛力。
[0004] 本發(fā)明在畢赤酵母（Pichia pastoris)內重組表達Streptococcus zooepidemicus來源的透明質酸合成酶hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的tuaD以構建HA合成 途徑，并表達HAase，以實現(xiàn)一菌同步發(fā)酵生產HA和HAase，在發(fā)酵液中直接制備生產HA寡 糖產物。這一偶聯(lián)模式解決了當前微生物生產HA過程中由于粘度過高導致發(fā)酵停滯產量 難以獲得突破的瓶頸問題，尤其是首次實現(xiàn)微生物高效合成HA寡糖，具有巨大的應用價值 和經(jīng)濟效益。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明要解決的第一個技術問題是提供一種產小分子透明質酸的重組畢赤酵母， 是在重組畢赤酵母內構建了產透明質酸的途徑并偶聯(lián)分泌表達透明質酸酶。為構建產透明 質酸的途徑，在畢赤酵母中表達了編碼透明質酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的 基因 tuaD。
[0006] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述畢赤酵母為Pichia pastoris GS115。
[0007] 所述透明質酸合酶編碼基因 hasA可以來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌(Streptococcus equi)或類馬鏈球菌(Streptococcus equissp)。在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸合酶的基因 hasA來源于獸疫鏈 球菌，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0008] 所述UDP-葡萄糖脫氫酶可以來源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿 菌（Escherichia coli)或芽孢桿菌（Bacillus)。在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述 Μ)Ρ-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD來源于枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis)，其核苷酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示。
[0009] 在本發(fā)明的一種實施方式中，hasA和tuaD分別由組成型強啟動子控制表達，例如 畢赤酵母組成型強啟動子。如hasA由三磷酸甘油醛脫氫酶啟動子GAP(SEQ ID N0.3)控制 表達，tuaD由翻譯延伸因子l-α啟動子TEF1(SEQ ID NO. 4)控制表達。
[0010] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述透明質酸酶LHyal來源于水蛭，融合啟動子和 信號肽后通過重組整合到畢赤酵母基因組進行表達。
[0011] 在本發(fā)明的一種實施方式中，編碼所述透明質酸酶的核苷酸序列如SEQ ID NO. 5 所示。
[0012] 在本發(fā)明的一種實施方式中，所述透明質酸酶基因分別置于不同強度的組成型啟 動子GAP、TEFl或YPTl (SEQ ID NO. 6)控制下表達；信號肽為α -因子信號肽。透明質酸 酶表達量越高，所制得HA的分子量越小。將水蛭透明質酸酶基因與GAP啟動子融合，所得 重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為41000道爾頓。將水蛭透明質酸酶基因與TEFl 啟動子融合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為66500道爾頓。將水蛭透明質 酸酶基因與YPTl啟動子融合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為110000道爾 頓。
[0013] 本發(fā)明要解決的第二個技術問題是提供一種構建所述重組畢赤酵母的方法，主要 包括以下步驟：
[0014] (1)構建透明質酸的合成途徑：將編碼透明質酸合酶的基因 hasA與啟動子GAP融 合，將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD與啟動子TEFl融合，將兩個融合片段再融合后 連接表達載體，轉化畢赤酵母得到含透明質酸合成途徑的畢赤酵母；
[0015] (2)偶聯(lián)表達透明質酸酶：將透明質酸酶基因融合啟動子后整合到步驟（1)所得 重組畢赤酵母的基因組中，獲得偶聯(lián)表達透明質酸酶的重組畢赤酵母。
[0016] 所述步驟（2)中的啟動子可根據(jù)需要制備的HA的分子量進行調整，啟動子強度越 大，重組畢赤酵母產的HA的分子量就越小。
[0017] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（2)選定畢赤酵母基因組上乙醇脫氫酶基因作 為透明質酸酶整合位點。
[0018] 在本發(fā)明的一種實施方式中，步驟（2)將水蛭透明質酸酶基因與GAP啟動子融合， 所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為41000道爾頓。
[0019] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，步驟（2)將水蛭透明質酸酶基因與TEFl啟動子融 合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為66500道爾頓。
[0020] 在本發(fā)明的另一種實施方式中，步驟（2)將水蛭透明質酸酶基因與YPTl啟動子融 合，所得重組畢赤酵母發(fā)酵生產的HA平均分子量為110000道爾頓。
[0021] 本發(fā)明要解決的第三個技術問題是提供一種應用所述重組畢赤酵母發(fā)酵產小分 子透明質酸（l〇 4Da〈Mr〈105Da)或透明質酸寡糖（MKlO4Da)的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇 或葡萄糖等作為碳源，在20-30°C，發(fā)酵48-96h。
[0022] 在本發(fā)明的一種實施方式中，將經(jīng)活化培養(yǎng)的重組畢赤酵母接種于發(fā)酵培養(yǎng)基， 200rpm3(TC培養(yǎng)96h。所得小分子透明質酸分子量小于IO 5Da,主要產物為低分子量或者 HA-4、HA-6、HA-8、HA-10等透明質酸寡聚糖。
[0023] 所述發(fā)酵培養(yǎng)基含：酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4,11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X IOVD，甘油 lml/L，添加 2g/L 的 MgSO4, 葡萄糖濃度為5%。
[0024] 所得發(fā)酵液中的透明質酸酶分離純化后可用于食品、醫(yī)藥或臨床等用途。
[0025] 本發(fā)明利用畢赤酵母偶聯(lián)產透明質酸酶和透明質酸，在產高分子HA的過程中，HA 被同時分泌至胞外的透明質酸酶降解為小分子透明質酸，具有直接的目的性。與其他方式 相比，該發(fā)明具有非常大的應用優(yōu)勢。首先，本發(fā)明偶聯(lián)表達透明質酸酶，降低了發(fā)酵液粘 稠度，增加了溶氧和提高了 HA的產量；其次，發(fā)酵液中酶水解制備的小分子寡聚透明質酸 的轉化產率高達95%以上，產物的分子量小余IO5道爾頓，且主要產物為低分子量寡聚糖， 易于純化回收。基于應用分析，本發(fā)明方法在工業(yè)上用于制備小分子寡聚透明質酸及其衍 生體具有潛在而非常廣泛的價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0026] 圖1所示為重組質粒PAPAT9K的構建示意圖。
[0027] 圖2所示為水蛭透明質酸酶基因整合片段的構建示意圖。
【具體實施方式】
[0028] 序列表中為相關核苷酸序列信息：
[0029] (I)SEQ ID NO. 1序列信息為獸疫鏈球菌來源的透明質酸合成酶編碼序列；
[0030] (2) SEQ ID NO. 2序列信息為枯草芽孢桿菌來源的UDP-葡萄糖脫氫酶編碼序列；
[0031] (3) SEQ ID NO. 3序列信息為畢赤酵母組成型啟動子GAP的基因序列；
[0032] (4) SEQ ID NO. 4序列信息為畢赤酵母組成型啟動子TEFl的基因序列；
[0033] (5) SEQ ID NO. 5序列信息為水蛭來源的透明質酸酶LHyal的基因序列；
[0034] (6) SEQ ID NO. 6序列信息為畢赤酵母組成型啟動子YPTl的基因序列；
[0035] (7) SEQ ID NO. 7序列信息為編碼畢赤酵母α -因子信號肽序列的基因序列。
[0036] (8)SEQIDN0·8為畢赤酵母基因組無痕改造片段PA0X-mazF-Zeocin(AMZ)的基因 序列。
[0037] 實施例IhasA基因和UDP-葡萄糖脫氫酶tuaD基因的克隆
[0038] 本發(fā)明所用的hasA基因來源于為獸疫鏈球菌Streptococcus zooepidemicus ATCC 35246 和 UDP-葡萄糖脫氧酶基因來源于 Bacillus subtilis，Streptococcus zooepidemicus菌株在接種與5ml M17液體培養(yǎng)基，在37°C 200rpm培養(yǎng)16h。Bacillus subtilis 接種于 5ml LB 液體培養(yǎng)基，在 37°C 200rpm 培養(yǎng) 16h。Pichia pastorisGS115 接 種于5ml YH)液體培養(yǎng)基，置于200rpm30°C培養(yǎng)24h。分別收集菌體，采用細菌基因組提取 試劑盒提取三菌株的基因組DNA。
[0039] 根據(jù)已公布的基因組信息序列，分別設計引物hasA-F/hasA-R、tuaD-F/tuaD-R, 以提取的基因組DNA為模板，采用標準的PCR擴增體系和程序，分別擴增獲取hasA和tuaD 基因。以Pichia pastorisGS115基因組為模板,設計引物gap-F/gap-R和tef-F/tef-R分 別擴增GAP和TEFl啟動子。
[0040] 引物序列信息：5' -3'方向
[0041] hasA-F ： TGAACAACTATTTCGAAACGATGAGAACATTAAAAAACCTCATAAC
[0042] hasA-R ： TGTCTAAGGCGAATTAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTC
[0043] tuaD-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAAAAATAGCTGTCATTGGAACAGG
[0044] tuaD-R ： CCGGAATTCTTATAATAATTTTTTACGTGTTCCCCAGTCAGC
[0045] gap-F ：CTTGATTCGAGCTCTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCCTC
[0046] gap-R ：AGGTTTTTTAATGTTCTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0047] tef-F ：GAACACGTAAAAAATTATTATAAGAATTCCGGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCGC
[0048] tef-R ：ATGACAGCTATTTTTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0049] 實施例2重組質粒PAPT9K的構建
[0050] 采用上述擴增的DNA片段hasA、tuaD、GAP和TEF1，分別采用融合PCR進行啟動子 和目的基因的融合。具體操作程序如下：hasA和GAP片段各取2ul混合于PCR管內，加入無 菌水21 μ 1和25 μ 12xsuper pfu Master Mix (杭州寶賽生物科技有限公司），混勻后置于 PCR 儀，按如下程序運行：94°C 3min，[94°C 30s，50°C 30s，72°C lmin]X10,72°C 5min。無 引物自融合PCR結束后，立即加入引物gap-F和hasA-R各I μ 1，混勻后按如下程序運行： 94°C 3min，[94°C 30s，55°C 30s，72°C lmin] X 32, 72°C 5min。PCR 產物經(jīng) 1 % 的瓊脂糖凝膠 電泳后，切膠回收目標條帶，獲得GAP-hasA片段。
[0051] 同理，按上述操作融合PCR獲得TEFl-tuaD片段?；厥盏膬蓚€融合片段 GAP-hasA和TEFl-tuaD，在按上述融合PCR操作，將兩片段進行融合，獲得目標片段 GAP-hasA-TEFl-tuaD。由于在引物gap-F和tuaD-R兩端分別引入了 SacI和NotI限制性 酶切位點，將載體PPIC9K進行SacI和EcoRI雙酶切，去掉了 AOX啟動子和α -因子信號 肽，重組目標片段GAP-hasA-TEFl-tuaD同樣采取SacI和EcoRI雙酶切，回收后與已雙切的 PPIC9K載體連接，轉化大腸桿菌JM109宿主，對鑒定出的陽性克隆提取質粒進行測序，比對 分析重組質粒PAPT9K構建成功，質粒構建示意圖如附圖1所示。
[0052] 實施例3重組畢赤酵母產HA的菌株構建
[0053] 重組質粒PAPT9K采用Sail線性化后，按畢赤酵母操作手冊，電轉Pichia pastoris GS115宿主，以MD平板（組氨酸缺陷型篩選標記）篩選陽性重組子。同時，為篩 選多拷貝插入的宿主，以含有不同濃度抗生素 g418的YH)平板進行高拷貝篩選。本發(fā)明中 采用的發(fā)酵重組菌株為4mg/ml篩選出來的陽性重組菌株，命名為PAPTGS115。
[0054] 實施例4重組畢赤酵母PAPTGS115菌株的搖瓶發(fā)酵
[0055] 挑取PAPTGS115重組菌單克隆接種于5ml YH)培養(yǎng)基，置于200rpm30°C過夜培養(yǎng)。 16h后接種于250ml三角搖瓶（裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY :酵母提取物10g/L，蛋 白胨 20g/L，3g/L K2HP04，11.8g/L KH2P04，lXYNB(13.4g/L)，500X 生物素 lml/L(4Xl(T4g/ L)，甘油lml/L，添加2g/L的MgS04,葡萄糖濃度為5 %。按I %的接種量轉接與BMGY搖瓶， 置于 200rpm30°C培養(yǎng) 96h。
[0056] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉移置另一離心管中，加入 2倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpmT 室溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解。對 發(fā)酵液進行適當?shù)南♂尯?，采用Bitter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量，對照組為Pichia pastoris GS115同等條件下發(fā)酵液的回收物。經(jīng)測定PAPTGS115重組菌株的HA產量為 0.36g/L〇
[0057] 實施例5水蛭透明質酸酶LHyal基因整合片段的構建
[0058] 以大腸桿菌來源的毒素基因 mazF和博來霉素抗性基因 Zeocin作為雙篩選標記， 構建畢赤酵母基因組無痕改造片段AMZ。具體操作如下：設計引物對A0X-F/R、mazF-F/R和 Zeo-F/R，分別擴增啟動子AOX片段、mazF和Zeocin片段，采用融合PCR技術，按實施例2中 所述的融合步驟，將三個片段融合為PAOX-mazF-Zeocin，命名為AMZ。引物對信息如下：
[0059] AOX-F ：AACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0060] AOX-R ：ACGTATCGGCTTACCATCGTTTGGATCCTTCGAATAATTAG
[0061] mazF-F ： TTCGAAGGATCCAAACGATGGTAAGCCGATACGTACC
[0062] mazF-R ：GCTATGGTGTGTGGGAAGCTTGCACAAACGAAC
[0063] Zeo-F ： TTCGTTTGTGCAAGCTTCCCACACACCATAGCTTCAAAATG
[0064] Zeo-R ：AGCTTGCAAATTAAAGCCTTCG
[0065] 選定畢赤酵母基因組上乙醇脫氫酶位點（Alcohol dehydrogenase)作為透明質酸 酶整合位點。采用AMZ無痕操作技術，構建整合片段（見附圖2)。先采用融合PCR技術，將 不同強度的三個啟動子GAP、TEFl和YPTl分別與LHyal基因進行融合；在乙醇脫氫酶基因 兩端各取600bp左右的DNA片段作為同源重組的同源臂Arm-F和Arm-R,同時取Arm-R下游 約33bp的序列作為二次交換序列（DR)，融合于AMZ片段前端。最后，采取多次重疊 PCR技 術，按實施例2操作過程和附圖2所示順序，分別構建完整的三個基因整合片段。此實施例 引物信息序列如下：
[0066] Arm-F-F ：AAATTTCTTAGAAGGGGCCCATCTAGTTAGCGAG
[0067] Arm-F (GAP) -R :CCAAGACATTTCTACAAAAACTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0068] Arm-F (TEFl) -R ：GATAAAAGAGGCGACAGTTATCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0069] Arm-F (YPTl) -R ：TCCCCAGACTACTTCCTCCACCTTTTACTCTAGGGGACCGCCGTTGGTC
[0070] Arm-R-F ：AAGGCTTTAATTTGCAAGCTACGGATCTTTCCAGCAGTATGCTACTG
[0071] Arm-R-R ：GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCG
[0072] ADPGAP-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGTTTTTGTAGAAATGTCTTGGTGTCC
[0073] ADPGAP-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATCGTTTCGAAATAGTTGTTCAATTG
[0074] ADPTEFI-F :GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGATAACTGTCGCCTCTTTTATCTGCCG
[0075] ADPTEFI-R :GTCACCGCGATCTCTTTCATGTTGGCGAATAACTAAAATGTATGTAG
[0076] ADPYPTI-F ：GCGGTCCCCTAGAGTAAAAGGTGGAGGAAGTAGTCTGGGGAGGTTG
[0077] ADPYPTI-R ：GTCACCGCGATCTCTTTCATATCGATGGGTAATGAGTCTTTTTGTG
[0078] ADLHyal (GAP) -F ：TGAACAACTATTTCGAAACGATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0079] ADLHyal (TEFl)-F ：CATTTTAGTTATTCGCCAACATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0080] ADLHyal (YPTI)-F ：AAGACTCATTACCCATCGATATGAAAGAGATCGCGGTGACAATTG
[0081] ADLHyal-R ：
[0082] GAAACTCATTACATAAGACGTATACAAACTATTCGGCTTATTTTTTGCAGGCTTCAACGTTAGCAG
[0083] ADAMZ-F ：GCCGAATAGTTTGTATACGTCTTATGTAATGAGTTTCAACATCCAAAGACGAAAGGTTG
[0084] ADAMZ-R：ATACTGCTGGAAAGATCCGTAGCTTGCAAATTAAAGCCTTCGAGCG
[0085] 三個融合重組片段，制備濃度為500ng/y 1，電轉產HA重組宿主PAPTGS115,涂布 含有50ug/ul Zeocin的YPD平板，置于37°C培養(yǎng)2-3天，發(fā)生同源重組的菌落攜帶AMZ片 段，可以在此平板上生長。對長出的單菌落轉移至以1%甲醇為碳源（不含葡萄糖）的YPD 平板上，置于37°C培養(yǎng)2-3天。在此過程中，以DR序列發(fā)生第二次交換，使得AMZ片段丟 失，實現(xiàn)LHyal的無痕整合。若未發(fā)生二次交換，AMZ未丟失，AOX啟動子在甲醇誘導下表 達毒性蛋白mazF，使得宿主死亡。因此，在含甲醇的YH)平板上生長的菌為成功重組LHyal 的宿主，通過提取基因組進行PCR驗證和測序，該宿主改造成功，含有不同強度的三個啟動 子 GAP、TEFl 和 YPTl 的重組菌株分別命名為 GLHAGS115、TLHAGS115 和 YLHAGS115。
[0086] 實施例6重組畢赤酵母LHPAPTGS115菌株的搖瓶發(fā)酵
[0087] 分別挑取GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115重組菌單克隆接種于5ml YH)培 養(yǎng)基，置于200rpm3(TC過夜培養(yǎng)。按實施例4發(fā)酵過程操作：16h后接種于250ml三角搖 瓶（裝液量25ml)中，發(fā)酵培養(yǎng)基為BMGY :酵母提取物10g/L，蛋白胨20g/L，3g/L K2HPO4, 11. 8g/L KH2PO4,1 X YNB (13. 4g/L)，500 X 生物素 lml/L (4 X l(T4g/L)，甘油 lml/L，添加 2g/L 的MgS04,葡萄糖濃度為5%。按I %的接種量轉接與BMGY搖瓶，置于200rpm30°C培養(yǎng)96h。
[0088] 收集發(fā)酵液，IOOOOrpm下室溫離心lOmin。發(fā)酵液上清轉移置另一離心管中，力口 入3倍體積的無水乙醇充分混勻沉淀發(fā)酵液中的透明質酸。室溫下靜置lh，再IOOOOrpm 下室溫離心20min，去除干凈液體，白色沉淀加入發(fā)酵液等體積的IM NaCl溶液充分溶解。 對樣品進行適當?shù)南♂尯螅捎肂itter-Muir硫酸咔唑法檢測HA酸含量，對照組為Pichia pastoris GS115同等條件下發(fā)酵液的回收物。經(jīng)測定GLHAGS115、TLHAGS115和YLHAGS115 重組菌株的HA產量分別為0. 59g/L、0. 53g/L和0. 43g/L。同時，對三株重組菌產生的HA的 分子量進行測定，平均分子量分別41000、66500和110000道爾頓。
【權利要求】
1. 一種重組畢赤酵母，其特征在于，是在畢赤酵母內表達了編碼透明質酸合酶的基因 hasA和UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD以獲得產透明質酸的途徑，并偶聯(lián)分泌表達透明質 酸酶。
2. 根據(jù)權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，以畢赤酵母（Pichia pastoris) GS115為宿主。
3. 根據(jù)權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質酸合酶編碼基因 hasA 來源于獸疫鏈球菌（Streptococcus zooepidemicus)、馬鏈球菌（Streptococcus equi)或類馬鏈球菌（Streptococcus equissp) 〇
4. 根據(jù)權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述UDP-葡萄糖脫氫酶來 源于鏈球菌屬（Streptococcus species)、大腸桿菌（Escherichia coli)或芽抱桿菌 (Bacillus)〇
5. 根據(jù)權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，hasA和tuaD分別由畢赤酵母組 成型強啟動子控制表達。
6. 根據(jù)權利要求1-5任一所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質酸酶來源于 水蛭，融合啟動子和信號肽后通過重組整合到畢赤酵母基因組進行表達。
7. 根據(jù)權利要求1所述的重組畢赤酵母，其特征在于，所述透明質酸酶基因分別采用 不同強度的組成型啟動子控制表達，包括GAP、TEF1或YPT1。
8. -種構建權利要求1-5, 7任一所述重組畢赤酵母的方法，主要包括以下步驟： (1) 構建透明質酸的合成途徑：將編碼透明質酸合酶的基因 hasA與啟動子GAP融合， 將編碼UDP-葡萄糖脫氫酶的基因 tuaD與啟動子TEF1融合，將兩個融合片段再融合后連接 表達載體，轉化畢赤酵母得到含透明質酸合成途徑的畢赤酵母； (2) 偶聯(lián)表達透明質酸酶：將透明質酸酶基因融合啟動子、信號肽后整合到步驟（1)所 得重組畢赤酵母的基因組中，獲得偶聯(lián)分泌表達透明質酸酶的重組畢赤酵母。
9. 根據(jù)權利要求8所述的方法，其特征在于，步驟⑵信號肽采用α-因子信號肽，啟 動子采用GAP、TEF1或ΥΡΤ1。
10. -種應用權利要求1-5,7任一所述重組畢赤酵母發(fā)酵產小分子透明質酸或寡聚透 明質酸的方法，是以甘油、甲醇、山梨醇或葡萄糖作為碳源，在20-30°C，發(fā)酵48-96h。
【文檔編號】C12P19/26GK104263666SQ201410467076
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2014年9月12日 優(yōu)先權日:2014年9月12日
【發(fā)明者】陳堅, 堵國成, 康振, 金鵬 申請人:江南大學