一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用的制作方法

一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用。本發(fā)明成功地在體外表達純化NopL及其突變體，并進行磷酸化實驗，發(fā)現(xiàn)NopL能直接被SIPK所磷酸化，這是首次發(fā)現(xiàn)的一個能夠直接作為SIPK底物的細菌蛋白。另外通過構(gòu)建NopL缺失磷酸化位點的突變體，我們發(fā)現(xiàn)當NopL不能再被蛋白激酶磷酸化之后，它同時也喪失了其原本在與豆科植物共生過程中發(fā)揮的促進作用，說明了NopL這種促進共生的功能是磷酸化依賴的。該發(fā)現(xiàn)為進一步研究豆科植物與根瘤菌互作機制提供了新的研究方向，具備極高的理論與實踐價值。
【專利說明】一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學【技術(shù)領(lǐng)域】。更具體地，涉及一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL 的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 大量研究監(jiān)測顯示，土壤中有限的氮含量是限制農(nóng)作物生長發(fā)育的重要因素。雖 然氮以氣體形式廣泛存在，但植物在土壤中可直接吸收利用的氮則是以銨鹽或硝酸鹽形式 存在的。人們只能通過大量使用化學固氮法生產(chǎn)化肥，以保證農(nóng)作物的產(chǎn)量。然而這樣的 生產(chǎn)方法需要耗費大量的礦物燃料，并且增加溫室氣體二氧化碳的排放，而且近年來緣于 化肥的過度使用也帶來日益顯著的環(huán)境問題，這顯然不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。
[0003] 相比之下，生物固氮具有化學固氮無可比擬的優(yōu)勢。其不依賴于礦物能源，且生物 固氮本身就是大自然不斷進化的結(jié)果，是整個生態(tài)系統(tǒng)的一部分。根瘤菌侵染豆科植物并 成功定殖后，宿主根部就會形成"根瘤"這樣的特殊結(jié)構(gòu)。根瘤菌就是在這一特殊的植物器 官的保護下，通過固氮酶不斷將氮氣轉(zhuǎn)化為植物可利用的氨，同時宿主植物將光合作用合 成的碳水化合物蘋果酸鹽提供給根瘤菌作為營養(yǎng)物質(zhì)。然而每種根瘤菌僅能與有限種類和 數(shù)量的宿主進行共生固氮，換言之，根瘤菌對于不同的豆科植物具有嚴格的宿主特異性。產(chǎn) 生特異性的主要原因是因為兩者之間共生關(guān)系的形成受到了大量的信號分子調(diào)控。
[0004] 其中，由根瘤細菌分泌的、并能直接轉(zhuǎn)運至宿主細胞質(zhì)內(nèi)的蛋白是極其重要的決 定宿主特異性的因素。以根瘤菌NGR234為例，由其分泌的III型效應(yīng)蛋白NopL與植物的防 御反應(yīng)相關(guān)，能在共生過程中發(fā)揮極其顯著的促進作用，例如在與菜豆（cv. Tendergreen) 互作過程中能夠明顯的抑制根瘤細胞的早衰，延長有效根瘤的壽命從而延長固氮的周期。 另外，NopL相比其他同樣由根瘤菌NGR234分泌的III型效應(yīng)蛋白來說，分泌量居首位，因 而研究該蛋白在真核細胞中的生化功能對于研究根瘤菌與豆科植物互作的分子機制具有 極其重要的意義。目前未見有相關(guān)的研究成果和報道，NopL是如何影響根瘤細胞的早衰， 具體的機制尚不清楚，NopL影響根瘤細胞早衰真正機制的研究仍然是困擾我們的一個技術(shù) 難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有NopL抑制根瘤細胞早衰的具體機制的研究 不足，公開NopL在真核細胞中影響根瘤細胞早衰的直接機制，為根瘤固氮相關(guān)研究提供理 論基礎(chǔ)和應(yīng)用指導。
[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用，具體是在促進根瘤 菌和植物共生中的應(yīng)用。
[0007] 本發(fā)明另一目的是提供水楊酸誘導的蛋白激酶（salicylic acid induced protein kinase，SIPK)的激活劑在制備根瘤細胞早衰抑制劑方面和在構(gòu)建抗根瘤細胞早 衰的轉(zhuǎn)基因豆科植物方面的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明再一目的是提供一種編碼失活形式NopL重組蛋白的基因，其核苷酸序列 如 SEQ ID N0 :1 所示。
[0009] 本發(fā)明再一目的是提供一種失活形式NopL重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0: 2所示。
[0010] 本發(fā)明上述目的通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)： 本發(fā)明提供了磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL在促進根瘤菌與植物共生中的應(yīng)用。
[0011] 具體地，所述促進根瘤菌與植物共生是指抑制根瘤細胞的早衰。
[0012] 所述磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL是指被水楊酸誘導的蛋白激酶所磷酸化的細菌蛋 白質(zhì)NopL。
[0013] 本發(fā)明還提供了水楊酸誘導的蛋白激酶的激活劑在制備根瘤細胞早衰抑制劑方 面的應(yīng)用。
[0014] 同時也提供了水楊酸誘導的蛋白激酶的激活劑在構(gòu)建抗根瘤細胞早衰的轉(zhuǎn)基因 豆科植物方面的應(yīng)用。
[0015] 另外，本發(fā)明還提供了一種編碼失活形式NopL重組蛋白（NopL_S12xA，即NopL的 衍生體）的基因，其核苷酸序列如SEQ ID N0 :1所示。
[0016] 同時也提供了一種失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)，其氨基酸序列如SEQ ID N0 :2 所示。
[0017] 本發(fā)明還提供了一種包含有失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)的編碼基因的 克隆載體 pBS-/?o/?Z-S12xA 和表達載體 pPROEX-/7〇/?Z-S12xA。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種生產(chǎn)上述失活形式NopL重組蛋白（NopL_S12xA)的方法，包 括將含有失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)編碼基因的表達載體導入宿主細胞中，表 達得到失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)，步驟如下： 51. 人工合成一段314bp的DNA片段，核苷酸序列如SEQ ID N0 :3所示； 52. 通過feoRV-如cl酶切位點將人工設(shè)計合成的314 bp的DNA片段連入載體 pBS-/?o/?Z (Zhang eiaA, 2011)，得到重組載體 所述pBS-/?o/?Z是本實驗室構(gòu)建的包含基因全長的pBluescript載體；此步驟的 目的是要用合成的帶有5個點突變位點的314 bp片段置換野生型/70/7Z的對應(yīng)區(qū)域； 53. 以重組載體為模板，SEQ ID N0:4?15所示序列為引物，逐個進行PCR 點突變，得到重組質(zhì)粒pBS-/7〇/7Z-S12xA ; 54. 以重組質(zhì)粒pBS-/?〇M-S12xA為模板，SEQ ID勵：16?17所示序列為引物，進行卩0? 反應(yīng)；PCR產(chǎn)物經(jīng)內(nèi)切酶和及?HI雙酶切后，連接到用同樣酶雙酶切的pPROEX表達載 體，得到重組表達載體pPR0EX-/?〇M-S12xA ; 55. 將重組表達載體pPR0EX-/?〇M-S12xA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21，利用IPTG誘導表達， 純化即得失活形式NopL重組蛋白（NopL-S12xA)。
[0019] 其中，S3所述逐個進行PCR點突變的方法是依次使用一對引物進行反應(yīng)，得到的 成功突變的產(chǎn)物，用于下一次點突變PCR的模板。
[0020] 另外，細菌蛋白質(zhì)NopL作為水楊酸誘導的蛋白激酶的直接底物被磷酸化從而抑 制根瘤細胞的早衰，這一機制在研究豆科植物與根瘤菌互作機制上的應(yīng)用也在本發(fā)明的范 圍內(nèi)。
[0021] 本實驗室經(jīng)過前期工作研究，推測NopL可以干擾MAPK途徑，來影響根瘤菌與植物 的共生作用，但是對于這一推測是否正確還沒有進一步驗證和研究，而且NopL具體是如何 干擾MAPK途徑來實現(xiàn)影響根瘤菌與植物的共生的作用的，其具體機制是什么，更是一項空 白。促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase,MAPK)是一類存在于各 種真核生物體中的絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，它與其它一些信號分子組成MAPK級聯(lián)信號 通路，接受外界刺激信號，并將信號傳入細胞內(nèi)，影響特定基因的表達，從而在真核生物的 生長、發(fā)育、分化和凋亡等多方面起著重要的作用。體內(nèi)MAPK途徑是極其復(fù)雜的，MAPK家 族成員眾多，他們分別能與不同的上游信號分子和下游效應(yīng)分子組合，形成各種細胞內(nèi)信 號通路。MAPK級聯(lián)通路中底物的特異性各異，且各自具有一定的獨立性，同時又能在多個水 平上相互交聯(lián)，這樣被各異的生物和非生物的刺激所引起的信號傳導途徑在某個MAPK上 相互聯(lián)系起來，形成一個錯綜復(fù)雜的信號傳遞網(wǎng)絡(luò)。因而這些不同的信號傳遞途徑是在哪 一步整合起來的，調(diào)節(jié)機制是怎樣的，都是仍待研究的內(nèi)容。另外由于在生物體中還存在有 各種其他激酶與MAPK的性質(zhì)相似，因此，目前來說，究竟NopL是否可以干擾MAPK途徑，來 影響根瘤菌與植物的共生作用，以及其具體機制是什么的研究仍然是一個技術(shù)難題。
[0022] 為了驗證NopL能夠干擾MAPK途徑進而抑制根瘤細胞早衰這一結(jié)論，并研究其具 體的調(diào)節(jié)機制，本發(fā)明人通過大量的研究和探索，首次發(fā)現(xiàn)NopL可以直接作為真核細胞 中MAPK的底物，并且發(fā)現(xiàn)該MAPK就是水楊酸誘導的蛋白激酶（salicylic acid-induced protein kinase, SIPK)，NopL通過被MAPK直接磷酸化，進而發(fā)揮在與豆科植物互作時促進 共生固氮的作用。在研究過程中，發(fā)明人克服了一系列的技術(shù)難題，其中最大的研究難題在 于如何克服體內(nèi)MAPK途徑的復(fù)雜性和多樣性，并進一步確定NopL是直接作為真核細胞內(nèi) SIPK蛋白激酶的底物，被MAPK磷酸化，進而發(fā)揮促進根瘤細胞早衰的作用的。為了達到上 述目的，需要以大腸桿菌為宿主，在體外表達純化SIPK和MEK2 DD這兩種真核細胞中的蛋白 激酶。植物蛋白激酶在原核細胞(如大腸桿菌細胞）里純化出來往往是沒有活性的，因為它 們是真核生物里的蛋白，翻譯時使用的編碼氨基酸密碼子、mRNA、tRNA等都是來源于真核 細胞里的一套蛋白質(zhì)表達翻譯系統(tǒng)，而到了原核生物體內(nèi)，氨基酸密碼子發(fā)生變化，缺少了 真核生物里那套稀有密碼子，很可能最后在大腸桿菌里表達出的蛋白質(zhì)是一個沒有活性的 蛋白質(zhì)，或者水溶性很差，或者只是表達了其中的一個肽段，這樣的蛋白根本不能在體外完 成磷酸化實驗。本發(fā)明人嘗試在MEK2 DD上連接HIS6標簽，以此標簽純化融合蛋白，但是實 驗發(fā)現(xiàn)，這樣表達出來的MEK2 DD激酶蛋白活性是不穩(wěn)定的，很容易失活，導致整個實驗重復(fù) 性很差，所得到結(jié)果數(shù)據(jù)不能令人信服。為了克服上述難題，本發(fā)明人嘗試使用GST標簽來 融合表達SIPK和MEK2 DD并通過標簽體外純化。因為大標簽往往能增加整個融合蛋白的水 溶性和穩(wěn)定性，有利于獲得有功能、并且活性穩(wěn)定的激酶蛋白。經(jīng)過大量的探索和研究，并 通過大量的重復(fù)驗證實驗，結(jié)果證明我們成功獲得了兩種穩(wěn)定性和活性都很好的功能性激 酶蛋白，并利用這兩種具有活性的蛋白完成了體外的磷酸化實驗，直接證明了 NopL而不是 NopL-S12xA能夠直接被SIPK磷酸化。同時，還通過Pull-down和雙分子熒光互補實驗，表 明了 SIPK與NopL在體內(nèi)和體外都存在相互作用的關(guān)系。
[0023] 另外，本發(fā)明還通過結(jié)瘤實驗發(fā)現(xiàn)，當NopL的磷酸化位點突變后，突變體 NopL-S12xA無法作為SIPK的底物，在結(jié)瘤實驗中表達NopL-S12xA蛋白的根瘤菌突變體相 比起野生型根瘤菌，誘導產(chǎn)生的根瘤中含有大量的壞死面積，也即大量根瘤細胞出現(xiàn)早衰。 說明NopL-S12xA突變體蛋白基本喪失了抑制根瘤細胞早衰的能力，從而無法促進共生，表 明NopL抑制根瘤細胞早衰的作用是磷酸化依賴的，NopL是通過作為MAPK的直接底物，被 MAPK磷酸化，進而發(fā)揮其抑制根瘤細胞早衰來促進共生的作用的。該發(fā)現(xiàn)為進一步研究豆 科植物與根瘤菌互作機制提供了新的理論與實踐基礎(chǔ)。
[0024] 本發(fā)明具有以下有益效果： 本發(fā)明提供了一種磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL的應(yīng)用，具體是指在促進根瘤菌與豆科 植物共生中的應(yīng)用。本發(fā)明以大腸桿菌這一原核細胞作為宿主，通過在體外表達純化NopL 及其突變體，以及真核細胞中的兩種蛋白激酶SIPK和MEK2DD的融合蛋白形式，通過標簽體 外純化，成功獲得兩種功能性的激酶蛋白，并利用這兩種具有活性的蛋白完成了體外的磷 酸化實驗，直接證明了 NopL而不是NopL-S12xA能夠直接被SIPK磷酸化，這是首次發(fā)現(xiàn)的 一個能夠直接作為促分裂原活化蛋白激酶底物的細菌蛋白。也是細菌蛋白NopL在真核細 胞中的作用新機制，即NopL直接作為真核細胞內(nèi)SIPK的底物，被MAPK磷酸化，從而在根瘤 菌與豆科植物互作的過程中抑制根瘤細胞早衰、促進共生固氮。
[0025] 結(jié)瘤實驗發(fā)現(xiàn)，當NopL的磷酸化位點突變后，突變體NopL-S12xA無法作為蛋白激 酶MAPK的底物，在結(jié)瘤實驗中表現(xiàn)為基本喪失了抑制根瘤細胞早衰的能力，即喪失了其原 本在與豆科植物共生過程中發(fā)揮的促進共生作用。說明了 NopL這種促進根瘤菌與寄主共 生的功能是磷酸化依賴的。該發(fā)現(xiàn)為進一步研究豆科植物與根瘤菌互作機制提供了新的理 論與實踐基礎(chǔ)，提供了新的研究方向，具備極高的理論與實踐價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為重組基因/70/7Z-S12xA的PCR擴增產(chǎn)物的電泳圖；1為DNA分子量標準品，2 為/7〇M_S12xA，大小為 1017 bp。
[0027] 圖2為重組蛋白NopL_S12xA的SDS-PAGE檢測圖；1為標準蛋白樣品，2為純化后 的重組蛋白NopL-S12xA，大小為37 kD。 圖3為重組蛋白NopL-S12xA的Western blot檢測圖；1為標準蛋白樣品，2為純化后 的 NopL-S12xA，大小為 37 kD。
[0028] 圖4為使用[γ _32P] ATP進行體外磷酸化實驗的結(jié)果。
[0029] 圖5為根瘤菌野生型NGR234、NGR 和突變型NGR Q/7〇M-/7〇M-S12xA與宿主 菜豆（cv. Tendergreen)共生互作后收獲的成熟根瘤的剖面圖。
[0030] 圖6為使用軟件Image J計算出分別由根瘤菌野生型NGR234、NGRQfloM和突 變型NGR Ω/70/7Z-/70/7Z-s 12xA誘導產(chǎn)生的根瘤剖面中壞死面積占整個侵染面積的百分數(shù)柱 形圖。柱子上的星號表示相比于野生型根瘤菌誘導產(chǎn)生的根瘤內(nèi)壞死面積百分數(shù)而言，由 兩個突變體根瘤菌誘導產(chǎn)生的根瘤中壞死百分數(shù)具有顯著地差異（Kruskal - Wallis計算 法，Ρ〈0· 00001)。
[0031] 圖7為NopL-S12xA的12個點突變位置示意圖；每一行末尾處標注的數(shù)字代表該 行最末一個氨基酸的編號，即是位于第幾個氨基酸，紅色字母頭頂標的數(shù)字也為該氨基酸 的編號；圖中紅色粗體標注的絲氨酸"S"為NopL-S12xA氨基酸序列中發(fā)生點突變的位置。
[0032] 圖 8 為 SIPK 與 NopL 的 Pull-down 實驗結(jié)果。
[0033] 圖9為SIPK與NopL雙分子熒光互補實驗結(jié)果。

【具體實施方式】
[0034] 以下結(jié)合說明書附圖和具體實施例來進一步說明本發(fā)明，但實施例并不對本發(fā)明 做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本【技術(shù)領(lǐng)域】常規(guī)試 齊[J、方法和設(shè)備。
[0035] 除非特別說明，以下實施例中所采用的試劑和材料均為市購。
[0036] 以下實施例中所采用的分子生物學實驗技術(shù)，包括PCR擴增、質(zhì)粒提取、質(zhì)粒轉(zhuǎn) 化、DNA片段連接、酶切、凝膠電泳等，如無特殊說明，通常按照常規(guī)方法操作，具體可參見 《分子克隆實驗指南》（第三版）（Sambrook J，Russell DW，Janssen K，Argentine J.黃培 堂等譯，2002,北京：科學出版社)，或按照試劑或儀器制造廠商所建議的條件。
[0037] 實施例1構(gòu)建重組質(zhì)粒pBS-/7〇/?Z_S12xA 1、本實施例利用人工合成DNA片段以及PCR進行定點突變的方法，構(gòu)建重組質(zhì)粒 pBS-/?〇M-S12xA。首先合成突變的重組基因/?〇M-S12xA，重組蛋白NopL-S12xA中包含12 個突變的磷酸化位點，均是由絲氨酸（Serine)突變成丙氨酸(Alanine)的點突變。這12 個突變位點分別是：S7A/S12A/S17A/S36A/S7 3A/S89A/S139A/S148A/S187A/S198A/S240A/ S245A。
[0038] 2、上述12個突變位點中，N端的5個點突變S7A/S12A/S17A/S36A/S89A是通過人 工合成核苷酸片段的方法突變完成的，人工合成的DNA片段序列（314 bp)如SEQ ID N0 :3 所示，其兩端含有酶切位點，可進行進一步的分子克隆。
[0039] 3、其余7個點突變均通過PCR完成 (1) PCR完成各點突變使用的引物序列如下： S73A-F :(如 SEQ ID N0 :4 所示） 5' -CATATCCTTATCCAGCACCTTGTGAATGG-3'， S73A-R :(如 SEQ ID N0 :5 所示） 5' -CCATTCACAAGGTGCTGGATAAGGATATG-3'。
[0040] S139A-F:(如 SEQ ID N0 :6 所示） TCGCAAGCCGGGCTAGCCCCGTCCGCCACCC, S139A-R:(如 SEQ ID N0 :7 所示） GGGTGGCGGACGGGGCTAGCCCGGCTTGCGA。
[0041] S148A-F:(如 SEQ ID N0 :8 所示） ACCCCACTGAACCCAGCCCCACCGCCGCATGC, S148A-R:(如 SEQ ID N0 :9 所示） GCATGCGGCGGTGGGGCTGGGTTCAGTGGGGT〇
[0042] S187A-F:(如 SEQ ID NO :10 所示） ACGCGGGCTACAGCTGCTCCCGCGCCACTGA, S187A-R:(如 SEQ ID NO :11 所示） TCAGTGGCGCGGGAGCAGCTGTAGCCCGCGT。
[0043] S198A-F:(如 SEQ ID NO :12 所示） GCTGAGAGGGGAAGGGCTCCCCAGCCTAGCG, S198A-R:^nSEQIDN0:13K*) CGCTAGGCTGGGGAGCCCTTCCCCTCTCAGC。
[0044] S240A/S245A-F:(如 SEQ ID NO :14 所示） CAGGTGGGACCAGCACACTCTGGACCGGCGCAAGCCCGG, S240A/S245A-R:^nSEQIDN0:15K*) CCGGGCTTGCGCCGGTCCAGAGTGTGCTGGTCCCACCTG。
[0045] (2)構(gòu)建重組載體 pBS-/?〇M5" 通過feoRV-AscI酶切位點將人工設(shè)計合成的314 bp的DNA片段連入載體pBS-/7〇/7Z (Zhang ei a人，2011)。人工設(shè)計合成的314 bp的DNA片段兩端含有feoRV-AscI酶切位 點，將其與用同樣的內(nèi)切酶酶切的載體pBS-/7〇/7Z進行連接，酶切條件為37°C酶 切3h。
[0046] 取1〇μ?連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5 α，并將轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于含有氨芐青 霉素（lOOKg/mL)的LB固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)12?16h。隨機挑取6株單菌落接種到 3mL含有氨芐青霉素（lOOPg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將菌液離心后提取質(zhì)粒做酶 切檢測，并交測序驗證。酶切和測序驗證均為陽性的重組質(zhì)粒即為重組載體PBS-/70/7Z#。
[0047] (3)點突變 PCR 以得到的重組載體PBS-/70/7ZW為PCR模板，逐個進行點突變(方法為依次使用一對引 物進行反應(yīng)，得到的成功突變的產(chǎn)物，將用于下一次點突變PCR的模板以進行下一個點突 變反應(yīng))，PCR的反應(yīng)體系（總體積5〇μυ如下所示： 模板（50 ng) ?μ? dNTP Mix (2. 5 mM) 4μ? 引物 F (10 μΜ) lμ? 引物 R (10 μΜ) Iμ? Fast Pfu (2· 5 U/μ? ?μ? 5 XFast Pfu reaction buffer 10M-L dd H20 32μ?。
[0048] 上述 PCR 反應(yīng)條件為：95°C 5min ;95°C 30s，55°C 90s，72°C 4 min，12 次循環(huán)； 72。。 10min。
[0049] 通過上述PCR，使用不同的引物重復(fù)此過程，最終獲得含有失活形式的重組蛋白 NopL_S12xA編碼序列的重組質(zhì)粒pBS-/?o/?Z-S12xA。
[0050] 實施例2構(gòu)建重組表達載體pPR0EX-/?〇M-S12xA 本實施例目的是將基因片段/?〇/^-S12xA克隆至pPROEX表達載體中。
[0051] 首先設(shè)計引物NopL-S12xA-F和NopL-S12xA-R，并在引物兩端引入紐el和 酶切位點(劃線部分)，以方便其插入PPR0EX載體。
[0052] 引物序列如下： NopL-S12xA-F :(如 SEQ ID N0 :16 所示） 5' -CGGGGCGCC ATGGATATCAATTCAACCGC-3' ； NopL-S12xA-R :(如 SEQ ID N0 :17 所示） 5, -GCGGATCC TCAAATGTCAAAATCCACCG-3，。
[0053] 以pBS-/7〇M-S12xA為模板，利用上述引物進行外源片段的PCR擴增反應(yīng)，反應(yīng)體 系（總體積5〇μυ如下所示： 模板（50 ng) ?μ? dNTP Mix (2. 5 mM) 4μ? 引物 F (10 μΜ) lμ? 引物 R(l〇PM) Iμ? PrimerStar DNA Polymerase (2. 5 U/M-L) 1M-L 5 XPrimerStar reaction buffer 10M-L dd H20 32μ?。
[0054] 上述 PCR 反應(yīng)條件為：94°C 5min ;95°C 30s，55°C 30s，72°C lmin，32 個循環(huán)； 72。。 lOmin。
[0055] PCR反應(yīng)結(jié)束后進行電泳檢測，如附圖1所示，目的產(chǎn)物是一條1017bp的片段。利 用TIANGEN的膠回收試劑盒回收1017 bp的PCR產(chǎn)物，提交測序，得到/7〇M-S12xA的基因 序列如SEQ ID NO: 1所示，其所編碼的氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。突變位點如附圖 7所示，圖中紅色粗體標注的絲氨酸"S"為NopL-S12xA氨基酸序列中發(fā)生點突變的位置； NopL-S12xA與NopL的區(qū)別在于以下紅色"S"部分都被點突變成了丙氨酸（A)。
[0056] 同時，PCR產(chǎn)物用內(nèi)切酶勱el和漢·ΗΙ于37°C雙酶切3 h，與同樣用勱el和fe?HI 雙酶切的PPR0EX表達載體連接，得到重組表達載體pPR0EX-/?〇M-S12xA。
[0057] 取1〇μ?連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α并將轉(zhuǎn)化后的菌懸液涂布于含有氨芐青霉 素（lOOPg/mL)的LB固體培養(yǎng)基表面，37°C培養(yǎng)12?16h后隨機挑取6株單菌落接種到3mL 含有氨芐青霉素（lOOKg/mL)的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜。將菌液離心后提取質(zhì)粒做雙酶 切檢測，并交測序驗證。
[0058] 取5μ?酶切和測序檢測都正確的重組表達質(zhì)粒pPR0EX-/?〇M-S12xA，轉(zhuǎn)化 表達型大腸桿菌BL21 (DE3)，同樣按照上述方法篩選出含有重組質(zhì)粒的宿主菌BL21 (DE3-/?〇M-S12xA)。
[0059] 實施例3重組蛋白NopL_S12xA的誘導表達及純化 1、重組蛋白NopL-S12xA的誘導表達 將重組后的工程菌BL21 (DE3-/7〇M-S12xA)劃線到含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB固 體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)12?16h。
[0060] 隨機挑出一個單菌落接種到3mL含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB液體培養(yǎng)基中， 37°C、220rpm 震蕩培養(yǎng) 12h。
[0061] 培養(yǎng)好的菌液按1:100的比例接種到300mL含有氨芐青霉素（5(^g/mL)的LB液體 培養(yǎng)基中，37°C震蕩培養(yǎng)至0D 6QQ= 0.6 (大約3h)時，加入IPTG至終濃度為ImM，繼續(xù)37°C、 220rpm條件下震蕩培養(yǎng)20h。
[0062] 2、重組蛋白NopL_S12xA的純化回收 上述經(jīng)過IPTG誘導后的菌液于5500g條件下離心5min，棄去上清液，將收集的菌體重 懸于預(yù)冷的10mL的裂解緩沖液（50mM磷酸二氫鉀，1M氯化鈉，10mM咪唑）中。用超聲波破 碎儀（MIS0NIX)破碎細胞后，15000g離心20min，收集的上清液即為含重組蛋白的粗制液。 此粗提物再用Ni-NTA樹脂凝膠柱（Qiagen)純化，具體步驟可以參見產(chǎn)品說明書。
[0063] 3、重組蛋白 NopL-S12xA 的 SDS-PAGE 分析 獲得純化后的重組蛋白NopL-S12xA用SDS-PAGE (12%)電泳分析，如附圖2所示，表明 此重組蛋白可以在大腸桿菌體內(nèi)大量表達并能夠用親和層析進行純化。
[0064] 實施例4重組蛋白NopL_S12xA的Western blot檢測 本實施例對純化的重組蛋白NopL-S12xA進行Western blot檢測分析，方法參照常規(guī) 的 Western blot 操作。
[0065] 將上述純化的重組蛋白NopL-S12xA樣品使用12% SDS-PAGE進行電泳分離，隨后 電轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜（NC膜）上。使用封閉液封閉NC膜60min。
[0066] 所用一抗是由大腸桿菌BL21 (DE3)表達純化的NopL蛋白免疫兔子后，取兔子血 清分離而來。二抗為羊抗兔抗體。
[0067] 一抗用封閉液(含5%質(zhì)量比脫脂奶粉的TBST緩沖液）進行稀釋后，與NC膜溫育 lh，使用TBST緩沖液（50mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽，pH7. 5、150mM的氯化鈉，和0. 05% 的吐溫-20)洗去一抗。再加入封閉液稀釋的二抗，溫育lh，再用TBST洗去二抗。最后使用 3, 3' -diamino-benzidine (DAB)進行顯色，結(jié)果如附圖3所示，與SDS-PAGE結(jié)果一致，成 功構(gòu)建了能夠表達重組蛋白NopL-S12xA的重組工程菌BL21 (DE3-/?〇M-S12xA)，并能夠用 親和層析進行純化。
[0068] 實施例5 NopL體外磷酸化實驗 本實施例通過體外磷酸化實驗證明蛋白NopL是有絲分裂原活化蛋白激酶的直接底 物。
[0069] 1、材料 (1)反應(yīng)所需的兩個激酶為His6-SIPK和NtMEK2DD-His6 (可作為SIPK的上一級激酶用 以激活SIPK)。
[0070] His6_SIPK即水楊酸誘導的蛋白激酶，來源于煙草的有絲分裂原活化的蛋白激酶。 NtMEK2 DD-His6可作為SIPK的上一級激酶用以激活SIPK，煙草中的MAPKK。
[0071] 所述兩個激酶是以大腸桿菌這一原核細胞作為宿主,表達真核細胞中的兩種蛋白 激酶SIPK和MEK2 DD的融合蛋白形式，并通過標簽體外純化獲得的。
[0072] (2)反應(yīng)所需的底物蛋白為：NopL蛋白和突變體NopL-S12xA蛋白，是在大腸桿菌 中表達純化獲得。
[0073] (3)從大腸桿菌里表達純化重組蛋白（上述激酶和底物蛋白）的具體方法如下： S1.首先將含有目的基因的重組表達載體(常常是含有GST或His6等標簽的表達載體） 轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21菌株中，細菌細胞在Luria-Bertani (LB)培養(yǎng)基（10g/L酵母提取粉， 5g/L氯化鈉，10g/L胰蛋白胨）中37°C過夜培養(yǎng)。
[0074] S2.隨后轉(zhuǎn)移入100倍體積的LB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)，并當0D_達到0. 6時，于其 中加入異丙基-β -D-硫代半乳糖苷（IPTG)在25°C中過夜培養(yǎng)。
[0075] S3.將大腸桿菌細胞離心收集后重懸于預(yù)冷的裂解緩沖液（50mM磷酸二氫鈉， 300mM氯化鈉，10mM咪唑，并用氫氧化鈉調(diào)pH值8. 0 ),使用裂解酶裂解40分鐘后，再使用超 聲破碎此重懸物，并離心收集上清液體。
[0076] S4.使用鎳-次氮基三乙酸親和色譜法（QIAgenes凡Handbook ;Qiagen, Hilden,Germany),通過力口入 GST-binding resin (glutathione agarose beads ；Novagen, USA)或是Ni-NTA magnetic agarose beads來進行標簽蛋白的純化。
[0077] S5.使用 Amicon Microcon concentratorCThe Amicon Ultra-〇. 5 centrifugal concentrator，YM-10, Millipore，Bedford，MA，USA)對純化后的洗脫液進行濃縮。
[0078] S6.隨后若是進行磷酸化實驗，使用磷酸化反應(yīng)緩沖液（20mM羥乙基哌嗪乙硫磺 酸-氫氧化鉀，pH 7. 6, ImM二硫蘇糖醇，10mM氯化鎂）洗滌蛋白兩次； 若是進行pull-down分析，使用磷酸鹽緩沖液（PBS)(137mM氯化鈉，2. 7mM氯化鉀，10mM 磷酸氫二鈉，使用NaOH調(diào)節(jié)pH至7. 4)將蛋白洗滌兩次。
[0079] 純化GST標簽蛋白與純化His標簽蛋白方法相冋，區(qū)別僅在于純化GST標簽蛋白 時使用的裂解緩沖液是PBS緩沖液，洗脫緩沖液是：50mM三異丙基乙磺酰(鹽酸調(diào)節(jié)其pH 至8.0)，10mM還原性谷胱甘肽。
[0080] 2、將兩個激酶His6-SIPK和NtMEK2DD-His 6與底物NopL蛋白或突變體NopL-S12xA 分別依次加入磷酸化緩沖液(配方為20mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸-氫氧化鉀；pH 7. 6, ImM二 硫蘇糖醇；10mM氯化鎂；50mM三磷酸腺苷；50MCi/mL [γ-32Ρ]三磷酸腺苷)中，在30°C中反 應(yīng) 30min。
[0081] 將磷酸化反應(yīng)后的產(chǎn)物進行SDS-PAGE電泳分離，分離后的蛋白膠經(jīng)過磷屏曝光 后，使用臺風掃描儀（Typhoon 9410 variable Mode Imager, GE Amersham Biosciences, Piscataway, NJ)掃描磷屏上的信號進行放射自顯影。
[0082] 3、結(jié)果發(fā)現(xiàn)NopL樣品組在NopL (37 kD)對應(yīng)位置(如附圖4所示）出現(xiàn)條帶，而 NopL-S12xA對照組則無(如附圖4所示)。
[0083] 結(jié)果說明了野生型NopL蛋白可以被真核細胞中的有絲分裂原活化的蛋白激酶 所磷酸化并作為其直接底物，然而失去了 12個磷酸化位點的突變體NopL-S12xA不能被 磷酸化，證明了 NopL可以直接作為真核細胞中有絲分裂原活化的蛋白激酶的底物，而 NopL_S12xA 則不能。
[0084] 實施例6 Pull-down實驗研究NopL與SIPK的相互作用 1、方法 51. 將 100 μ g 的 GST-NopL(或 GST-NopL-S12xA)、43 μ g 的 GST 和 141 μ g 的 His6-SIPK 溶于100 μ L PBS緩沖液中，4°C孵育2h ; 52. 加入800 μ L PBS緩沖液和100 μ L谷胱甘肽瓊脂糖珠子，將整個混合物的體積擴 充至lmL，繼續(xù)4°C孵育lh ; 53. 通過100 xgX 10 s的離心條件收集珠子，并用10倍的PBS緩沖液（137 mM氯化 鈉，2. 7 mM氯化鉀，10 mM磷酸氫二鉀，使用NaOH將pH值調(diào)至7. 4)洗滌珠子； 54. 在洗滌后的珠子(約剩余30 yL的緩沖液)中加入7yL的5XSDS(Sodium dodecyl sulfate，十二烷基硫酸鈉）上樣緩沖液[250mM三羥甲基氨基甲烷鹽酸鹽（pH 6.8),10% (w/v) SDS，50% (v/v)甘油，0.5% (w/v)溴酚藍，5% (v/v) 2-巰基乙醇]，95°C加熱樣品 5 min ； 55. 使用抗 His6 的抗體（Roche，Basel，Switzerland ; 1 :2000 稀釋比）通過 Western 雜 交分析蛋白樣品(按照本領(lǐng)域常規(guī)的Western操作方法進行)。
[0085] 2、實驗結(jié)果如附圖8所示，通過Pull-down實驗的分析，驗證了 SIPK和NopL在體 外能相互作用，而NopL-S12xA不能與SIPK相互作用。
[0086] 實施例7雙分子熒光互補實驗研究NopL與SIPK的體內(nèi)相互作用 1、由于SIPK是煙草葉片中的一種MAPK，而且煙草葉片中天然存在的激酶遠遠不止 SIPK -種，所以根本無法設(shè)計體內(nèi)實驗來證明NopL在煙草葉片細胞中被磷酸化（Bartsev ei a人，2004; Zhang ei a人，2010)是單純因為被SIPK磷酸化引起的。為了克服單純體 外磷酸化實驗不足以說明在體內(nèi)NopL -定是被SIPK所磷酸化的缺陷，本發(fā)明人還設(shè)計了 雙分子突光互補實驗（Bimolecular fluorescent complementation，BiFC)來分析 NopL 與 SIPK體內(nèi)的相互作用，表明了 SIPK與NopL在體內(nèi)和體外都存在相互作用的關(guān)系。
[0087] 2、雙分子熒光互補實驗的方法如下： S1.構(gòu)建重組質(zhì)粒 pSATl-nEYFP-Nl-/7〇/7Z、pSATl-nEYFP-Nl-/7〇/7Z-S12xA 和 pSATl-cEYFP-NlH 其中，pSATl-nEYFP-Nl 和 pSATl-cEYFP-Nl (Citovsky ei a7·，2006)分別編碼N端 和C端部分的增強型黃色突光蛋白（Enhanced yellow fluorescence protein，EYFP);重 組質(zhì)?？寺》椒椋?511. 對于pSATl-nEYFP-Nl-/?〇M，使用 SEQ ID N0:19和引物 SEQ ID N0:20所示的序列 為引物，以pBS-/?〇M為模板，PCR擴增出基因片段后，使用內(nèi)切酶班/?(111與&ΜΠ 進行 雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體口341'1-業(yè)￥---附((：^〇^1^￡^ <^.，2006)， 并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒pSATl-nEYFP-Nl-/? 〇/7Z ; 512. 對于 pSATl-nEYFP-Nl-/7〇M_S12xA，使用 SEQ ID NO :20 和引物 SEQ ID NO : 21所示的序列為引物，以pBS-/?〇M-S12xA為模板，PCR擴增出/?〇M-S12xA基因片段 后，使用內(nèi)切酶與進行雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體 pSATl-nEYFP-Nl(Citovsky eia乂，2006)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并 獲得重組質(zhì)粒 pSATl-nEYFP-Nl-/?o/7Z-S12xA ; 513. 對于 pSATl-cEYFP-Nl-STiT，使用 SEQ ID NO :22 和引物 SEQ ID NO :23 所示的序 列為引物，以PET-分/況（Zhang e i a乂，2011)為模板，PCR擴增出分/況基因片段后，使用 內(nèi)切酶及_7 J與feoRI進行雙酶切，連接到使用相同內(nèi)切酶雙酶切的載體pSATl-cEYFP-Nl (Citovsky ei al，2006)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，篩選出成功連接的轉(zhuǎn)化子并獲得重組質(zhì)粒 pSATl-cEYFP-NlH
[0088] S2. BiFC操作方法，包括質(zhì)粒的準備，洋蔥細胞的培養(yǎng)，基因槍轟擊的方法，轟擊后 顯微鏡的觀察等細節(jié)參見Hollender和Liu (2010)。
[0089] 3、實驗結(jié)果如附圖 9 所不，DAPI (4，，6 - diamidino - 2 - phenylindole)為細胞 核染料；YF (yellow fluorescence)為黃色突光；BF (bright field)為明場；Merge 為前三 種場景的疊加。其中，（a)中的箭頭指出了對應(yīng)細胞中細胞核的位置，也即兩種蛋白在細胞 中互作的地點。標尺（a)為50 ym;(b)、（c)和（d)均為300 μπι。
[0090] 結(jié)果顯示，只有（a)組（即SIPK和NopL相互作用組）特異地在細胞核部位出現(xiàn)熒 光信號，表明了 SIPK和NopL能在植物細胞內(nèi)相互作用。
[0091] 實施例8根瘤細胞壞死面積檢測 1、本實施例使用野生型根瘤菌NGR234、NGR Ω/70/7Ζ (NGR234的/70/7Z突變體）和 NGRQ/?〇/7Z-/?〇/7Z-S12xA (表達重組蛋白NopL_S12xA的NGR234突變體）與宿主菜豆（cv. Tendergreen)進行結(jié)瘤實驗，來研究NopL蛋白是否能夠抑制根瘤細胞早衰及其具體機制。
[0092] 所述的野生型根瘤菌NGR234為本實驗室保存。
[0093] 突變型根瘤菌NGRQ/?〇M即NGR234的突變體，參考Zhang ei a人，2010。
[0094] 突變型根瘤菌NGRQ/7〇M-/7〇M-S12xA即表達重組蛋白NopL-S12xA的NGR234突 變體，突變體NGRQ/7〇/7Z-/7〇/7Z-S12xA的構(gòu)建方法如下： 51. 構(gòu)建pBS-p/?〇M-/?〇M-S12xA :以 pBS-/7〇M_S12xA 為模板，以 SEQ ID N0 :15 和 SEQ ID N0 :18所示序列為引物擴增/7〇M-S12xA基因片段； 52. 將/?〇M-S12xA 基因片段克隆入 pBS-p/?〇M (Zhang et al·，2011)，獲得重組質(zhì) 粒 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA ;得到的 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA 是 pBluescript 的一個衍生物， 它含有NopL的258-bp的啟動子序列（Zhang ei a人，2011)和NopL_S12xA的編碼序列； 53. 通過限制性內(nèi)切酶從 pHP45W(Prentki and Krisch, 1984)中切下 QSpe 基 因片段，連入 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA 中的 位點，得到 pBS-p/?o/7Z-/?o/7Z-S12xA-Q ; 54. 使用油al內(nèi)切酶從pBS-p/?〇M-/?〇M-S12xA-Q中將含有NopL啟動子、NopL-S12xA 編碼區(qū)域和QSpe序列的整個大片段切下，連入自殺載體pJQ-j^?V(Liang MT，2012)的油<31 酶切位點中，得到 pJQ-j^z/V-p/7〇Mi〇M_S12xA-Q ; 55. 最后通過三親本雜交（Figurski and Helinski，1979)，將得到的 Ρ^__7^?/ν-ρ/?〇Μ_β〇Μ_δ12χΑ-Ω 質(zhì)粒轉(zhuǎn)入突變株 NGR Ω/7〇/7Ζ (Zhang et al.，2011)，使其 發(fā)生重組雙交換進行突變； 56. 由S5得到的克隆通過提取其基因組，進行PCR驗證，以及Western雜交等檢測手段 確認為成功的根瘤菌突變體NGR Ω -/7〇/?Z-S12xA。
[0095] 2、結(jié)瘤實驗具體操作如下： 51. 將菜豆（cv. Tendergreen)的種子使用濃硫酸浸泡10 min進行表面消毒后，使用 已滅菌的雙蒸水洗去表面殘留的硫酸，并將種子在雙蒸水中浸泡過夜； 52. 將種子轉(zhuǎn)移入瓊脂糖平皿中，并在暗處萌發(fā)（24±2°C); 53. 種子萌發(fā)后，將它們轉(zhuǎn)移入無色透明的塑料罐子中繼續(xù)培養(yǎng)（24±2°C，16/8h的光 暗周期)，罐子里放置有以3 :1的體積比混合的蛭石和陶粒；該塑料罐子下方還有一個用棉 繩連在一起的另一個同樣的罐子，里面放置不含氮源的B&D營養(yǎng)液； 所述不含氮源的B&D營養(yǎng)液配方為ImM氯化鈣，0.5mM磷酸二氫鉀，1〇μΜ檸檬酸鐵， 0. 25mM硫酸鎂，0. 25mM硫酸鉀，?μΜ硫酸錳，2μΜ硼酸，0. 5μΜ硫酸鋅，0. 2μΜ硫酸銅，0. ?μΜ 硫酸鈷，〇. ιμΜ鑰酸鈉； 54. 5d后，分別用ΤΥ液體培養(yǎng)基接種根瘤菌野生型NGR234、突變型NGR Ω/70/7Ζ和 待根瘤菌生長飽和后離心收集菌體，并使用10 mM硫酸鎂重懸菌 體至0D6(?值為0. 2,得到三種重懸液； 所述TY液體培養(yǎng)基的配方為5g/L蛋白胨，3g/L酵母提取粉，0. 4g/L氯化鈣； 55. 分別取上述三種重懸液2mL接種到每一盆菜豆植物根上，每一種根瘤菌重懸液接 種10盆植物；菜豆植物在16/8 h的光暗周期下，24 ±2°C的環(huán)境中，培育45d，收獲成熟根 瘤。
[0096] 3、實驗結(jié)果 (1)成熟根瘤的剖面圖如附圖5所示，黑褐色部分表示壞死部分。同時，使用Image J 計算根瘤截面中壞死面積占總整個侵染面積的百分數(shù)，如附圖6所示，柱子上的星號表示 相比由野生型根瘤菌誘導產(chǎn)生的根瘤內(nèi)壞死面積百分數(shù)而言，由兩個突變體根瘤菌誘導產(chǎn) 生的根瘤中壞死百分數(shù)具有顯著地差異（Kruskal - Wallis計算法，P〈0. 00001)。
[0097] (2)結(jié)果顯示，相比于野生型根瘤菌NGR234誘導產(chǎn)生的根瘤來說，表達 /?〇M-S12xA的突變型根瘤菌NGRQfloM-floM-SUxA誘導產(chǎn)生的根瘤中出現(xiàn)顯著數(shù)量的壞 死面積(如附圖5和附圖6所示)，說明其在與該豆科植物共生過程中極大喪失了抑制根瘤 細胞早衰的能力，這也就說明了 NopL的磷酸化位點對于其在共生過程中正常行使功能是 不可或缺的。
[0098] 綜上所述，本發(fā)明闡述了細菌蛋白質(zhì)NopL在真核細胞中作用的新機制。細菌蛋 白NopL直接作為真核細胞內(nèi)促有絲分裂原活化的蛋白激酶MAPK底物而促進共生固氮。當 NopL的磷酸化位點突變后，突變體NopL-S12xA無法作為蛋白激酶MAPK的底物，在結(jié)瘤實驗 中表現(xiàn)為基本喪失了抑制根瘤細胞早衰的能力，從而無法促進共生固氮。該發(fā)現(xiàn)為進一步 研究豆科植物與根瘤菌互作機制提供了新的研究思路，以及新的理論與實踐基礎(chǔ)。
[0099] 以上實施例僅為介紹本發(fā)明的優(yōu)選案例，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，在不背離本 發(fā)明精神的范圍內(nèi)所進行的任何顯而易見的變化和改進，都應(yīng)被視為本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1. 磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL在促進根瘤菌與植物共生中的應(yīng)用。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述促進根瘤菌與植物共生是指抑制根瘤 細胞的早衰。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于，所述磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL是指被水楊 酸誘導的蛋白激酶所磷酸化的細菌蛋白質(zhì)NopL。
4. 水楊酸誘導的蛋白激酶的激活劑在制備根瘤細胞早衰抑制劑的應(yīng)用。
5. 水楊酸誘導的蛋白激酶的激活劑在構(gòu)建抗根瘤細胞早衰的轉(zhuǎn)基因豆科植物的應(yīng) 用。
6. -種編碼失活形式NopL重組蛋白的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示。
7. -種失活形式NopL重組蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :2所示。
【文檔編號】C12R1/41GK104151405SQ201410402161
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】史德海林·奧斯丁·巴特瑟, 謝致平, 葛盈盈, 相其旺 申請人:中山大學