一種中華鱉微衛(wèi)星分子標記及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】一種中華鱉微衛(wèi)星分子標記及應(yīng)用，該分子標記包括17個中華鱉的微衛(wèi)星位點，其核苷酸序列分別如SEQ?ID：1至SEQ?ID：17所示，同時提供該17個微衛(wèi)星位點的引物序列。本發(fā)明從中華鱉轉(zhuǎn)錄組EST序列中篩選17個微衛(wèi)星位點，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼序列涉及特異性引物進行擴增，獲得的產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于中華鱉群體遺傳學(xué)多樣性分析、親緣關(guān)系分析、分子標記輔助育種等領(lǐng)域。
【專利說明】—種中華鱉微衛(wèi)星分子標記及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于水產(chǎn)動物遺傳育種【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種中華鱉微衛(wèi)星DNA分子標記位點及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]中華鳘(Pelodiscus sinensis)，又稱甲魚、團魚、水魚，隸屬爬行龜鳘目(Testudinata),鳘科(Tironychidae),中華鳘屬(Pelodiscus),是我國淡水特種水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)品之一，廣泛分布于我國除西藏、青海和新疆外的其他地區(qū)，國外主要在朝鮮、日本和越南有分布(黃雪貞等,2012)。20世紀90年代至今，中華鱉養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展過程中存在養(yǎng)殖場相互引種及外來鱉種涌入的問題，致使當(dāng)前中華鱉種質(zhì)混雜。為保障中華鱉養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展，在湖南長沙、安徽蛘埠、山東廣饒、江西鄱陽湖等地相繼建立了中華鱉原種場、良種場。
[0003]微衛(wèi)星(SSR)標記，其特點是含I~6個堿基的核心單元串聯(lián)重復(fù)的核心序列，核心序列側(cè)翼序列是相對保守的單拷貝。SSR的優(yōu)點包括:數(shù)量豐富，分布均勻；各SSR位點有特異性引物，擴增結(jié)果重復(fù)性好。微衛(wèi)星在不同物種間的含量和分布不同，存在差異(Tothet al.，2000)，并且主要分布在非編碼區(qū)。其序列長度與核心序列重復(fù)次數(shù)相關(guān)，變異與核心序列的重復(fù)次數(shù)呈正比。微衛(wèi)星兩端的序列多為保守的單拷貝序列，可據(jù)此設(shè)計特異性引物，通過PCR技術(shù)擴增獲得相應(yīng)序列，經(jīng)PAGE分析，獲得不同基因型個體的多態(tài)性。選用微衛(wèi)星標記對中華鱉種質(zhì)資源進行保護和合理開發(fā)、分子標記輔助育種等具有重要意義。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種中華鱉微衛(wèi)星分子標記及應(yīng)用，從中華鱉EST序列中篩選出17個具多態(tài)性的中華鱉的微衛(wèi)星位點，以及相應(yīng)的引物，為中華鱉的種群遺傳學(xué)多樣性分析及分子標記輔助育種技術(shù)提供有效的工具。
[0005]為達上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:一種中華鱉微衛(wèi)星分子標記，所述分子標記選自如SEQ ID NO:1至SEQ ID NO: 17所示的核苷酸序列。
[0006]本發(fā)明還提供上述17個微衛(wèi)星分子標記位點上設(shè)計的引物對以用于PCR擴增，其中:
[0007]序列為SEQ ID NO:1的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-1，其序列為:
[0008]PS-1 F:5’ -TTCCCAGGCTTTAACCAAGAGG-3，，SEQ ID NO:18 ；
[0009]PS-1 R:5’ -GCAACAATATGACAGCGACACT-3’，SEQ ID NO:19 ;
[0010]序列為SEQ ID NO:2的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-2，其序列為:
[0011]PS-2 F:5’ -CCTCTCAGGTTTGTAATTTGCCATT-3’，SEQ ID NO:20 ；
[0012]PS-2 R:5’ -AACACATTGCCATCTCCTCAGT-3’，SEQ ID NO:21 ；
[0013]序列為SEQ ID NO:3的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-3，其序列為:
[0014]PS-3 F:5’ -AGCATGTGGTACTGATGTGTAG-3’，SEQ ID NO:22 ；
[0015]PS-3 R:5’ -ACTGTCATACATTCGCTAGTGA-3’，SEQ ID NO:23 ；
[0016]序列為SEQ ID NO:4的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-4，其序列為:
[0017]PS-4 F:5，-GCTCTACACCTTCCACCTTGTT-3’，SEQ ID NO:24 ；
[0018]PS-4 R:5，-GGGTGAAGACTCTGATGGGTAG-3，，SEQ ID NO:25 ；
[0019]序列為SEQ ID NO:5的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-5，其序列為:
[0020]PS-5 F:5’ -TGTATCATTCCTGTGCTGTA-3，，SEQ ID NO:26 ;
[0021]PS-5 R:5’ -GCAATTCTGTCGTGTGAG-3’，SEQ ID NO:27 ；
[0022]序列為SEQ ID NO:6的微衛(wèi)星位點設(shè)計的弓丨物對PS_6，其序列為:
[0023]PS-6 F:5’ -TCCGCCATGATCGAGAAGAAT-3’，SEQ ID NO:28 ；
[0024]PS-6 R:5，-CCTGTCCATCAATCACACTGAG-3J, SEQ ID NO:29 ；
[0025]序列為SEQ ID NO: 7的微衛(wèi)星位點設(shè)計的弓丨物對PS_7，其序列為:
[0026]PS-7 F:5’ -CGTGATGATGGTGACTGGTATC-3’，SEQ ID NO:30 ；
[0027]PS-7 R:5，-GAGGGTGAGACTTCGGAGAC-3，，SEQ ID NO:31 ；
[0028]序列為SE Q ID NO:8的微衛(wèi)星位點設(shè)計的弓丨物對PS_8，其序列為:
[0029]PS-8 F:5，-GCCCAGCAGGAACAAAGCATTA-3，，SEQ ID NO:32 ；
[0030]PS-8 R:5，-CCTCATCAGCCTCGTCCATCT-3，，SEQ ID NO:33 ；
[0031 ]序列為SEQ ID NO:9的微衛(wèi)星位點設(shè)計的弓丨物對PS-9，其序列為:
[0032]PS-9 F:5’ -AACGGCTCAGAACTGTCACTT-3，，SEQ ID NO:34 ；
[0033]PS-9 R:5’ -GCTGCTACCAAGGAGGTGTT-3’，SEQ ID NO:35 ；
[0034]序列為SEQ ID NO:10的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-10，其序列為:
[0035]PS-10 F:5’ -CCTTCACAGATACTGACAGACT-3’，SEQ ID NO:36 ；
[0036]PS-10 R:5，-GTCGGAGGCATGGTAATAGG-3，，SEQ ID NO:37 ；
[0037]序列為SEQ ID NO:11的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-11，其序列為:
[0038]PS-1l F:5’ -GAGGAGGAGGACGAAGAAGAG-3’，SEQ ID NO:38 ；
[0039]PS-1l R:5，-GAGGCAATCAGCATCGGATG-3，，SEQ ID NO:39 ；
[0040]序列為SEQ ID NO:12的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-12，其序列為:
[0041]PS-12 F:5，-TTGCTGCGAGTCATAATGATCC-3’，SEQ ID NO:40 ；
[0042]PS-12 R:5’ -CAACTCCTGCCAGCCAATG-3，，SEQ ID NO:41 ；
[0043]序列為SEQ ID NO:13的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-13，其序列為:
[0044]PS-13 F:5’ -CCTCAGTGGAGTGGAACATTG-3’，SEQ ID NO:42 ；
[0045]PS-13 R:5’ -TGAGCACCAAGAGTAGATGAAC-3’，SEQ ID NO:43 ；
[0046]序列為SEQ ID NO:14的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-14，其序列為:
[0047]PS-14 F:5’ -TTCAGCAAAGCAGCACCCAGAG-3，，SEQ ID NO:44 ；
[0048]PS-14 R:5’ -CTCCACGCTCGTTGACAGAAGG-3’，SEQ ID NO:45 ；
[0049]序列為SEQ ID NO:15的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-15，其序列為:
[0050]PS-15 F:5’ -GAGACCAACACCAATCACCAT-3’，SEQ ID NO:46 ；
[0051]PS-15 R:5’ -CTAGAGCCACTTCCTGAGGT-3’，SEQ ID NO:47 ；
[0052]序列為SEQ ID NO:16的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-16，其序列為:
[0053]PS-16 F:5’ -GTCAGTCGCCAGGAAGTAATGT-3’，SEQ ID NO:48 ；
[0054]PS-16 R:5’ -TCTAGTCTGTGCCAGCCAATAC-3’，SEQ ID NO:49 ；
[0055]序列為SEQ ID NO:17的微衛(wèi)星位點設(shè)計的引物對PS-17，其序列為:
[0056]PS-17 F:5’ -TCTCGCCTCGTTATGTGGTCA-3，，SEQ ID NO:50 ；
[0057]PS-17 R:5’ -GGTCAGATTGCTTCCAGTGTCT-3’，SEQ ID NO:51 ；
[0058]本發(fā)明實現(xiàn)上述方案的步驟如下:
[0059]I)微衛(wèi)星PCR引物設(shè)計及合成:從轉(zhuǎn)錄組EST文庫中篩選出含有微衛(wèi)星序列的片段，并設(shè)計引物進行合成；
[0060]2)基因組DNA的獲取:采用天根DNA試劑盒提取中華鱉裙邊組織基因組DNA ；
[0061]3)電泳檢測PCR擴增產(chǎn)物:采用非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物；
[0062]4)遺傳參數(shù)評估:根據(jù)每個個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEP0P 4.2計算遺傳多樣性參數(shù)。
[0063]本發(fā)明從中華鱉基因組DNA中篩選17個微衛(wèi)星位點，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計特異性引物進行擴增，獲得的產(chǎn)物具有高度多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于中華鱉的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標記輔助育種等領(lǐng)域。
【具體實施方式】
[0064]下面結(jié)合具體實例對本發(fā)明的微衛(wèi)星位點應(yīng)用進行詳細地描述。
[0065]1.微衛(wèi)星位點的篩選:
[0066]從中華鱉轉(zhuǎn)錄組EST文庫中篩選還有微衛(wèi)星的序列，進行微衛(wèi)星序列的查找；參數(shù)設(shè)置為含有二堿基、三堿基重復(fù)5次以上的序列。共篩選出60個含有微衛(wèi)星重復(fù)的位點，并從中設(shè)計引物進行多態(tài)性檢測。
[0067]2.微衛(wèi)星引物設(shè)計
[0068]從含有微衛(wèi)星的基因序列中，選取符合引物設(shè)計的序列使用PrimerPremier5.0進行引物設(shè)計。主要參數(shù)設(shè)置為:引物長度18 — 25bp，PCR產(chǎn)物片段長度為100— 300bp，退火溫度為50— 70°C。GC含量一般在40— 60%之間，盡量避免錯配及發(fā)卡結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。
[0069]3.引物多態(tài)性檢測
[0070]I)基因組DNA提取:
[0071]采用海洋動物組織基因組DNA提取試劑盒(天根生化:DP324)提取40個中華鱉裙邊組織DNA。
[0072]2)微衛(wèi)星PCR擴增
[0073]采用設(shè)計的微衛(wèi)星引物序列進行PCR擴增，PCR程序為95°C 5min，95°C 30s，Ta(據(jù)引物定)30s，72°C 45s，反應(yīng)進行27個循環(huán)，4°C保存；反應(yīng)體系為15 μ 1，其中含正反引物0.2yM、dNTP 各 200yM、lXPCR buffer、1.2mMMg2+、IU Taq 酶。
[0074]3)電泳檢測擴增產(chǎn)物:
[0075]采用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產(chǎn)物，350W恒電壓預(yù)電泳30min后電壓5h。電泳完成后進行染色顯影處理，膠板在10%的冰醋酸溶液浸泡30min，蒸餾水洗滌2次,各Imin, 0.1 %硝酸銀染色1min, 10%硫代硫酸鈉染色90s,兩次，I %氫氧化鈉顯色至條帶清晰。采用20bp DNA ladder做為marker檢測等位基因位置。
[0076]4.遺傳參數(shù)評估:
[0077]根據(jù)每個個體微衛(wèi)星擴增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEP0P計算遺傳多樣性參數(shù)，從而篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的位點。
[0078]經(jīng)過多樣性檢測，本發(fā)明共篩選出17對具有多態(tài)性的微衛(wèi)星位點，其核苷酸序列分別為SEQ ID NOil-SEQ ID NO: 17，其設(shè)計的多態(tài)性引物信息如表1所示。
[0079] 表1:17對微衛(wèi)星位點的退火溫度、片段長度、多態(tài)性相關(guān)信息
[0080]
【權(quán)利要求】
1.一種中華鱉微衛(wèi)星分子標記，其特征在于，所述分子標記選自如SEQ ID NO:1至SEQID NO: 17所示的核苷酸序列。
2.如權(quán)利要求1所述的中華鱉微衛(wèi)星分子標記，其特征在于，擴增所述分子標記的引物選自如下引物對:
PS-1 F:5， -TTCCCAGGCTTTAACCAAGAGG-3，，
PS-1 R:5’ -GCAACAATATGACAGCGACACT-3’ ；
PS-2 F:5’ -CCTCTCAGGTTTGTAATTTGCCATT-3’，
PS-2 R:5’ -AACACATTGCCATCTCCTCAGT-3’ ；
PS-3 F:5’ -AGCATGTGGTACTGATGTGTAG-3’，
PS-3 R:5’ -ACTGTCATACATTCGCTAGTGA-3’ ；
PS-4 F:5’ -GCTCTACACCTTCCACCTTGTT-3’，
PS-4 R:5， -GGGTGAAGACTCTGATGGGTAG-3，；
PS-5 F:5’ -TGTATCATTCCTGTGCTGTA-3’，
PS-5 R:5’ -GCAATTCTGTCGTGTGAG-3’ ；
PS-6 F:5’ -TCCGCCATGATCGAGAAGAAT-3’，
PS-6 R:5’ -CCTGTCCATCAATCACACTGAG-3’ ；
PS-7 F:5’ -CGTGATGATGGTGACTGGTATC-3’，
PS-7 R:5， -GAGGGTGAGACTTCGGAGAC-3，；
PS-8 F:5，-GCCCAGCAGGAACAAAGCATTA-3，，
PS-8 R:5’ -CCTCATCAGCCTCGTCCATCT-3’ ；
PS-9 F:5’ -AACGGCTCAGAACTGTCACTT-3，，
PS-9 R:5’ -GCTGCTACCAAGGAGGTGTT-3’ ；
PS-1O F:5’ -CCTTCACAGATACTGACAGACT-3’，
PS-10 R:5， -GTCGGAGGCATGGTAATAGG-3，；
PS-1l F:5， -GAGGAGGAGGACGAAGAAGAG-3，，
PS-1l R:5， -GAGGCAATCAGCATCGGATG-3，；
PS-12 F:5’ -TTGCTGCGAGTCATAATGATCC-3’，
PS-12 R:5， -CAACTCCTGCCAGCCAATG-3，；
PS-13 F:5’ -CCTCAGTGGAGTGGAACATTG-3’，
PS-13 R:5， -TGAGCACCAAGAGTAGATGAAC-3，；
PS-14 F:5，-TTCAGCAAAGCAGCACCCAGAG-3，，
PS-14 R:5’ -CTCCACGCTCGTTGACAGAAGG-3’ ；
PS-15 F:5，-GAGACCAACACCAATCACCAT-3，，
PS-15 R:5’ -CTAGAGCCACTTCCTGAGGT-3’ ；
PS-16 F:5’ -GTCAGTCGCCAGGAAGTAATGT-3’，
PS-16 R:5’ -TCTAGTCTGTGCCAGCCAATAC-3’ ；
PS-17 F:5’ -TCTCGCCTCGTTATGTGGTCA-3’，
PS-17 R:5’ -GGTCAGATTGCTTCCAGTGTCT-3’。
3.權(quán)利要求1或2所述的中華鱉微衛(wèi)星分子標記在中華鱉群體遺傳學(xué)多樣性分析中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1或2所述的中華鱉微衛(wèi)星分子標記在中華鱉親緣關(guān)系分析中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1 或2所述的中華鱉微衛(wèi)星分子標記在中華鱉輔助育種中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104131010SQ201410394467
【公開日】2014年11月5日 申請日期:2014年8月12日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月12日
【發(fā)明者】王曉清, 馬曉, 熊鋼, 曾丹, 嚴璐琪 申請人:湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)