一種從小球藻中提取多糖的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種從小球藻中提取多糖的方法，包括將小球藻種進(jìn)行多級培養(yǎng)和將培養(yǎng)所得小球藻采用無機堿溶液進(jìn)行提取的步驟，其中小球藻種一級培養(yǎng)采用的是不含葡萄糖的培養(yǎng)基。本發(fā)明的方法所得小球藻生物量產(chǎn)量高，從所得小球藻中可以簡捷方便的獲得小球藻的主要成分：小球藻多糖。與傳統(tǒng)方法相比較，本發(fā)明方法易行、操作方便、安全可靠且所用設(shè)備簡單、成本低，適用于工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。
【專利說明】一種從小球藻中提取多糖的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種從小球藻中提取獲得小球藻多糖類物質(zhì)的方法，屬于化工領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 小球藻屬于綠藻門、綠藻綱、綠球藻目、小球藻科、小球藻屬，是一種球形單細(xì)胞淡 水藻類，直徑3?8微米，是一種高效的光合植物，分布極廣。小球藻中富含各種營養(yǎng)物質(zhì)， 其中碳水化合物（糖類）10%?25%，具有抗氧化、抗病毒、抗腫瘤、提高機體免疫力等活 性。目前市場上的同類多糖產(chǎn)品是從大型海藻中，如紅藻和褐藻，提取得到，對于小球藻中 的綠藻多糖的研究較少有成功的先例。
[0003] 究其原因，主要是受到兩個因素的限制，一方面是小球藻進(jìn)行光合自養(yǎng)時，生物量 較低，一般為0. 2?0. 8g/L，不適用工業(yè)生產(chǎn)；另一方面是傳統(tǒng)的多糖類成分提取方法成本 高，不易推廣應(yīng)用。
[0004] 已有的藻類中多糖成分的提取方法是熱水浸提法，此法提取溫度較高、提取時間 較長并且提取效率低下。例如謝作明、劉永定等發(fā)明的"一種從纖細(xì)席藻中提取多糖的方 法"（CN200810046770. 4)，是向纖細(xì)席藻粉中加入7?10倍重量的蒸餾水，攪勻，然后在 70?90°C下，攪拌抽提3?5小時，收集上清液，除蛋白、醇沉得纖細(xì)席藻多糖。劉永定、沈 銀武等發(fā)明的"一種利用水華藍(lán)藻提取多糖的方法"（CN200410012927. 3)，是向藍(lán)藻藻粉中 加入15?20倍重量的蒸餾水，充分濕潤，浸泡2-3小時，然后在70?92°C下，利用攪拌器 不停地攪拌抽提3?5小時，收集上清液，除蛋白、醇沉得藍(lán)藻多糖，類似方法還有很多，例 如CN200510038387. 0、CN200810015880. 4等也公開了針對其它藻類的多糖提取方法，這些 方法一方面不是針對小球藻設(shè)計的，用于小球藻中多糖物質(zhì)的提取產(chǎn)率較差，無實際應(yīng)用 價值；另一方面都是采用高溫?zé)崴岷臅r太長，雖然采用蛋白酶作為催化劑能夠提高提 取速度，但是成本大幅升高。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明公開了一種從小球藻中提取多糖的方法，通過小球 藻培養(yǎng)條件和提取方法的改進(jìn)，從小球藻生物量產(chǎn)量和多糖提取產(chǎn)率兩方面入手，不僅提 高了單位培養(yǎng)環(huán)境內(nèi)小球藻中綠藻多糖的產(chǎn)率，而且設(shè)備需求低且能耗較少，提取成本低。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過下述技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0007] -種從小球藻中提取多糖的方法，包括將小球藻種進(jìn)行多級培養(yǎng)和將培養(yǎng)所得小 球藻采用無機堿溶液進(jìn)行提取的步驟，其中小球藻種一級培養(yǎng)采用的是不含葡萄糖的培養(yǎng) 基。
[0008] 其中，在進(jìn)行二級培養(yǎng)時，采用含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)小球藻種是為了提高小球 藻的生物產(chǎn)量，從而提高單位小球藻中多糖的含量，為后續(xù)的多糖提取提供良好的基礎(chǔ)。
[0009] 上述所用的不含葡萄糖的培養(yǎng)基，可以選擇藻類植物培養(yǎng)領(lǐng)域可用的任意不含葡 萄糖的培養(yǎng)基，優(yōu)選的，考慮到小球藻的生長特性，該培養(yǎng)基的組成為硝酸鈉1. 〇?3. 0g、 磷酸氫二鉀0. 02?0. 08g、硫酸鎂0. 01?0. 06g、氯化鈣0. 002?0. OlOg、檸檬酸0. 001? 〇. 〇〇7g、檸檬酸鐵銨0. 002?0. 008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. 0005?0. 004g、碳酸鈉 0. 005?0. 05g，微量元素溶液0. 5?2. 0ml，以1000g水作為溶劑。
[0010] 其中，上述的微量元素溶液可采用市售的藻類培養(yǎng)基中所用的微量元素溶液成 品，例如微量元素溶液A5(1000ml 水中溶解!^03約2. 86g、MnCl2 ·4Η20約 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 約 0· 222g、Na2Mo04 約 0· 39g、CuS04 · 5Η20 約 0· 079g、Co (Ν03)2· 6Η20 約 0· 049g，不同廠家的 產(chǎn)品各成分含量略有變化）。
[0011] 其中，所述培養(yǎng)采用兩級培養(yǎng)法，一級培養(yǎng)將小球藻種在不含葡萄糖的培養(yǎng)基中 靜止培養(yǎng)，二級培養(yǎng)是將一級培養(yǎng)所得培養(yǎng)物稀釋在含葡萄糖的培養(yǎng)基培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng) 繼續(xù)培養(yǎng)。
[0012] 其中，上述二級培養(yǎng)所用培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域常用含葡萄糖的藻類培養(yǎng)基，優(yōu)選 的，為了保持小球藻生長的穩(wěn)定性，二級培養(yǎng)所用的含葡萄糖的培養(yǎng)基是在一級培養(yǎng)所用 不含葡萄糖的培養(yǎng)基溶液中加入適當(dāng)濃度的葡萄糖即可。
[0013] 上述一級培養(yǎng)與二級培養(yǎng)的稀釋關(guān)系可根據(jù)實際條件進(jìn)行調(diào)整，通常是按照吸光 度將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物稀釋成吸光度值為0. 2左右的稀釋藻液作為二級培養(yǎng)的基礎(chǔ)。
[0014] 上述的培養(yǎng)條件可采用藻類培養(yǎng)領(lǐng)域常見環(huán)境，結(jié)合小球藻的生長特性和所用培 養(yǎng)基的性質(zhì)，優(yōu)選一級培養(yǎng)、二級培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為光照強度3000?50001u X，溫度20? 25°C，培養(yǎng)時間5?8天。
[0015] 通過上述培養(yǎng)條件，可以有效提高小球藻的生物量達(dá)到1?2g/L。
[0016] 在提取階段，所用無機堿溶液可以是任意弱堿性無機化合物，優(yōu)選為pH值為8? 12的氫氧化鈉溶液和/或氫氧化鉀溶液。
[0017] 所采用的提取方法可以是常見藻類的提取方法，優(yōu)選為將培養(yǎng)所得小球藻藻液離 心獲得小球藻藻泥，將其冷凍干燥后研磨粉碎得到小球藻粉；將小球藻粉加入到無機堿溶 液中混勻離心收集上清液，濃縮、醇沉，即可得小球藻多糖。
[0018] 在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步還包括將所得小球藻多糖純化和收集的步驟：將所得小球藻 多糖白色絮狀物用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌沉淀物，然后將其離心收集多糖沉淀物。
[0019] 最后得到的多糖沉淀物經(jīng)冷凍干燥后即為小球藻多糖成品。
[0020] 上述提取方法最終的產(chǎn)率為12?15%左右，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)的提取方法（一般只能 達(dá)到3-5 %左右）。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1
[0022] 本發(fā)明通過以下步驟從小球藻Chlorella sp. -YL中提取多糖：
[0023] A、培養(yǎng)液的配制
[0024] 按每升水加入硝酸鈉 L 5g、磷酸氫二鉀0· 065g、硫酸鎂0· 055g、氯化鈣0· 0072g、 檸檬酸0. 〇〇66g、檸檬酸鐵銨0. 006g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. 0012g、碳酸鈉0. 02g，微量元 素溶液1. 〇ml。
[0025] 其中微量元素溶液按每升水水加入硼酸2. 86g、四水氯化錳1. 86g、七水硫酸鋅 0. 22g、二水鑰酸鈉 0. 39g、五水硫酸銅0. 08g、六水合硝酸鈷0. 05g,完全溶解后攪勻。
[0026] 二級培養(yǎng)所用培養(yǎng)基溶液在上述基礎(chǔ)上額外加入1% (質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的葡萄糖，即每 升水加入l〇g葡萄糖。
[0027] B、小球藻的培養(yǎng)
[0028] (1) -級培養(yǎng)：將小球藻種接入裝有不含葡萄糖的培養(yǎng)液的200mL錐形瓶中靜止 培養(yǎng)，每天搖瓶3次，以確保均勻的光照以及C0 2的通入和02的及時釋放，光照強度控制在 40001ux，溫度控制在25°C，當(dāng)培養(yǎng)6天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)。
[0029] (2)二級培養(yǎng)：將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物稀釋，得到吸光度值為0. 2的稀釋藻 液后，接入到裝有新的含葡萄糖培養(yǎng)液的2000ml錐形瓶中，無菌處理，光照強度控制在 4000lux，溫度控制在25°C，當(dāng)培養(yǎng)6天后，收獲。
[0030] 經(jīng)統(tǒng)計，生物量為1. 8g/L。
[0031] C、小球藻粉的制備
[0032] 將小球藻藻液離心獲得小球藻藻泥，然后將小球藻藻泥在_50°C冷凍干燥，研磨粉 碎后得到小球藻粉。
[0033] D、小球藻多糖的提取
[0034] 向小球藻粉中加入25倍體積、pH值為10.94的氫氧化鈉溶液，超聲振蕩混勻 lOmin，然后在96. 4°C提取3. 2h，在5000rpm條件下離心lOmin，收集上清液，濃縮至原體 積的約1/3,加入3倍體積95 %的乙醇溶液，在4°C冰箱中沉淀過夜，在5000rpm條件下離 心lOmin，得到絮狀沉淀物，將此沉淀物溶于蒸餾水中，按4 : lv/v加入氯仿-正丁醇（按 4 : l，v/v配制）溶液，利用混勻器充分振蕩lmin，離心，收集上層清液，再按比例加入氯 仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述步驟3次，收集最終得到的上清液，加入3倍體積95%的乙醇溶 液，在在4°C冰箱中沉淀過夜，在5000rpm條件下離心lOmin，得到白色絮狀沉淀物即為小球 藻多糖，收集多糖，以此沉淀物為計算指標(biāo)，產(chǎn)率為19. 4%。
[0035] E、純化、收獲與干燥
[0036] 純化：將白色絮狀物用無水乙醇洗滌，；再用可溶于水的丙酮洗滌，確保水分除凈； 最后用無水乙醚洗滌沉淀物，除去殘存的乙醇、丙酮和溶于其中的水分。
[0037] 收獲：將上述溶液在離心機中8000rpm離心8min，收集多糖沉淀物，以此多糖沉淀 物為計算指標(biāo)，提取產(chǎn)率為14. 2% ;
[0038] 干燥：將收集到的多糖沉淀物在_50°C冷凍干燥，得多糖產(chǎn)品。
[0039] 實施例2
[0040] 本發(fā)明通過以下步驟從小球藻Chlorella sp. -YL中提取多糖：
[0041] A、培養(yǎng)液的配制
[0042] 按每升水加入硝酸鈉2. 6g、磷酸氫二鉀0. 037g、硫酸鎂0. 015g、氯化鈣0. Olg、檸 檬酸0. 0027g、檸檬酸鐵銨0. 002g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0. 0038g、碳酸鈉0. 04g，微量元素 溶液1. 8ml，其中微量元素溶液按每升水水加入H3B032. 86g、MnCl2 ·4Η20 1. 81g、ZnS04 ·7Η20 0· 222g、Na2Mo040 . 39g、CuS04 · 5Η200· 079g、Co (N03) 2· 6H20 0· 049g，完全溶解后攪勻。
[0043] B、小球藻的培養(yǎng)
[0044] (1) -級培養(yǎng)：將小球藻種接入裝有不含葡萄糖的培養(yǎng)液的200mL錐形瓶中靜止 培養(yǎng)，每天搖瓶3次，以確保均勻的光照以及C0 2的通入和02的及時釋放，光照強度控制在 45001ux，溫度控制在25°C，當(dāng)培養(yǎng)5天后，轉(zhuǎn)入到二級培養(yǎng)。
[0045] (2)二級培養(yǎng)：將一級培養(yǎng)所得的培養(yǎng)物稀釋，得到吸光度值為0. 2的稀釋藻液 后，接入到裝有新的含有葡萄糖培養(yǎng)液的2000ml錐形瓶中，無菌處理，光照強度控制在 35001ux，溫度控制在25°C，當(dāng)培養(yǎng)6天后，收獲。
[0046] 經(jīng)統(tǒng)計，生物量為1. 82g/L。
[0047] C、小球藻粉的制備
[0048] 將小球藻藻液離心獲得小球藻藻泥，然后將小球藻藻泥在_55°C冷凍干燥，研磨粉 碎后得到小球藻粉。
[0049] D、小球藻多糖的提取
[0050] 向小球藻粉中加入22倍體積、pH值為10. 2的氫氧化鈉溶液，超聲振蕩混勻 15min，然后在85. 1°C提取3h，在4580rpm條件下離心12min，收集上清液，濃縮至原體積 的約1/3,加入2倍體積95%的乙醇溶液，在4°C冰箱中沉淀過夜，在5000rpm條件下離心 15min，得到絮狀沉淀物，將此沉淀物溶于蒸餾水中，按4 : lv/v加入氯仿-正丁醇（按 4 : l，v/v配制）溶液，利用混勻器充分振蕩2min，離心，收集上層清液，再按比例加入氯 仿-正丁醇溶液，重復(fù)上述步驟5次，收集最終得到的上清液，加入3倍體積95%的乙醇溶 液，在在4°C冰箱中沉淀過夜，在6000rpm條件下離心5min，得到白色絮狀沉淀物即為小球 藻多糖，收集多糖，以此沉淀物為計算指標(biāo)，產(chǎn)率為18. 8%。
[0051] E、純化、收獲與干燥
[0052] 純化：將白色絮狀物用無水乙醇洗滌，；再用可溶于水的丙酮洗滌，確保水分除凈； 最后用無水乙醚洗滌沉淀物，除去殘存的乙醇、丙酮和溶于其中的水分。
[0053] 收獲：將上述溶液在離心機中8000rpm離心8min，收集多糖沉淀物，以此多糖沉淀 物為計算指標(biāo)，提取產(chǎn)率為14. 7% ;
[0054] 干燥：將收集到的多糖沉淀物在_50°C冷凍干燥，得多糖產(chǎn)品。
【權(quán)利要求】
1. 一種從小球藻中提取多糖的方法，其特征在于包括將小球藻種進(jìn)行多級培養(yǎng)和將培 養(yǎng)所得小球藻采用無機堿溶液進(jìn)行提取的步驟，其中小球藻種一級培養(yǎng)采用的是不含葡萄 糖的培養(yǎng)基。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述不含葡萄糖的培養(yǎng)基的組成為硝酸鈉 1. 0?3. Og、磷酸氫二鉀0· 02?0· 08g、硫酸鎂0· 01?0· 06g、氯化鈣0· 002?0· OlOg、檸檬 酸0· 001?0· 007g、檸檬酸鐵銨0· 002?0· 008g、乙二胺四乙酸二鈉鹽0· 0005?0· 004g、 碳酸鈉〇. 005?0. 05g，微量元素溶液0. 5?2. 0ml，以1000g水作為溶劑。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于采用兩級培養(yǎng)法，一級培養(yǎng)將小球藻種在 不含葡萄糖的培養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)，二級培養(yǎng)是將一級培養(yǎng)所得培養(yǎng)物稀釋在含葡萄糖的培 養(yǎng)基中靜止培養(yǎng)繼續(xù)培養(yǎng)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于一級培養(yǎng)、二級培養(yǎng)的培養(yǎng)條件為光照強 度3000?50001ux，溫度20?25°C，培養(yǎng)時間5?8天。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述無機堿溶液為pH值為8?12的氫氧 化鈉溶液和/或氫氧化鉀溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于提取方法是將培養(yǎng)所得小球藻藻液離心獲 得小球藻藻泥冷凍干燥后研磨粉碎得到小球藻粉，將小球藻粉加入到無機堿溶液中混勻離 心收集上清液，濃縮、醇沉，即可得小球藻多糖。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于進(jìn)一步將所得小球藻多糖純化和收集的步 驟：將所得小球藻多糖白色絮狀物用無水乙醇、丙酮和無水乙醚洗滌沉淀物，然后將其離心 收集多糖沉淀物。
【文檔編號】C12P19/04GK104195198SQ201410441944
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月1日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月1日
【發(fā)明者】徐小琳, 賀瑩瑩, 代斌, 王長海 申請人:石河子大學(xué)