一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞組織培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明所提供的方法是將鹿骨膜組織切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，過(guò)濾后獲得條件培養(yǎng)液；所述插入皿由上室和下室組成，培養(yǎng)時(shí)插入皿放入多孔培養(yǎng)板中。本發(fā)明所提供的方法能夠使鹿骨膜組織在離體培養(yǎng)條件下分泌活性物質(zhì)，進(jìn)而收集、分析所分泌的活性物質(zhì)，解決了離體培養(yǎng)不能為組織提供立體的培養(yǎng)環(huán)境、培養(yǎng)過(guò)程中二氧化碳濃度很難控制以及不能隨時(shí)收集條件培養(yǎng)液的難題，同時(shí)本發(fā)明的方法還有效提高培養(yǎng)組織的成活率，并縮短了組織的培養(yǎng)時(shí)間，且能夠隨時(shí)收集條件培養(yǎng)液。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法及應(yīng)用，屬于細(xì)胞組織培養(yǎng)技術(shù)領(lǐng) 域。
【背景技術(shù)】
[0002] 鹿茸是目前所知的唯一能夠完全再生的復(fù)雜哺乳動(dòng)物器官，其再生包括軟骨、骨、 皮膚、血管和神經(jīng)的再生。其中對(duì)神經(jīng)再生的研究發(fā)現(xiàn)：鹿茸神經(jīng)的再生和快速生長(zhǎng)主要由 角柄骨膜來(lái)源的生物分子的刺激實(shí)現(xiàn)的。而要想分析這些角柄骨膜來(lái)源的生物分子，必須 建立一個(gè)離體的培養(yǎng)體系。
[0003] 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中，細(xì)胞可能會(huì)分泌活性物質(zhì)到培養(yǎng)液中，這種培養(yǎng)過(guò)某種細(xì)胞 或組織以后，含有細(xì)胞或組織分泌物的培養(yǎng)液就叫做條件培養(yǎng)液。目前對(duì)細(xì)胞條件培養(yǎng)液 的研究較多。由于組織培養(yǎng)的復(fù)雜性，對(duì)組織條件培養(yǎng)液的制備體系很少，尤其是骨膜組織 條件培養(yǎng)液的制備技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)導(dǎo)。
[0004] 但細(xì)胞條件培養(yǎng)液只能反映離體條件下，單個(gè)細(xì)胞分泌活性物質(zhì)的情況，而活體 條件下，細(xì)胞的任何活動(dòng)都離不開(kāi)細(xì)胞間質(zhì)，所以單純的細(xì)胞條件培養(yǎng)液并不能反映組織 中細(xì)胞與其間質(zhì)相互作用的情況下，分泌活性物質(zhì)的情況?，F(xiàn)有技術(shù)中組織條件培養(yǎng)液的 制備方法多是利用三角瓶，再向三角瓶中充滿(mǎn)二氧化碳?xì)怏w進(jìn)行密封培養(yǎng)。這種培養(yǎng)不能 為組織提供立體的培養(yǎng)環(huán)境，而且培養(yǎng)過(guò)程中二氧化碳濃度很難控制，培養(yǎng)過(guò)程中不能隨 時(shí)收集條件培養(yǎng)液。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005] 為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明提供了一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法，所采取的技 術(shù)方案如下：
[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法，該方法是將鹿骨膜組 織切片后置于插入皿中，向插入皿中加入培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，過(guò)濾后獲得條件 培養(yǎng)液；
[0007] 所述插入皿底部由孔徑為0. 4μπι的滌綸樹(shù)脂材料制成，培養(yǎng)時(shí)插入皿放入多孔 培養(yǎng)板中，這樣就將培養(yǎng)空間分成了上室和下室，且上室和下室之間有培養(yǎng)液的溝通
[0008] 所述制備方法的步驟如下：
[0009] 1)利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿骨膜組織切割成薄片，獲得骨膜組織切 片；
[0010] 2)將步驟1)所得的骨膜組織切片放入包被好的插入皿中，再將插入皿放到多孔 培養(yǎng)板的孔中；
[0011] 3)向插入皿和培養(yǎng)板中加入液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0012] 4)用濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得條件培養(yǎng)液。
[0013] 步驟1)所述骨膜組織切片，長(zhǎng)2-6mm，寬1. 5-2mm，厚0. 2-1. 7mm。
[0014] 步驟2)所述骨膜組織放入包被好的插入皿，是將10-100片骨膜組織切片放入到 用鼠尾膠原或I型膠原包被的插入皿中；所述插入皿將培養(yǎng)空間分為上室和下室，上室和 下室通過(guò)0. 4 μ m孔徑的滌綸樹(shù)脂膜聯(lián)通；所述多孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)孔的數(shù)量可以為24,12,或 6個(gè)。
[0015] 步驟3)所述液體培養(yǎng)液為神經(jīng)培養(yǎng)液，具體組成為：neurobasal medium(Gibco) 加入 2% B27supplement(Life Technologies)再加入 1%抗生素（Gibco)。
[0016] 步驟3)所述培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，C02濃度為5%，濕度為飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為 2 _4d。
[0017] 步驟4)所述濾膜過(guò)濾，是利用0.22 μ m的濾膜進(jìn)行過(guò)濾。
[0018] 所述方法的具體步驟如下：
[0019] 1)利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿骨膜組織切割成長(zhǎng)2-6mm，寬1. 5-2mm，厚 0. 2-1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0020] 2)將10-100片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原包被的插入皿中，再 將插入皿放到多孔培養(yǎng)板的孔中；
[0021] 3)向插入皿和培養(yǎng)板中加入神經(jīng)培養(yǎng)液，于37°C，C02濃度為5%，濕度為飽和濕 度的條件下培養(yǎng)2-4d，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0022] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng)液。
[0023] 所述方法用于制備鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng)液。
[0024] 本發(fā)明所取得的有益效果如下：
[0025] 1)本發(fā)明所提供的方法能夠使鹿骨膜組織在離體培養(yǎng)條件下分泌活性物質(zhì)，進(jìn)而 收集、分析所分泌的活性物質(zhì)，解決了活體條件下很難分離、分析某些組織所分泌的含量極 少的，分子很小的而又起到很關(guān)鍵作用的活性物質(zhì)的難題。
[0026] 2)本發(fā)明所提供的方法能夠有效提高培養(yǎng)組織的成活率，并縮短組織的培養(yǎng)時(shí) 間。
[0027] 3)本發(fā)明所提供的方法可以實(shí)現(xiàn)隨時(shí)收集條件培養(yǎng)液和更換新鮮培養(yǎng)液，操作十 分方便。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0028] 圖1為本發(fā)明所用動(dòng)物組織切割器；
[0029] (A為切割臺(tái)；B.為切割器，由20個(gè)左右的刀片平行放置，每?jī)蓚€(gè)刀片中間用 0· 7mm厚的隔板間隔開(kāi)；C為裝卸板手）。
[0030] 圖2為本發(fā)明所用插入皿和多孔細(xì)胞培養(yǎng)板；
[0031] (a，為與24孔細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合使用的插入皿，其底部為孔徑0. 4um的滌綸樹(shù)脂膜。 使插入皿和細(xì)胞培養(yǎng)板間有液體的聯(lián)通；b，為與6孔細(xì)胞培養(yǎng)板結(jié)合使用的插入皿，其底 部為孔徑0. 4um的滌綸樹(shù)脂膜，插入皿和細(xì)胞培養(yǎng)板間有液體的聯(lián)通）。
[0032] 圖3為實(shí)施例1-4條件培養(yǎng)液促使SK-N-SH細(xì)胞向神經(jīng)元分化的結(jié)果；
[0033] (a，實(shí)施例1 ;b，實(shí)施例2 ;c，實(shí)施例3 ;d，實(shí)施例4)。
[0034] 圖4為實(shí)施例1-4條件培養(yǎng)液促進(jìn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突向外生長(zhǎng)的結(jié)果；
[0035] (a，實(shí)施例1 ;b，實(shí)施例2 ;c，實(shí)施例3 ;d，實(shí)施例4)。
[0036] 圖5為實(shí)施例1-4條件培養(yǎng)液促進(jìn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的結(jié)果；
[0037] (a，實(shí)施例1 ;b，實(shí)施例2 ;c，實(shí)施例3 ;d，實(shí)施例4)。
【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步說(shuō)明，但本發(fā)明不受實(shí)施例的限制。
[0039] 實(shí)施例1
[0040] 本發(fā)明提供了一種利用三角瓶培養(yǎng)鹿角柄骨膜組織制備條件培養(yǎng)液的方法，步驟 如下：
[0041] 1)利用動(dòng)物組織切割器（圖1)將活體采集的鹿骨膜組織切割成長(zhǎng)6_，寬2_，厚 1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0042] 2)將20片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入三角瓶中。
[0043] 3)向三角瓶中加入神經(jīng)培養(yǎng)液，充入飽和濃度的C02濃度，塞緊三角瓶，放到培養(yǎng) 箱中培養(yǎng)4d，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0044] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng)液。
[0045] 實(shí)施例2
[0046] 本發(fā)明提供了一種鹿生茸區(qū)骨膜組織條件培養(yǎng)液的制備方法，步驟如下：
[0047] 1)利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿生茸區(qū)骨膜組織切割成長(zhǎng)3mm，寬2mm，厚 0. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0048] 2)將15片步驟1)所得的骨膜組織切片均勻地放入用鼠尾膠原包被好的插入皿 中，再將插入皿放到24孔培養(yǎng)板（圖2a)的孔中；
[0049] 3)向插入皿和24孔培養(yǎng)板中，即培養(yǎng)的上室和下室中分別加入神經(jīng)培養(yǎng)液，于 37°C、C0 2濃度5%，飽和濕度的條件下培養(yǎng)3d，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0050] 4)利用0.22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng) 液。-80°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0051] 實(shí)施例3
[0052] 本發(fā)明提供了一種鹿角柄骨膜組織條件培養(yǎng)液的制備方法，步驟如下：
[0053] 1)利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿角柄骨膜組織切割成長(zhǎng)3mm，寬2mm，厚 0. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0054] 2)將50片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原包被好的插入皿中，再將 插入皿放到6孔培養(yǎng)板的孔中；
[0055] 3)向插入皿和6孔培養(yǎng)板（圖2b)中加入神經(jīng)培養(yǎng)液，于37°C、C02濃度5%，飽 和濕度的條件下培養(yǎng)3d，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0056] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng)液。
[0057] 實(shí)施例4
[0058] 本發(fā)明提供了一種鹿生茸區(qū)骨膜組織條件培養(yǎng)液的制備方法，步驟如下：
[0059] 1)利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿生茸區(qū)骨膜組織切割成長(zhǎng)3_，寬2_，厚 〇. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0060] 2)將60片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用I型膠原包被好的插入皿中，再將 插入皿放到6孔培養(yǎng)板的孔中；
[0061] 3)向插入皿和6孔培養(yǎng)板中加入神經(jīng)培養(yǎng)液，于37°C、C02濃度5%，飽和濕度的 條件下培養(yǎng)3d，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液；
[0062] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養(yǎng)液。
[0063] 實(shí)施例5
[0064] 本實(shí)施例對(duì)實(shí)施例1-4所制備的條件培養(yǎng)液進(jìn)行活性檢測(cè)：
[0065] 以下實(shí)驗(yàn)為利用本發(fā)明的實(shí)施例1-4所獲得的條件培養(yǎng)液分別培養(yǎng)SK-N-SH細(xì) 胞、大鼠15日齡胚胎背根神經(jīng)節(jié)以及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元，結(jié)果如圖3-5所示。其中圖3為實(shí) 施例1-4條件培養(yǎng)液促使SK-N-SH細(xì)胞向神經(jīng)元分化的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖4為實(shí)施例1-4條件 培養(yǎng)液促進(jìn)大鼠背根神經(jīng)節(jié)軸突向外生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果；圖5為實(shí)施例1-4條件培養(yǎng)液促進(jìn) 大鼠背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。從以上圖中可以看出，利用本發(fā)明制備的 角柄骨膜組織條件培養(yǎng)液中含有角柄骨膜組織分泌的生物活性分子，能夠促進(jìn)神經(jīng)生長(zhǎng)。 表1為實(shí)施例1-4所制備條件培養(yǎng)液的效果。
[0066] 表1實(shí)施例1-4所制備條件培養(yǎng)液的效果
[0067]
【權(quán)利要求】
1. 一種鹿骨膜條件培養(yǎng)液的制備方法，其特征在于，將鹿骨膜組織切片后置于插入皿 中，向插入皿中加入培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)后收集培養(yǎng)液，過(guò)濾后獲得條件培養(yǎng)液； 所述插入皿底部由0. 4 μ m孔徑的滌綸樹(shù)脂制成，培養(yǎng)時(shí)放入多孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，將培 養(yǎng)空間分為上室和下室，上室和下室之間有培養(yǎng)液聯(lián)通。
2. 權(quán)利要求1所述制備方法，其特征在于，步驟如下： 1) 利用動(dòng)物組織切割器將活體采集的鹿骨膜組織切割成薄片，獲得骨膜組織切片； 2) 將步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原或I型膠原包被的插入皿中，再將 插入皿放到多孔培養(yǎng)板的孔中； 3) 向插入皿和培養(yǎng)板中加入液體培養(yǎng)液培養(yǎng)，培養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液； 4) 用濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得條件培養(yǎng)液。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟1)所述骨膜組織切片，長(zhǎng)2-6mm，寬 1. 5_2mm,厚 0· 2-1. 7mm 〇
4. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟2)所述骨膜組織切片放入插入皿，是將 10-100片骨膜組織切片放入到用鼠尾膠原或型膠原包好的插入皿中；所述插入皿底部由 孔徑為0. 4 μ m的滌綸樹(shù)脂制成，放入培養(yǎng)板后，將培養(yǎng)空間分為上室和下室，且上室和下 室之間有培養(yǎng)液聯(lián)通；所述多孔培養(yǎng)板，培養(yǎng)孔的數(shù)量為24,12,或6個(gè)。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述液體培養(yǎng)液為神經(jīng)培養(yǎng)液，具體組成 為：neurobasal medium 加入 2% 的 B27 supplement 再加 1% 的抗生素。
6. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟3)所述培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為37°C，C02濃度為 5%，飽和濕度，培養(yǎng)時(shí)間為2-4d。
7. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，步驟4)所述濾膜過(guò)濾，是利用0. 22 μ m的濾膜進(jìn) 行過(guò)濾。
8. 權(quán)利要求2所述方法，其特征在于，具體步驟如下： 1) 利用動(dòng)物組織切割器將活體采取的鹿骨膜組織切割成長(zhǎng)2-6mm，寬1. 5-2mm，厚 0. 2-1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片； 2) 將10-100片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入包被好的插入皿中，再將插入皿放到 多孔培養(yǎng)板的孔中； 3) 向插入皿中加入神經(jīng)培養(yǎng)液，于37°C、5% C02濃度，飽和濕度的條件下培養(yǎng)2-4d，培 養(yǎng)完成后收集培養(yǎng)液； 4) 利用0. 22 μ m的濾膜過(guò)濾步驟3)所得培養(yǎng)液，獲得鹿骨膜組織條件培養(yǎng)液。
9. 權(quán)利要求1-8所述方法，用于制備鹿骨膜組織條件培養(yǎng)液。
【文檔編號(hào)】C12N5/071GK104152400SQ201410401158
【公開(kāi)日】2014年11月19日 申請(qǐng)日期:2014年8月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月15日
【發(fā)明者】李春義, 王文英, 孫紅梅 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所