用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于干細胞【技術領域】，涉及一種用于制備胎盤干細胞的試劑盒，該試劑盒包括胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液II、消化終止液、細胞分離液、細胞凍存液；胎盤保存液為含青霉素100?200yg/ml、鏈霉素100?200yg/ml、兩性霉素2.5?5yg/ml、肝素納注射液0.5?1.5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640培養(yǎng)基；本發(fā)明的試劑盒可在較短時間內獲得大量胎盤干細胞，使用方便。
【專利說明】用于制備胎盤干細胞的試劑盒
[0001]
【技術領域】
[0002] 本發(fā)明屬于干細胞【技術領域】，涉及一種用于制備胎盤干細胞的試劑盒。
【背景技術】
[0003] 胎盤干細胞指的是存在于胎盤組織中的干細胞。目前已知證明的胎盤干細胞包 括造血干細胞、間充質干細胞、亞全能干細胞等多種干細胞。近十年內，隨著胎盤干細胞 產業(yè)化技術的出現(xiàn)和臨床應用的不斷推進，國際上關于胎盤干細胞的研究成果呈現(xiàn)了井 噴之勢。2008年，M. Evangelista等發(fā)表論著稱，胎盤干細胞是未來細胞治療的新希望 這一事實。隨后的幾年里，針對胎盤干細胞的研究如雨后春筍般出現(xiàn)。2012年，美國奧克 蘭研究所兒童醫(yī)院的研究者稱胎盤干細胞具有的高度治療應用價值。2013年，韓國"CHA BI0&DI0STECH"干細胞研究所的文智淑教授組發(fā)表聲明，稱首次證實利用產生于人類胎盤 的成體干細胞可以治愈老年性癡呆癥。Celgene是世界上第六大生物制藥企業(yè)，目前藥物研 發(fā)中涉及到胎盤干細胞的藥物，主要針對克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、關節(jié)炎、肉狀瘤病，分別 在一期臨床和二期臨床。
[0004] 胎盤造血干細胞為造血干細胞移植提供了新的來源。造血干細胞是紅細胞、白細 胞、血小板等的鼻祖，是高度未分化的細胞，是一切血細胞和免疫細胞的原始細胞。造血干 細胞移植可治療惡性血液病，部分惡性腫瘤，部分遺傳性疾病等十幾種致死性疾病。數(shù)量豐 富，是臍帶血的5?10倍，突破了臍帶血來源造血干細胞30kg體重使用的瓶頸，可以提供 自體干細胞足夠的數(shù)量重建成年人的造血系統(tǒng)。
[0005] 胎盤亞全能干細胞是來源于新生兒胎盤組織的一族胚胎后亞全能干細胞，其在發(fā) 育階段與胚胎干細胞接近，具備分化形成三個胚層的組織細胞的能力，但與胚胎干細胞的 不同之處是不會形成畸胎瘤，這一特性使亞全能干細胞可以直接用于體內而不必擔心在體 內產生畸胎瘤。胎盤亞全能干細胞具有強大的增殖能力和多向分化潛能。在適宜的體內或 體外環(huán)境下具有分化為間充質干細胞、上皮干細胞、神經干細胞、肝干細胞，肌細胞、成骨細 胞、軟骨細胞、基質細胞等多種細胞的能力?？梢杂脕硇迯褪軗p或病變的組織器官，治療心、 腦血管疾病、神經系統(tǒng)疾病、肝臟疾病、骨組織病、角膜損傷、燒傷燙傷、肌病等多種疾病。 胎盤間充質干細胞不僅具有干細胞的共性即無限增殖能力和多向分化潛能，還具有以下優(yōu) 勢：1)具有低免疫原性以及免疫抑制作用，這就使得治療用的間充質干細胞不僅可以來源 于自體，也可以來源于異體；2)具有強大的免疫調節(jié)作用，使得移植的間充質干細胞在修復 受損組織的同時，還可以調節(jié)患者的免疫狀態(tài)；3)具有向特定細胞定向分化的特性，避免了 胚胎干細胞等全能干細胞致瘤性風險；4)來源非常廣泛，骨髓、胎盤臍帶為富含間充質干細 胞的部位，此外在脂肪、臍帶血以及其他成體組織器官中也能分離到MSC。
[0006] 胎盤干細胞從開始就受到國際上無數(shù)專家的關注。目前已經在臨床上廣泛開展應 用研究，治療相關的疾病包括：重型再生障礙性貧血、骨髓增生異常綜合征、白血病等惡性 或非惡性血液疾病，還有二型糖尿病、特發(fā)性肺纖維化、強直性脊柱炎、潰瘍性結腸炎等非 血液系統(tǒng)疾病。
[0007] 胎盤干細胞具有廣闊的臨床應用前景。因此，開發(fā)簡單、快速、高新、安全獲得大量 胎盤干細胞方法成為當務之急，而目前現(xiàn)有技術中還未有用于制備胎盤干細胞的試劑盒， 使得相關科研工作進展緩慢。
【發(fā)明內容】
[0008] 本發(fā)明目的是為了彌補現(xiàn)有技術中存在的不足，提供一種使用方便，成本低廉的 用于制備獲得大量胎盤干細胞的試劑盒。
[0009] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案是：一種用于制備胎盤干細胞的試劑盒， 包括胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液II、消化終止 液、細胞分離液、細胞凍存液。
[0010] 所述胎盤保存液為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素 2. 5?5 μ g/ml、月干素納注身寸液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/ F12、MEM 或 RPMI-1640 培養(yǎng)基。
[0011] 所述胎盤洗滌液I為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉 素2. 5?5 μ g/ml、肝素鈉注射液0. 5?I. 5mg/ml的生理鹽水、PBS、D-Hanks或HBSS。
[0012] 所述胎盤洗滌液II為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉 素2. 5?5 μ g/ml、肝素鈉注射液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的生理鹽水、 PBS、D-Hanks 或 HBSS。
[0013] 所述組織分解液I為含IV型膠原酶0. 5?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培養(yǎng)基。
[0014] 所述組織分解液II為含胰蛋白酶0· 5?2. 5mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培養(yǎng)基。
[0015] 所述消化終止液為0. 2g/ml的人血白蛋白。
[0016] 所述細胞分離液為60mg/ml的羥乙基淀粉。
[0017] 所述細胞凍存液為含 CryoSure_DEX40 0· 1 ?0· 3mg/ml 的 Knockout? SR。
[0018] 本發(fā)明提供了一種制備胎盤干細胞的試劑盒。該試劑盒中，胎盤保存液的作用是 保證胎盤標本在采集之后的運輸過程中的活性，并消滅和預防細菌、真菌。胎盤洗滌液I、 胎盤洗滌液II的作用是洗滌除去胎盤組織的血液細胞，同時消滅和預防細菌、真菌。組織分 解液I、組織分解液II的作用是消化胎盤組織，獲得單細胞懸液。消化終止液的作用是終止 組織分解液的消化作用。細胞分離液的作用去除紅細胞，獲得單個核細胞。細胞凍存液的 作用是凍存獲得的胎盤干細胞。
[0019] 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒，可在短短的3h內獲得大量胎盤干細胞 (細胞數(shù)量可達IO 9數(shù)量級)，并且具有使用方便，成本低廉，無血清，減少動物來源的病原體 感染風險，更安全等特點，將在干細胞臨床試驗及其相關研究中發(fā)揮重要作用，應用前景極 為廣泛。
【具體實施方式】
[0020] 下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規(guī)方法，所需試劑耗材及實驗儀器等 均可通過商業(yè)途徑購得。
[0021] 實施例一用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備及應用 一、用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備 1、溶液配置 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒包括以下試劑： (1)胎盤保存液配置方法：青霉素（品牌Amresco,貨號0242) 100mg、鏈霉素（品牌 Amresco,貨號0382) 100mg、兩性霉素（品牌Amresco,貨號E437) 2. 5mg、人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格20% :50ml) 2. 5g、肝素鈉注射液(廠家：成都市海通藥業(yè)有限公司，規(guī)格2ml : 5000 單位）0. 5g，溶于 500ml RPMI-1640 培養(yǎng)基中。
[0022] (2)胎盤洗漆液I配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、肝素鈉注 射液lg，溶于1000ml生理鹽水中。
[0023] (3)胎盤洗漆液II配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素鈉注射液lg，溶于1000ml生理鹽水中。
[0024] (4)組織分解液I配置方法：IV型膠原酶（品牌sigma，貨號C5138)l g溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中，0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0025] (5)組織分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0026] (6)消化終止液配置方法：購買的商品化濃度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格 20% :50ml)。
[0027] (7)細胞分離液配置方法：購買的商品化60mg/ml羥乙基淀粉(廠家：北京費森尤 斯卡比醫(yī)藥有限公司，規(guī)格500ml :30g羥乙基淀粉130/0. 4與4. 5g氯化鈉)。
[0028] (8)細胞凍存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 (品牌WAK，規(guī)格50ml)緩慢加入 到 80ml Knockout? SR (品牌 Life Technologies，貨號 N10828028 )中，輕輕混勻即可。
[0029] 2、各組分的分裝 試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：胎盤保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盤洗 滌液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盤洗滌液II 2瓶（500ml/瓶)，組織分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 組織分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化終止液1瓶（20ml/瓶)，細胞分離液1瓶（IOOrnl/瓶)， 細胞凍存液1瓶（50ml/瓶)。
[0030] 按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備胎盤干細胞的 試劑盒。試劑盒中胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液 II、細胞凍存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱內或者37°C水浴解凍，解凍之 后4°C保存，一個月內用完；試劑盒中消化終止液、細胞分離液于室溫避光保存，有效期為2 年。
[0031] 二、胎盤干細胞的制備 現(xiàn)用步驟一中的試劑盒制備胎盤干細胞，具體制備方法包括以下步驟，以一份完整的 胎盤為例，所有操作步驟均在潔凈工作臺完成： 1、胎盤運輸：采集一份完整的胎盤，加入適量的胎盤保存液，以浸沒過胎盤為宜，2? 8°C恒溫保存在疫苗箱中，24h內送至實驗室。
[0032] 2、洗滌胎盤：吸棄胎盤保存液，加入適量體積的胎盤洗滌液I，反復振蕩幾次，吸 棄胎盤洗滌液I，同上，再加入適量體積的胎盤洗滌液I振蕩洗滌2?3次，直至胎盤表面 的血漬洗滌干凈。去除胎盤表面的羊膜和蛻膜，加入適量體積的胎盤洗滌液II，將胎盤組織 剪碎，并將組織塊內的血液清洗干凈，收集胎盤洗滌液II，于ISOOrpm室溫離心lOmin，棄上 清，用50ml胎盤洗滌液II重懸細胞沉淀，按胎盤洗滌液II :細胞分離液=4:1的比例加入細 胞分離液，混合均勻后于室溫靜置30min后分層，收集上層液體。
[0033] 3、消化胎盤：收集剪碎的胎盤組織塊，加入與胎盤組織塊等體積的組織分解液I， 于37°C水浴搖床中消化20?30min，之后再加入胎盤組織塊1/4體積的組織分解液II，于 37°C水浴搖床中消化10?20min。將兩次消化后胎盤組織塊經200目分析篩過濾收集濾 液，加入消化終止液IOml,混勻后于1800rpm室溫離心IOmin,棄上清,用適量的胎盤洗漆液 II重懸細胞沉淀，按胎盤洗滌液II :細胞分離液=4:1的比例加入細胞分離液，混合均勻后 于300rpm室溫離心IOmin,收集上層液體。
[0034] 4、收獲細胞：合并步驟2和3中收集的上層液體，于血液分析儀中測得單個核細胞 的數(shù)量為4. 06 X IO9個。
[0035] 5、細胞凍存：將上述獲得細胞懸液于1800rpm室溫離心lOmin，棄上清，緩慢加入 細胞凍存液，輕輕混勻，然后在凍存袋上表明細胞的基本信息，于程控降溫儀中降至_80°C 后，轉移到液氮中長期保存。待使用時復蘇即可。
[0036] 可以看出，用本發(fā)明的試劑盒，在較短時間3h內，由一份完整的胎盤，可獲得大量 的胎盤干細胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內獲得大量胎盤干細胞。
[0037] 實施例二用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備及應用 一、用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備 1、溶液配置 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒包括以下試劑： (1)胎盤保存液配置方法：青霉素50mg、鏈霉素50mg、兩性霉素I. 25mg、人血白蛋白 I. 25g、肝素鈉注射液0. 25g，溶于500ml DMEM培養(yǎng)基中。
[0038] (2)胎盤洗漆液I配置方法：青霉素lOOmg、鏈霉素lOOmg、兩性霉素2. 5mg、肝素鈉 注射液〇. 5g，溶于IOOOmlPBS中。
[0039] (3)胎盤洗漆液II配置方法：青霉素lOOmg、鏈霉素lOOmg、兩性霉素2. 5mg、人血白 蛋白2. 5g、肝素鈉注射液0. 5g，溶于IOOOmlPBS中。
[0040] (4)組織分解液I配置方法：IV型膠原酶I g溶于500ml DMEM培養(yǎng)基中，0· 22um 濾器過濾除菌即可。
[0041] (5)組織分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml DMEM培養(yǎng)基中，0· 22um 濾器過濾除菌即可。
[0042] (6)消化終止液配置方法：購買的商品化濃度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格 20% :50ml)。
[0043] (7)細胞分離液配置方法：購買的商品化60mg/ml羥乙基淀粉(廠家：北京費森尤 斯卡比醫(yī)藥有限公司，規(guī)格500ml :30g羥乙基淀粉130/0. 4與4. 5g氯化鈉)。
[0044] (8)細胞凍存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 緩慢加入到 80ml Knockout? SR 中，輕輕混勻即可。
[0045] 2、各組分的分裝 試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：胎盤保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盤洗 滌液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盤洗滌液II 2瓶（500ml/瓶)，組織分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 組織分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化終止液1瓶（20ml/瓶)，細胞分離液1瓶（IOOml/瓶)， 細胞凍存液1瓶（50ml/瓶)。
[0046] 按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備胎盤干細胞的 試劑盒。試劑盒中胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液 II、細胞凍存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱內或者37°C水浴解凍，解凍之 后4°C保存，一個月內用完；試劑盒中消化終止液、細胞分離液于室溫避光保存，有效期為2 年。
[0047] 二、胎盤干細胞的制備 用步驟一的試劑盒，參考實施例一中方法制備胎盤干細胞，并用相同的方法對獲得的 胎盤干細胞進行計數(shù)，結果一份完整的胎盤，經過3h的分離即可得到4. 18X IO9個單個核 細胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內獲得大量胎盤干細胞。
[0048] 實施例三用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備及應用 一、用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備 1、溶液配置 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒包括以下試劑： (1)胎盤保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、鏈霉素100mg、兩性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素鈉注射液0. 5g，溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中。
[0049] (2)胎盤洗漆液I配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、肝素鈉注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0050] (3)胎盤洗漆液II配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素鈉注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0051] (4)組織分解液I配置方法：IV型膠原酶0· 5g溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0052] (5)組織分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0053] (6)消化終止液配置方法：購買的商品化濃度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格 20% :50ml)。
[0054] (7)細胞分離液配置方法：購買的商品化60mg/ml羥乙基淀粉(廠家：北京費森尤 斯卡比醫(yī)藥有限公司，規(guī)格500ml :30g羥乙基淀粉130/0. 4與4. 5g氯化鈉)。
[0055] (8)細胞凍存液配置方法：20ml CryoSure_DEX40 緩慢加入到 80ml Knockout? SR 中，輕輕混勻即可。
[0056] 2、各組分的分裝 試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：胎盤保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盤洗 滌液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盤洗滌液II 2瓶（500ml/瓶)，組織分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 組織分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化終止液1瓶（20ml/瓶)，細胞分離液1瓶（IOOrnl/瓶)， 細胞凍存液1瓶（50ml/瓶)。
[0057] 按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備胎盤干細胞的 試劑盒。試劑盒中胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液 II、細胞凍存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱內或者37°C水浴解凍，解凍之 后4°C保存，一個月內用完；試劑盒中消化終止液、細胞分離液于室溫避光保存，有效期為2 年。
[0058] 二、胎盤干細胞的制備 用步驟一的試劑盒，參考實施例一中方法制備胎盤干細胞，并用相同的方法對獲得的 胎盤干細胞進行計數(shù)，結果一份完整的胎盤，經過3h的分離即可得到3. 83 X IO9個單個核 細胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內獲得大量胎盤干細胞。
[0059] 實施例四用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備及應用 一、用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備 1、溶液配置 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒包括以下試劑： (1)胎盤保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、鏈霉素100mg、兩性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素鈉注射液0. 5g，溶于500ml DMEM/F12培養(yǎng)基中。
[0060] (2)胎盤洗漆液I配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、肝素鈉注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0061] (3)胎盤洗漆液II配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素鈉注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0062] (4)組織分解液I配置方法：IV型膠原酶0. 25g溶于500ml DMEM/F12培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0063] (5)組織分解液II配置方法：胰蛋白酶I. 25g溶于500ml DMEM/F12培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0064] (6)消化終止液配置方法：購買的商品化濃度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格 20% :50ml)。
[0065] (7)細胞分離液配置方法：購買的商品化60mg/ml羥乙基淀粉。
[0066] (8)細胞凍存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 緩慢加入到 80ml Knockout? SR 中，輕輕混勻即可。
[0067] 2、各組分的分裝 試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：胎盤保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盤洗 滌液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盤洗滌液II 2瓶（500ml/瓶)，組織分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 組織分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化終止液1瓶（20ml/瓶)，細胞分離液1瓶（IOOrnl/瓶)， 細胞凍存液1瓶（50ml/瓶)。
[0068] 按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備胎盤干細胞的 試劑盒。試劑盒中胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液 II、細胞凍存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱內或者37°C水浴解凍，解凍之 后4°C保存，一個月內用完；試劑盒中消化終止液、細胞分離液于室溫避光保存，有效期為2 年。
[0069] 二、胎盤干細胞的制備 用步驟一的試劑盒，參考實施例一中方法制備胎盤干細胞，并用相同的方法對獲得的 胎盤干細胞進行計數(shù)，結果一份完整的胎盤，經過3h的分離即可得到3. 91 X IO9個單個核 細胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內獲得大量胎盤干細胞。
[0070] 實施例五用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備及應用 一、用于制備胎盤干細胞的試劑盒的制備 1、溶液配置 本發(fā)明的用于制備胎盤干細胞的試劑盒包括以下試劑： (1)胎盤保存液配置方法：青霉素l〇〇mg、鏈霉素100mg、兩性霉素2. 5mg、人血白蛋白 2. 5g、肝素鈉注射液0. 5g，溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中。
[0071] (2)胎盤洗漆液I配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、肝素鈉注 射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0072] (3)胎盤洗漆液II配置方法：青霉素200mg、鏈霉素200mg、兩性霉素5mg、人血白蛋 白5g、肝素鈉注射液lg，溶于IOOOmlPBS中。
[0073] (4)組織分解液I配置方法：IV型膠原酶Ig溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0074] (5)組織分解液II配置方法：胰蛋白酶0. 25g溶于500ml RPMI-1640培養(yǎng)基中， 0· 22um濾器過濾除菌即可。
[0075] (6)消化終止液配置方法：購買的商品化濃度0.2g/ml的人血白蛋白（品牌： GRIF0LS，規(guī)格 20% :50ml)。
[0076] (7)細胞分離液配置方法：購買的商品化60mg/ml羥乙基淀粉(廠家：北京費森尤 斯卡比醫(yī)藥有限公司，規(guī)格500ml :30g羥乙基淀粉130/0. 4與4. 5g氯化鈉)。
[0077] (8)細胞凍存液配置方法：20ml CryoSure-DEX40 緩慢加入到 80ml Knockout? SR 中，輕輕混勻即可。
[0078] 2、各組分的分裝 試劑盒的規(guī)格為1次/盒，每盒中各組分的量為：胎盤保存液1瓶（500ml/瓶)，胎盤洗 滌液I 2瓶（500ml/瓶)，胎盤洗滌液II 2瓶（500ml/瓶)，組織分解液I 1瓶（500ml/瓶)， 組織分解液II 1瓶（300ml/瓶)，消化終止液1瓶（20ml/瓶)，細胞分離液1瓶（IOOrnl/瓶)， 細胞凍存液1瓶（50ml/瓶)。
[0079] 按照上述試劑量對試劑盒中各組分進行分裝，包裝得到用于制備胎盤干細胞的 試劑盒。試劑盒中胎盤保存液、胎盤洗滌液I、胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液 II、細胞凍存液于-20°c保存，有效期2年，使用之前4°C冰箱內或者37°C水浴解凍，解凍之 后4°C保存，一個月內用完；試劑盒中消化終止液、細胞分離液于室溫避光保存，有效期為2 年。
[0080] 二、胎盤干細胞的制備 用步驟一的試劑盒，參考實施例一中方法制備胎盤干細胞，并用相同的方法對獲得的 胎盤干細胞進行計數(shù)，結果一份完整的胎盤，經過3h的分離即可得到3. 77 X IO9個單個核 細胞，表明本發(fā)明的試劑盒可以在較短時間內獲得大量胎盤干細胞。
【權利要求】
1. 一種用于制備胎盤干細胞的試劑盒，其特征在于：包括胎盤保存液、胎盤洗滌液I、 胎盤洗滌液II、組織分解液I、組織分解液II、消化終止液、細胞分離液、細胞凍存液。所述 胎盤保存液為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素2. 5?5 μ g/ ml、肝素鈉注射液0· 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或 RPMI-1640 培養(yǎng)基； 所述胎盤洗滌液I為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素 2. 5?5 μ g/ml、肝素鈉注射液0· 5?I. 5mg/ml的生理鹽水、PBS、D-Hanks或HBSS ; 所述胎盤洗滌液II為含青霉素100?200ug/ml、鏈霉素100?200ug/ml、兩性霉素 2. 5?5 μ g/ml、肝素鈉注射液0. 5?I. 5mg/ml、人血白蛋白5?10mg/ml的生理鹽水、PBS、 D-Hanks 或 HBSS ; 所述組織分解液I為含IV型膠原酶0. 5?2mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640 培養(yǎng)基； 所述組織分解液II為含胰蛋白酶0. 5?2. 5mg/ml的DMEM、DMEM/F12、MEM或RPMI-1640 培養(yǎng)基； 所述消化終止液為〇. 2g/ml的人血白蛋白； 所述細胞分離液為60mg/ml的羥乙基淀粉； 所述細胞凍存液為含 CryoSure_DEX40 0· 1 ?0· 3mg/ml 的 Knockout? SR。
【文檔編號】C12N5/074GK104212761SQ201410411126
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月20日 優(yōu)先權日:2014年8月20日
【發(fā)明者】徐沖, 張炳強 申請人:北京瑞思德生物科技有限公司