一種同時檢測玉米中產(chǎn)afb1、zen、don真菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種同時檢測玉米中產(chǎn)AFB1、ZEN、DON真菌的方法，對玉米樣品中的DNA進(jìn)行提取，分別根據(jù)編碼AFB1、ZEN、DON合成的基因aflR、PKS13、tri5篩選了三對引物組合，并篩選出三種引物組合的多重PCR反應(yīng)條件，并采用多重PCR法對所提取的DNA中的三個目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而建立了一種能夠同時快速檢測玉米中三種產(chǎn)毒素真菌的方法。
【專利說明】-種同時檢測玉米中產(chǎn)AFB1、ZEN、DON真菌的方法 (一）
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用多重PCR方法同時檢測玉米中存在的產(chǎn)黃曲霉毒素 B1、玉米 赤霉烯酮、嘔吐毒素真菌的方法，屬于飼料【技術(shù)領(lǐng)域】。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 玉米在大田、儲存和運(yùn)輸過程中均可感染多種霉菌，如曲霉屬、青霉屬、鐮刀菌屬 真菌等，而且玉米所含有的營養(yǎng)成分及合適的水分含量，極適宜這些真菌的生長，并利于其 產(chǎn)生霉菌毒素，其中最主要的霉菌毒素是黃曲霉毒素 B1 (AFB1)、玉米赤霉烯酮（ZEN)、嘔吐 毒素（DON)。這些霉菌毒素造成飼料的飼喂價值降低，對畜禽的組織功能、健康產(chǎn)生不利影 響，甚至導(dǎo)致死亡，影響?zhàn)B殖效益。因此，對于霉菌毒素以及產(chǎn)毒真菌的檢測顯得至關(guān)重要。 目前常用的檢測方法包括薄層層析、液相色譜、免疫化學(xué)分析等，主要基于對所產(chǎn)生的霉菌 毒素的檢測，無法檢出己被產(chǎn)毒真菌污染但尚未產(chǎn)毒的高風(fēng)險樣品。多重PCR檢測方法，可 在單一泳道反應(yīng)體系中同時檢測多個DNA模板或同一模板的不同區(qū)域，具有快捷、高效、低 成本等優(yōu)點，被廣泛應(yīng)用于有害微生物檢測，因此該方法可用于對產(chǎn)毒真菌進(jìn)行檢測。 (三）
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種同時檢測玉米中AFB1、ZEN、DON真菌的方 法；目的是設(shè)計了三對引物并將其組合，同時建立起三對引物組合的多重PCR反應(yīng)條件，提 供了一種多重PCR法，用于同時擴(kuò)增編碼AFB1、ZEN、DON等毒素合成的基因 aflR、PKS13、 tri5,實現(xiàn)對玉米中可能存在的具有產(chǎn)毒風(fēng)險的真菌進(jìn)行檢測。
[0004] 本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的：對玉米樣品中的DNA進(jìn)行提取，分別根據(jù)編碼AFB1、ZEN、 DON合成的基因 aflR、PKS13、tri5設(shè)計篩選了三對引物組合，并篩選出三種引物組合的多 重PCR反應(yīng)條件，采用多重PCR法對所提取的DNA中的三個目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，從而建立一 個能夠同時檢測玉米中三種產(chǎn)毒素真菌的方法，實現(xiàn)對玉米中潛藏性產(chǎn)毒素真菌的預(yù)警。
[0005] -種同時檢測玉米中產(chǎn)黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮、嘔吐毒素真菌的方法，包括 以下步驟：
[0006] 1、根據(jù)Genebank上已發(fā)表的aflR、PKS13和tri5基因序列，設(shè)計的引物組合為： 一對針對aflR的特異性引物SEQ1和SEQ2 ; -對針對PKS13的特異性引物SEQ3和SEQ4 ; - 對針對tri5的特異性引物SEQ5和SEQ6 ;
[0007] SEQ1 :5'-GCACCCTGTCTTCCCTAACA-3'
[0008] SEQ2 :5'-ACGACCATGCTCAGCAAGTA-3'
[0009] SEQ3 :5'-CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC-3'
[0010] SEQ4:5'-CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3'
[0011] SEQ5 :5'-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3'
[0012] SEQ6 :5'-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3'
[0013] 2、常規(guī)方法提取玉米樣品DNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系為：
[0014] lOXTaq PCR Buffer(含 Mg2+) :2· 5μ L ;
[0015] dNTP Mix (2. 5mM each) ：2. Ο μ L ；
[0016] 引物aflR、PKS13、tri5的上游引物各l.OyL，下游引物各l.OyL;
[0017] 提取到的 DNA :500ng ;
[0018] Taq DNA 酶（5U/ μ L) :0· 25 μ L ;
[0019] 用不含RNA酶的滅菌水定容至25 μ L。
[0020] 多重PCR擴(kuò)增程序如下：
[0021] 首輪循環(huán)：預(yù)變性，94°C，2min ;
[0022] 中間循環(huán)：變性，94°C，30s ;復(fù)性，60°C，30s ;延伸，72°C，30s ;進(jìn)行30個循環(huán)
[0023] 末輪循環(huán)：延伸，72°C，lOmin。
[0024] 3、對步驟2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測：如果從樣品中擴(kuò)增出 192bp的產(chǎn)物，則待檢玉米樣品中有產(chǎn)生ZEN的真菌；如果從樣品中擴(kuò)增出400bp的產(chǎn)物， 則待檢玉米樣品中有產(chǎn)生AFB1的真菌；如果從樣品中擴(kuò)增出658bp的產(chǎn)物，則待檢玉米樣 品中有產(chǎn)生DON的真菌。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：作為一種可同時檢測產(chǎn)AFB1、ZEN、D0N真菌的方法，適用于 生產(chǎn)中對玉米中潛藏性產(chǎn)毒素真菌的檢測，簡單準(zhǔn)確，可以實現(xiàn)對玉米原料是否受到真菌 污染的準(zhǔn)確把握，進(jìn)而預(yù)防原料毒素超標(biāo)引起的飼料產(chǎn)品質(zhì)量問題。
[0026] (四）【專利附圖】
【附圖說明】
[0027] 圖1第1批次玉米樣品多重PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0028] 在圖1中可以看到，除4號樣品外，其余樣品均同時擴(kuò)增出了編碼DON合成的基因 tri5和編碼ZEN合成的基因 PKS13,由此推知除4號樣品外，其余樣品均污染了產(chǎn)DON和 ZEN的真菌，這些玉米樣品如果用于飼料的加工生產(chǎn)，將有可能導(dǎo)致飼料中含有DON和ZEN ; 圖中只有9號樣品擴(kuò)增到了編碼AFB1合成的基因 aflR，其余樣品中均沒有該條帶，由此可 知，9號玉米樣品污染有產(chǎn)AFB1的真菌。
[0029] 圖2第2批次玉米樣品多重PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0030] 圖2中6個樣品均同時擴(kuò)增到了三條目的條帶，即6個樣品中均含有產(chǎn)AFBUZEN 和DON的真菌。 (五）【具體實施方式】
[0031] 實施例1
[0032] 1、稱取過60目篩且經(jīng)過液氮條件下研磨的玉米樣品0.2g置于離心管中，使用 Omega公司的Fungal DNA Kit按下述方法提取真菌DNA:加入1000 μ L Buffer FG1和濃度 為20mg/mL的蛋白酶Κ10μ L，劇烈震蕩，使樣品混勻；65°C水浴30min，其間取出離心管混 勻2-3次；加入140 μ L Buffer FG2,混勻，10000 Xg離心10min ;取600 μ L上清液至新的 離心管中，加入420 μ L異丙醇，混勻；迅速放入離心機(jī)，10000 Xg離心2min ;小心棄去上清 液，確保沉淀不隨上清液流出，將離心管倒置lmin，去除殘余液體；向離心管中加入預(yù)熱至 65°C的滅菌水300 μ L使沉淀溶解，再加入4 μ L RNA酶，混勻；加入300 μ L Buffer FG3和 300 μ L無水乙醇，混勻；并將上述混勻的混合物加入吸附柱（按照試劑盒說明書組合吸附 柱和2mL離心管），10000Xg離心lmin，棄去濾液和離心管；將吸附柱移至新的離心管中， 加入700 μ L按試劑盒說明書要求用稀釋過的DNA Wash Buffer洗滌吸附柱，lOOOOXg離 心lmin，棄去濾液，并重復(fù)該步驟1次；12000Xg離心上一步的吸附柱2min ;然后將吸附柱 移至1. 5mL滅菌離心管，加入100 μ L預(yù)熱至65°C的Elution Buffer,室溫孵育2?3min, lOOOOXg離心lmin，釋放吸附柱中的DNA。所得DNA-20°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0033] 本步驟中所使用的試劑均由Fungal DNA Kit試劑盒提供。其中蛋白酶K購自北 京索萊寶科技有限公司。
[0034] 2、所設(shè)計的引物序列如表1所示：
[0035] 表1引物序列
[0036]
【權(quán)利要求】
1. 一種同時檢測玉米中產(chǎn)黃曲霉毒素 B1、玉米赤霉烯酮和嘔吐毒素真菌的方法，其特 征在于所采用的引物組合為：一對針對aflR的特異性引物SEQ1和SEQ2 ; -對針對PKS13 的特異性引物SEQ3和SEQ4 ; -對針對tri5的特異性引物SEQ5和SEQ6 ; SEQ1 :5'-GCACCCTGTCTTCCCTAACA-3' SEQ2 :5'-ACGACCATGCTCAGCAAGTA-3' SEQ3 :5'-CTGAGAAATATCGCTACACTACCGAC-3' SEQ4 :5'-CCCACTCAGGTTGATTTTCGTC-3' SEQ5 :5'-GCTGCTCATCACTTTGCTCAG-3' SEQ6 :5'-CTGATCTGGTCACGCTCATC-3' 上述引物組合的使用方法如下： 1) 常規(guī)方法提取玉米樣品DNA,進(jìn)行PCR反應(yīng)；反應(yīng)體系為： 10. Taq PCR Buffer (含 Mg2+) :2· 5 μ L ; dNTP Mix(2. 5mM each) ：2. 0 μ L ； 引物aflR、PKS13、tri5的上游引物各1. 0 μ L，下游引物各1. 0 μ L ; 提取到的DNA :500ng ; Taq DNA 酶（5U/ μ L) :0· 25 μ L ; 用不含RNA酶的滅菌水定容至25 μ L。 多重PCR擴(kuò)增程序如下： 首輪循環(huán)：預(yù)變性，94°C，2min ; 中間循環(huán)：變性，94°C，30s ;復(fù)性，60°C，30s ;延伸，72°C，30s ;進(jìn)行30個循環(huán) 末輪循環(huán)：延伸，72°C，10min ; 2) 對步驟2)得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠檢測：如果從樣品中擴(kuò)增出192bp 的產(chǎn)物，則待檢玉米樣品中有產(chǎn)生ZEN的真菌；如果從樣品中擴(kuò)增出400bp的產(chǎn)物，則待檢 玉米樣品中有產(chǎn)生AFB1的真菌；如果從樣品中擴(kuò)增出658bp的產(chǎn)物，則待檢玉米樣品中有 產(chǎn)生DON的真菌。
【文檔編號】C12Q1/68GK104152574SQ201410432481
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月27日
【發(fā)明者】林海, 焦洪超, 伏春燕, 宋志剛 申請人:山東農(nóng)業(yè)大學(xué)