一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種腈水解酶工程菌的高密度發(fā)酵方法，該方法采用全新的重組大腸桿菌發(fā)酵及補料培養(yǎng)基配方，通過采用D0-STAT偶聯(lián)分步誘導，并分階段逐步提高轉(zhuǎn)速的方法，既滿足了培養(yǎng)過程中隨著生物量增加對攪拌功率的需要，又有效控制了菌體的生長速率，預防了菌體生長過快引起的產(chǎn)酸積累，反饋抑制，培養(yǎng)基浪費等弊端；此外，通過采用批次補加乳糖的誘導方式，既避免了乳糖濃度過高所引起的發(fā)酵液粘度增大，致使傳氧、傳質(zhì)受阻問題，又提高了誘導強度，利用本發(fā)明的高密度發(fā)酵技術(shù)，重組大腸桿菌的生物量由10.35gDCW/L提高至70gDCW/L，體積酶活從18205U/L提高至103530U/L，使發(fā)酵水平提高了4.7倍。
【專利說明】一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法 (一）
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種產(chǎn)腈水解酶的重組大腸桿菌的高密度培養(yǎng)和目的基因的高效表 達方法。 (二）
【背景技術(shù)】
[0002] 腈水解酶能夠?qū)崿F(xiàn)有機腈化合物的一步水解合成對應(yīng)的有機羧酸。通過腈水 解酶實現(xiàn)氰基水解反應(yīng)條件溫和，反應(yīng)效率高，而且具有比較高的區(qū)域選擇性和立體選 擇性。近年來，利用腈水解酶進行氰基水解合成有機羧酸已經(jīng)成為研究的熱點，大量文 獻、專利報道了腈水解酶在有機羧酸合成中的應(yīng)用。更重要的是，許多對于雙腈具有區(qū) 域選擇性催化活力的腈水解酶的發(fā)現(xiàn)，對于阿托伐他汀側(cè)鏈關(guān)鍵手性中間體（R)-4_氰 基 _3_ 輕基丁酸（Organic Process Research&Development 20〇6, 10, 661_665)、普 瑞巴林手性中間體（3S) _3_氛基_5_甲基己酸（Journal of Molecular Catalysis 851^711^^。41，2006:75 - 80)、加巴噴丁中間體1-氰基環(huán)己基乙酸卬52005009157六1)、 L-甲基多巴等關(guān)鍵藥物中間體酶法合成工藝的建立具有巨大的指導作用。
[0003] 扁桃酸（mandelic acid, MA)又稱作苦杏仁酸，為手性分子，兩種對映異構(gòu)體。光 化學純R-扁桃酸（R-M)是一種重要的精細化工中間體和手性藥物前體。廣泛應(yīng)用于多種 光學活性藥物的合成，如頭孢菌素、半合成青霉素等抗生素、抗腫瘤藥物、減肥藥物、農(nóng)藥及 其他藥物。此外，R-M還是重要的手性拆分劑和手性催化劑，被稱為"萬能"拆分劑，其中對 醇胺類藥物的拆分尤為突出。隨著R-M的新用途的不斷發(fā)現(xiàn)，其市場需求也在與日俱增。
【權(quán)利要求】
1. 一種含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述方法為：將含腈水 解酶基因的工程菌經(jīng)擴大培養(yǎng)獲得的種子液以體積濃度2?4%的接種量接種至發(fā)酵罐， 于37°C、500rpm、通空氣比l-2vvm條件下發(fā)酵培養(yǎng)至發(fā)酵液溶解氧15% ±5%，開始采用 DO-STAT方式添加補料培養(yǎng)基，維持發(fā)酵液溶氧值在15% ±5%，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速為600? 700rpm，發(fā)酵至OD6tltl達到20?40時，調(diào)整溫度至25?35°C，加入終濃度10?25g/L乳糖 進行第一次誘導；發(fā)酵至OD 6tltl達到70?110后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至720?780rpm ;發(fā)酵至OD6tltl達 110-130,再次加入終濃度10?15g/L乳糖進行二次誘導；發(fā)酵至OD 6tltl達到115?140后， 調(diào)整轉(zhuǎn)速至780?850rpm，繼續(xù)發(fā)酵至OD6c?達到150?190后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至900?1300rpm ; 維持發(fā)酵轉(zhuǎn)速為900?1300rpm、溫度25?35°C條件下，繼續(xù)發(fā)酵至0D_值以及比酶活在 3h內(nèi)不再上升或開始下降時，停止發(fā)酵，放罐，獲得發(fā)酵液，發(fā)酵過程中維持發(fā)酵液pH值為 6. 0?7. 0 ;所述發(fā)酵罐內(nèi)添加含終濃度50g/L卡那霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基，所述發(fā)酵培養(yǎng)基組 成為：蛋白胨 10 ?20g/L，酵母粉 5 ?15g/L，NaC15 ?15g/L，甘油 5 ?20g/L，（NH4)2SO4 3 ?10g/L，KH2PO4 0· 5 ?3g/L，K2HPO4 · 3H20 I. 0 ?5g/L，MgSO4 · 7H20 0· 1 ?I. Og/L，溶劑 為水，pH值為6. 0-7. 0 ;所述補料培養(yǎng)基組成為：蛋白胨50-120g/L，酵母提取30?80g/L， 甘油 300 ?900g/L，檸檬酸 1 ?8g/L，硫酸銨 1 ?10g/L，K2HP04 1 ?8g/L，NaCl 1 ?IOg/ UMgSO4 1?10g/L，溶劑為水，pH值為6.0?7.0。
2. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述維持 發(fā)酵液溶氧值在15% ±5 %，調(diào)整攪拌轉(zhuǎn)速為700rpm，發(fā)酵至0D_達到90后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至 750rpm ;發(fā)酵至0D_達125后，調(diào)整轉(zhuǎn)速至800rpm，繼續(xù)發(fā)酵至OD6c?達到170后，調(diào)整轉(zhuǎn)速 至 lOOOrpm。
3. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā)酵 液OD6c?值達30時，加入終濃度20g/L乳糖進行誘導。
4. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述誘導 培養(yǎng)至OD6c?值達120時，再次加入終濃度14g/L乳糖進行二次誘導。
5. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā) 酵培養(yǎng)基組成為：蛋白胨15g/L，酵母粉12g/L，NaCl 10g/L，甘油12g/L，（NH4)2SO4 5g/L， KH2PO4 I. 36g/L，K2HPO4 · 3H20 2. 28g/L，MgSO4 · 7H20 0· 375g/L，溶劑為水，pH 值為 6· 5。
6. 如權(quán)利要求I所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述補料 所用培養(yǎng)基組成為：蛋白胨75g/L，酵母提取50g/L，甘油500g/L，檸檬酸3g/L，硫酸銨5g/ 1^，1( 2冊04 38/1，恥(：158/1，1%504 58/1，溶劑為水，？!1值為6.5。
7. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述種子 液按如下方法制備：將含腈水解酶基因的工程菌接種至LB固體培養(yǎng)基，在37°C培養(yǎng)1?2 天，獲得斜面菌體；挑取斜面菌體接種至含終濃度50g/L的LB液體培養(yǎng)基，37°C、150rpm下 培養(yǎng)12?24h，得種子液。
8. 如權(quán)利要求7所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述含腈 水解酶基因的工程菌是以敏捷食酸菌（Acidovorax facilis)ZJB09122基因組DNA為模板， 以序列1和序列2為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶的表達質(zhì)粒，然后再以含重組 腈水解酶的表達質(zhì)粒為模板，以序列3和序列4為引物，通過PCR方法構(gòu)建含重組腈水解酶 的工程菌； 序列 I :5' -AATGGATCCATGGTTTCGTATAACAGCAAG-3' ； 序列 2 :5' -AGGGTCGACCTACTTTGCTGGGACCGG-3' ； 序列 3 :5' -GAGCACGTTCAGCCGCTGTCCAAAT-3' ； 序列 4 :5' -CGGCTGAACGTGCTCCCAGCAGTTC-3'。
9. 如權(quán)利要求7所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述含腈 水解酶基因的工程菌是以糞產(chǎn)堿桿菌（Alcaligenes faecalis)ZJUTB10基因組DNA為模 板，以序列5和序列6為引物，通過PCR方法獲得含重組腈水解酶的表達質(zhì)粒，然后再以含 重組腈水解酶的表達質(zhì)粒為模板，以序列7和序列8為引物，通過PCR方法構(gòu)建含重組腈水 解酶的工程菌； 序列 5 :5' ~AATGGATCCATGCAGACAAGAAAAATCGTC~3,； 序列 6 :5' -AGGGTCGACTCAGGACGGTTCTTGCAC-3' ； 序列 7 :5' -CATGGAAGAGATCNNNTTCGCTAAGGCTATC-3' ； 序列 8 :5' -GATAGCCTTAGCGAANNNGATCTCTTCCATG-3'。
10. 如權(quán)利要求1所述含腈水解酶基因工程菌的高密度發(fā)酵方法，其特征在于所述發(fā) 酵過程中流加體積濃度8%氨水和體積濃度10%磷酸水溶液維持發(fā)酵液pH值為6. 5。
【文檔編號】C12N9/78GK104212785SQ201410394475
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】薛亞平, 鄭裕國, 柳志強, 劉兆巍, 王應(yīng)鵬, 徐喆 申請人:浙江工業(yè)大學