單管辨別優(yōu)生優(yōu)育檢查中四種病原體的pcr方法及試劑盒的制作方法

單管辨別優(yōu)生優(yōu)育檢查中四種病原體的pcr方法及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種在單個PCR反應(yīng)管中同時檢測四種靶核酸的實(shí)時熒光PCR方法，用于檢測樣品中弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒。本方法操作快速、一步完成，準(zhǔn)確性和靈敏度高，在實(shí)踐檢測中還未出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果。另外，本發(fā)明還涉及上述PCR方法中所涉及的試劑，用于上述方法的檢測試劑盒和該檢測試劑盒的制備應(yīng)用等。
【專利說明】單管辨別優(yōu)生優(yōu)育檢查中四種病原體的PCR方法及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于核酸檢測領(lǐng)域，具體說，本發(fā)明提供了在同一 PCR管中快速平行地檢 測四種病原體（弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒）的熒光PCR方法及其試劑 盒等。

【背景技術(shù)】
[0002] 弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒是我國優(yōu)生優(yōu)育檢查中的四種常見 病原體。
[0003] 弓形蟲中醫(yī)叫三尸蟲，是細(xì)胞內(nèi)寄生蟲。寄生于細(xì)胞內(nèi)，隨血液流動，到達(dá)全身各 部位，破壞大腦、心臟、眼底，致使人的免疫力下降，患各種疾病。弓形蟲可以通過食用不熟 的被污染的肉類，或飼養(yǎng)寵物感染。人感染后，便患了弓形蟲病。孕婦一旦感染，病原體即 可通過胎盤血液循環(huán)"游蕩"到胎兒身上，可以導(dǎo)致流產(chǎn)、早產(chǎn)；胎兒可能患上視網(wǎng)膜炎、脈 絡(luò)膜炎等，影響視力；同時可能發(fā)生腦積水、腦鈣化、小腦畸形等疾病。
[0004] 風(fēng)疹病毒是RNA病毒，屬于披膜病毒科，電鏡下多呈不規(guī)則球形。該病毒多于春 季傳播，它會伴隨人的咳嗽和噴嚏而漂浮在空氣中，抵抗力較弱的人吸入風(fēng)疹病毒后，經(jīng)過 2?3周的潛伏期，之后出現(xiàn)發(fā)熱、耳后及枕部淋巴結(jié)腫大，全身奇癢皮疹等癥狀。風(fēng)疹病毒 容易發(fā)生垂直感染，孕婦妊娠早期初次感染風(fēng)疹病毒后，病毒可通過胎盤屏障進(jìn)入胎兒，常 可造成流產(chǎn)或死胎，還可導(dǎo)致胎兒發(fā)生先天性風(fēng)疹綜合征，引起胎兒畸形。
[0005] 人類巨細(xì)胞病毒（HCMV)亦稱細(xì)胞包涵體病毒，感染的細(xì)胞腫大并具有巨大的核 內(nèi)包涵體，它是一種皰疹病毒組DNA病毒，只能感染人。該病毒可通過性、血液、唾液、尿液、 目艮淚、母嬰傳播。孕婦感染后可通過胎盤侵襲胎兒引起先天性感染，少數(shù)造成早產(chǎn)、流產(chǎn)、死 產(chǎn)或生后死亡。患兒可發(fā)生黃疸，肝脾腫大，血小板減少性紫斑及溶血性貧血。存活兒童常 遺留永久性智力低下，神經(jīng)肌肉運(yùn)動障礙，耳聾和脈絡(luò)視網(wǎng)膜炎等。
[0006] 單純皰疹屬于皰疹病毒科a病毒亞科，大小約180nm，是一種DNA病毒。單純皰疹 病毒在全球廣泛分布，人群中感染極為普遍，潛伏和復(fù)發(fā)感染者較多?；颊吆蛶Ф菊呤窃摬?的傳染源。病毒可通過皮膚、粘膜的直接接觸或性接觸途徑進(jìn)入機(jī)體。該病毒可分為兩型， HSV-1的原發(fā)感染常局限在口咽部，尤以齦口炎（gingivostomatitis)最為多見。HSV-2的 原發(fā)感染主要引起生殖器皰疹。新生兒皰疹是臨床上常見而又嚴(yán)重的感染，據(jù)統(tǒng)計(jì)死亡率 超過50%，存活者約有1/2嚴(yán)重?fù)p傷。HSV-UHSV-2在分娩時均可通過產(chǎn)道感染新生兒，其 中HSV-2約占75%。感染后，新生兒常出現(xiàn)皮膚、眼和口腔的局部損傷、腦炎、膿毒血癥等癥 狀，可引起死亡。此外也可通過吸乳、接吻、性接觸、輸血等途徑感染，引起單核細(xì)胞增多癥、 肝炎、間質(zhì)性肺炎、視網(wǎng)膜炎、腦炎等。
[0007] 目前我國各醫(yī)院對弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒的檢測均以免疫 學(xué)檢測為主，如參見中國專利（申請）第00130423、01115286、03136487、200810045267、 201310367213、201310441198 號等。
[0008] 本發(fā)明人的團(tuán)隊(duì)致力于通過PCR方法直接針對病原體的特異性基因片段進(jìn)行檢 測，曾經(jīng)在中國專利第200910157409號等專利中實(shí)現(xiàn)了對HBV等病毒進(jìn)行多重（種）同時 在單管中檢測。然而，弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒等病原體的基因序列存 在片段的重復(fù)性多、GC含量偏離以及特異性短片段少，而特異長片段的相互相干擾嚴(yán)重等 特點(diǎn)，因此至今無法在單管中同時通過PCR方法一次性檢測，只開發(fā)出了諸如中國專利（申 請）第201410016220號這樣的芯片雜交檢測方法，其中探針是分離點(diǎn)樣的，才避免了互相 干擾。
[0009] 經(jīng)過多年的研究，本發(fā)明人摒棄了現(xiàn)有引物和探針的一些傳統(tǒng)做法，包括序列完 全配對、GC比等，結(jié)合對工具酶的研究，終于使得弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹 病毒等病原體能夠通過PCR方法多重單管實(shí)時檢測出來，靈敏、快速而且準(zhǔn)確率高，尤其適 合自動化、大樣本量的檢測。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是首次提供在單管中同時檢測弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì) 胞病毒、單純皰疹病毒的實(shí)時PCR方法。盡管由于這些病毒的靶核酸本身為設(shè)計(jì)同時檢測 的引物對和探針帶來了極大地困難，但是在本發(fā)明人長期的研究下，通過摸索出的引物對 和探針序列、比例以及工具酶的研究，終于使得在單管中同時檢測來自這是中病毒的靶核 酸得以順利實(shí)施，而且具有較高的準(zhǔn)確性和靈敏度，尤其可應(yīng)用在大型自動化檢測分析上。 另外，本發(fā)明還提供了可以用于上述方法的試劑盒及核酸混合物等。
[0011] 具體而言，在第一方面，本發(fā)明提供了在單個PCR反應(yīng)管中同時檢測樣品中四種 靶核酸的實(shí)時熒光PCR方法，所述靶核酸來自弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病 毒，所述方法包括：
[0012] (1)提取樣品中的核酸，獲得病毒總核酸提取液；
[0013] ⑵在所述單個PCR反應(yīng)管中混合核酸提取液、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合 酶、dNTP、靶核酸引物對和探針，其中所述探針標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，而且各種探針 標(biāo)記的熒光基團(tuán)的熒光檢測波長互不相同，其中，
[0014] 靶核酸引物對包括：
[0015] 弓形蟲：
[0016] TO-L ：CTGGTATGTACGCAATAG
[0017] TO-R ：GTCCTTGTATCATGTCAATA
[0018] 風(fēng)疹病毒：
[0019] RV-L ：GGTCAAGTTCCATACAGA
[0020] RV-R ：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
[0021] 巨細(xì)胞病毒：
[0022] HCMV-L ：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
[0023] HCMV-R ：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
[0024] 單純皰疹病毒：
[0025] HSV-L ：GCATCTATACCTCTTTCTGA
[0026] HSV-R ：CGATCCGTTGATAAACATC
[0027] 靶核酸探針包括：
[0028] 弓形蟲：
[0029] TO-P ：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
[0030] 風(fēng)疹病毒：
[0031] RV-P ：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
[0032] 巨細(xì)胞病毒：
[0033] HCMV-P ：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
[0034] 單純皰疹病毒：
[0035] HSV-P ：TGAAACAGACACGCCAACTGG
[0036] (3)進(jìn)行PCR反應(yīng)，并實(shí)時檢測不同波長的熒光信號；
[0037] (4)判斷是否有靶核酸存在于樣品中。
[0038] 其中，判斷是否有靶核酸存在于樣品中可以根據(jù)熒光檢測結(jié)果計(jì)算出的Ct值來 進(jìn)行。盡管由于大量核酸片段存在于同一擴(kuò)增體系中，互相干擾不可避免，但是擴(kuò)增仍舊能 得以進(jìn)行，并且仍舊能夠由ABI7500熒光儀等設(shè)備計(jì)算得出Ct值，而且相互很容易區(qū)分。
[0039] 在本文中，"樣品"是潛在可能含有靶核酸的離體樣品，如食品、空氣、血液、血液制 品、唾液、醫(yī)療用品或藥品等。本發(fā)明的實(shí)時PCR方法僅限于對離體樣品的檢測，檢測的直 接結(jié)果是靶核酸的存在性與否。即使對于利用本發(fā)明的檢測方法檢測人或動物的血液樣品 中病原體（如，病毒）上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在與否，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī) 生或取樣人員判斷檢測出的靶核酸是來自于血液中的病原體還是取樣時不慎污染的病原 體，而不能直接得到疾病的診斷結(jié)果或健康狀況；即使靶核酸來自于血液中的病原體，也只 能說明相應(yīng)人或動物是相應(yīng)病原體的攜帶者，還需要有經(jīng)驗(yàn)的醫(yī)生根據(jù)相應(yīng)人或動物的體 質(zhì)、病史、臨床癥狀等綜合情況才能判斷出是否會造成疾病或?qū)】禒顩r有影響。當(dāng)然，由 于這些病毒可以經(jīng)口、鼻傳播，因此本發(fā)明的實(shí)時PCR方法可以針對食品和/或空氣樣品進(jìn) 行檢測，用于環(huán)境安全領(lǐng)域，不涉及疾病的診斷和治療。
[0040] 優(yōu)選在本發(fā)明的第一方面的方法中，樣品是經(jīng)過預(yù)處理而富集了核酸（如靶核 酸）的樣品，如樣品是經(jīng)過磁珠提取法處理過的樣品。優(yōu)選地，提取樣品中的核酸是采用磁 珠提取法提取得，具體而言，其中的步驟如下：向樣品加入核酸萃取液，保溫后加入磁珠，混 合均勻，施加磁場后，棄去其中液體，然后兩次洗滌，第一次洗滌使用包含高氯酸鈉和乙醇 的洗滌液，第二次洗滌使用包含乙醇的洗滌液，最后采用包含pH緩沖液Tris-HCl洗脫。更 優(yōu)選在磁珠提取法中，所述核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸 鈉、乙醇和pH緩沖液Tris-HCl。
[0041] 在本文中，"單管"可以與"單個PCR反應(yīng)容器"互換使用，指所述實(shí)時PCR方法在 技術(shù)上是在同一個容器中進(jìn)行的，沒有必要更換容器。最優(yōu)選其中所述容器是PCR反應(yīng)管， 其它可以進(jìn)行PCR反應(yīng)并可進(jìn)行實(shí)時熒光檢測的容器也在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。在本發(fā)明 第一方面的實(shí)時PCR方法中，在同一個容器中就可以完成PCR擴(kuò)增和實(shí)時檢測的步驟，整個 過程不必更換容器，因而方便了操作者。操作者只需要向容器中加入樣品與各種試劑混合 即可，就可以通過市售的普通實(shí)時熒光PCR儀來自動完成，整個過程操作者只需添加樣品 和試劑即可，非常方便。尤其是，整個過程只需添加樣品和試劑的步驟干預(yù)，便于實(shí)現(xiàn)全自 動操作，從而節(jié)約了人力成本并最大程度降低了人為失誤的可能性，因此本發(fā)明的檢測方 法便于自動化所帶來的成本和可靠性優(yōu)勢是可以預(yù)期的。
[0042] 本發(fā)明的實(shí)時PCR方法是多重檢測方法，即同時檢測的核酸有多（如，四）種。在 本發(fā)明的第一方面的方法中，每種核酸可以是RNA，也可以是DNA，或者這兩種核酸類型的 混合物。
[0043] 在本發(fā)明的第一方面的方法中，不同種探針（包括不同種靶核酸探針、不同種內(nèi) 對照核酸探針）之間所標(biāo)記的熒光基團(tuán)的熒光檢測波長互不相同，這樣能夠同時或快速地 順序掃描不同的檢測波長，分別記錄下各種熒光基團(tuán)的熒光變化，從而能夠進(jìn)行同時檢測。 在本文中，探針具有本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的含義，其由為能與擴(kuò)增出的靶核酸單鏈結(jié)合 的單鏈DNA。通常，在每種探針的核苷酸序列的5'端標(biāo)記熒光基團(tuán)，3'端標(biāo)記淬滅基團(tuán)。優(yōu) 選其中各種探針標(biāo)記有不同的熒光基團(tuán)。優(yōu)選熒光基團(tuán)及其淬滅基團(tuán)是市售的，如可以采 用 FAM?/ SYBI^'Green I、\qc8 /J〇E/HEX、NEDT7TAMRATM/CyJ.r、R〇X T7Texas Re#-.和Cy5ft' 等常規(guī)產(chǎn)品，它們的檢測波長互不相同，也可以委托公司合成標(biāo)記有熒光標(biāo)記的探針。優(yōu)選 在本發(fā)明的第一方面的方法中，熒光基團(tuán)分別是FAM，TAMRA，ROX，Cy5。
[0044] 由于現(xiàn)有的引物對和探針設(shè)計(jì)方法難以設(shè)計(jì)出避免相互干擾的引物對和探針，所 以經(jīng)過長期摸索，本發(fā)明人摒棄了現(xiàn)有引物和探針的一些傳統(tǒng)做法，包括序列完全配對、GC 比等，采用了自主技術(shù)獨(dú)立地設(shè)計(jì)出了每種靶核酸的引物對與探針。在本發(fā)明的具體實(shí)施 方式中，每種靶核酸引物對與該靶核酸探針在所述單個PCR反應(yīng)管中的摩爾比為2?4 :1， 優(yōu)選是4 :1，能夠從Ct值上進(jìn)一步區(qū)分不同的靶核酸來源。
[0045] 通常，本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為越是昂貴、越是保真度高的DNA聚合酶，效果越是好。 但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在本發(fā)明的實(shí)時PCR方法中并非保真度取決定作用，甚至許多昂貴的 酶會降低靈敏度甚至更容易導(dǎo)致錯誤結(jié)果。因此優(yōu)選所述DNA聚合酶不是Hotstart Taq DNA聚合酶、Fast Taq DNA聚合酶或pfu酶，更優(yōu)選是B684 Taq DNA聚合酶。這樣本發(fā)明 不但檢測效果好，而且還能夠降低成本。
[0046] 在第二方面，本發(fā)明提供了用于本發(fā)明第一方面所述方法的檢測試劑盒，其包 括：
[0047] (1)磁珠提取法所需試劑，包括：
[0048] 核酸萃取液，包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩 沖液 Tris-HCl ;
[0049] 第一次洗滌所用的洗滌液，包含高氯酸鈉和乙醇；
[0050] 第二次洗滌所用的洗滌液，包含乙醇；
[0051] 洗脫所用的洗脫液，包含pH緩沖液Tris-HCl。
[0052] (2) PCR反應(yīng)所需試劑
[0053] 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和探針，其中所述探針 兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，而且各種探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)的熒光檢測波長互不相 同。
[0054] 在本發(fā)明的第二方面的試劑盒中，可以優(yōu)選本發(fā)明第一方面的各個優(yōu)選方面，只 要沒有矛盾即可。另外，不同的試劑可以分裝在不同容器中，也可以選擇幾種長期保存而不 發(fā)生化學(xué)反應(yīng)并且在本發(fā)明第一方面的方法中將混合使用的試劑合并保存在相同的容器 中。容器可以是瓶、盒、注射器等能容納上述試劑的容器，例如常規(guī)用于裝PCR、酶或核酸試 劑的容器。檢測試劑盒中還可以有標(biāo)簽或說明書，用以指示按照本發(fā)明第一方面所述方法 進(jìn)行操作。標(biāo)簽可以貼在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供獨(dú)立的說明 書。根據(jù)需要，如方便運(yùn)輸、存放的需要，試劑盒還可以進(jìn)一步包裝進(jìn)更大的包裝中，這樣的 產(chǎn)品也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
[0055] 在第三方面，本發(fā)明提供了本發(fā)明第二方面所述的檢測試劑盒在制備用于在單個 PCR反應(yīng)管中同時檢測四種靶核酸的實(shí)時熒光PCR方法的制品中的應(yīng)用，其中所述靶核酸 來自弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒。檢測試劑產(chǎn)品可以是檢測試劑盒本 身，也可以是合并裝有多個檢測試劑盒的更大包裝產(chǎn)品。優(yōu)選其中在單個PCR反應(yīng)管中同 時檢測四種靶核酸的實(shí)時熒光PCR方法是本發(fā)明第一方面所述的方法。
[0056] 在另外一個獨(dú)立的方面，本發(fā)明提供了引物和探針的混合物，其包括：
[0057] 引物對包括：
[0058] 弓形蟲：
[0059] TO-L ：CTGGTATGTACGCAATAG
[0060] TO-R ：GTCCTTGTATCATGTCAATA
[0061] 風(fēng)疹病毒：
[0062] RV-L ：GGTCAAGTTCCATACAGA
[0063] RV-R ：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
[0064] 巨細(xì)胞病毒：
[0065] HCMV-L ：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
[0066] HCMV-R ：CATGCAAACTTCTCATTTATTG
[0067] 單純皰疹病毒II型：
[0068] HSV-L ：GCATCTATACCTCTTTCTGA
[0069] HSV-R ：CGATCCGTTGATAAACATC
[0070] 靶核酸探針包括：
[0071] 弓形蟲：
[0072] TO-P ：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
[0073] 風(fēng)疹病毒：
[0074] RV-P ：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
[0075] 巨細(xì)胞病毒：
[0076] HCMV-P ：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
[0077] 單純皰疹病毒II型：
[0078] HSV-P :TGAAACAGACACGCCAACTGG。
[0079] 優(yōu)選在該混合物中，每種靶核酸引物對與該靶核酸探針的摩爾比為2?4 :1。
[0080] 本發(fā)明的有益效果在于：首次實(shí)現(xiàn)了單管同時檢測樣品中是否存在來自弓形蟲、 風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒的靶核酸，檢測準(zhǔn)確、可靠、靈敏，重復(fù)性佳，而且可 以使用目前市售的實(shí)時熒光PCR設(shè)備完成，也方便規(guī)?；瘧?yīng)用。
[0081] 為了便于理解，以下將通過具體的附圖、實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)地描述。需要特 別指出的是，這些描述僅僅是示例性的描述，并不構(gòu)成對本發(fā)明范圍的限制。依據(jù)本說明書 的論述，本發(fā)明的許多變化、改變對所屬領(lǐng)域技術(shù)人員來說都是顯而易見的。另外，本發(fā)明 引用了公開文獻(xiàn)，這些文獻(xiàn)是為了更清楚地描述本發(fā)明，它們的全文內(nèi)容均納入本文進(jìn)行 參考，就好像它們的全文已經(jīng)在本文中重復(fù)敘述過一樣。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0082] 圖1是本發(fā)明示例性的對弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒II型的 實(shí)時PCR擴(kuò)增曲線圖，圖中各種曲線都能夠清晰區(qū)分。

【具體實(shí)施方式】
[0083] 下面結(jié)合實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)、完整地說明。如未特別指明之處，可 根據(jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（第三版）（Cold Spring Harbor laboratory Press)、《細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南》（科學(xué)出版社，北京，中國，2001年）、《RNA實(shí)驗(yàn)技術(shù) 手冊》（科學(xué)出版社，北京，中國，2004年）、《免疫檢測技術(shù)》（科學(xué)出版社，北京，中 國，1991)等實(shí)驗(yàn)手冊所列方法來實(shí)施。其中，所用的探針、引物委托上海生工生物工程技 術(shù)服務(wù)有限公司合成。
[0084] 實(shí)施例1
[0085] 1、核酸提取
[0086] 按照衛(wèi)生部的病毒保存和研究規(guī)范，對弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹 病毒II型毒株進(jìn)行核酸提取。
[0087] 核酸的提取按照常規(guī)磁珠提取法進(jìn)行提取，方法如下：向10 μ 1標(biāo)準(zhǔn)樣本（假 病毒顆粒l*l〇4IU/ml)加入90μ 1核酸萃取液（配方及終濃度為：異硫氰酸胍1. 2Μ、 乙二胺四乙酸鈉（ΡΗ8. 0) 10mM、吐溫-202 % (W/W)、高氯酸鈉1. 0Μ、乙醇40 % (V/V)、 Tris-HCl (pH8. 0) 10mM)，于 42°C保溫 lOmin,然后加入 10 μ 1 MagDNA?磁珠懸浮液（50mg/ mL，購自北京艾比根生物技術(shù)有限公司），振蕩混合均勻后，套在磁架上施加磁場，棄去其中 液體，然后加入200 μ 1洗滌液A (配方及終濃度為：高氯酸鈉1M、乙醇30 % (V/V))，洗滌后 棄去洗滌液A，再加入200 μ 1洗滌液B (配方及終濃度為：乙醇70 % (V/V))，洗滌后棄去洗 滌液Β，最后加入洗脫液（配方及終濃度為：Tris-HCl (ρΗ8. 0) 10mM)，于42°C保溫10min，吸 出并保留液體，即為核酸提取液，為每種病毒的基因組總核酸。
[0088] 2、熒光PCR反應(yīng)體系確定
[0089] 通過我們摸索，確定PCR反應(yīng)體系中各個組分，尤其是探針和引物的組合濃度。 [0090] 2· 1引物及探針序列
[0091] 靶核酸引物對包括：
[0092] 弓形蟲（簡稱T0):
[0093] T0-L ：CTGGTATGTACGCAATAG
[0094] T0-R ：GTCCTTGTATCATGTCAATA
[0095] 風(fēng)疹病毒（簡稱RV):
[0096] RV-L ：GGTCAAGTTCCATACAGA
[0097] RV-R ：GGTGTAATTCATAATGTACTCA
[0098] 巨細(xì)胞病毒（簡稱HCMV):
[0099] HCMV-L ：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA
[0100] HCMV-R : CATGCAAACTTCTCATTTATTG
[0101] 單純皰疹病毒II型（簡稱HSV):
[0102] HSV-L : GCATCTATACCTCTTTCTGA
[0103] HSV-R ：CGATCCGTTGATAAACATC
[0104] 靶核酸探針包括：
[0105] 弓形蟲：
[0106] Τ0-Ρ :TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC
[0107] 風(fēng)疹病毒：
[0108] RV-P ：AGGACCGTCTGGCAACTCTC
[0109] 巨細(xì)胞病毒：
[0110] HCMV-P : CGGTCGCACGGATTATTCCTTC
[0111] 單純皰疹病毒II型：
[0112] HSV-P : TGAAACAGACACGCCAACTGG
[0113] 2. 2突光標(biāo)記
[0114] 在上述探針Τ0-Ρ、RV-P、HCMV-P、HSV-P的5'端分別委托合成標(biāo)記熒光標(biāo)記FAM、 TAMRA、ROX、CY5,并在3'端標(biāo)記相應(yīng)的淬滅基團(tuán)。
[0115] 2. 3引物和探針的組合濃度
[0116] (l)PCR反應(yīng)體系總體積為60μ1，其中各組分的濃度分別為：Tris.HCl pH8. 3 10mM ;KC150mM ;MgCl25mM ;dNTP0. 2mM ;Taq DNA 聚合酶 5U ;M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 150U ; RNasin20U ;各種引物16pmol/種；各種突光探針4pmol/種；甘油5% (v/v);各種祀核酸提 取液。其中各種把核苷酸提取液濃度為l〇〇〇IU/mL，用量為40ul。
[0117] 2. 4反轉(zhuǎn)錄和PCR條件
[0118] 42°C 30 分鐘 50°C 2 分鐘 94°C 3 分鐘
[0119] (94°C 10 秒 52°C 10 秒 65°C 45 秒）45 個循環(huán)
[0120] 2. 5試驗(yàn)結(jié)果
[0121] 熒光采集FAM、TAMRA、R0X、Cy5。結(jié)果分析條件仍舊遵從嚴(yán)格設(shè)定，S卩：以ABI7500 熒光儀的基線自動設(shè)定，熒光閾值設(shè)定在（dR= 1000)，以Ct值45為分界，其中，
[0122] 1)FAM層Ct值>45,則判定為TO陰性；
[0123] FAM層Ct值彡45,則判定為T0陽性。
[0124] 2) TAMRA層Ct值>45,則判定為RV陰性；
[0125] TAMRA層Ct值彡45,則判定為RV陽性。
[0126] 3) R0X層Ct值>45,則判定為HCMV陰性；
[0127] R0X層Ct值彡45,則判定為HCMV陽性。
[0128] 4) Cy5層Ct值>45,則判定為HSV陰性；
[0129] Cy5層Ct值彡45,則判定為HSV陽性。
[0130] 3.熒光定量PCR條件的摸索
[0131] 由于引物和探針的設(shè)計(jì)已經(jīng)達(dá)到極限，其他試劑如無優(yōu)化，將干擾以上結(jié)果分析 條件設(shè)定的有效性，甚至?xí)?dǎo)致無法完成PCR。
[0132] 3.1Taq酶的選定
[0133] 現(xiàn)有Taq DNA聚合酶的種類非常多，包括價格較貴的Hotstart Taq酶、Fast Taq 酶和pfu等高保真Taq酶，但是使用這些酶的效果一般，有的甚至無法完成樣品的同時擴(kuò) 增，如采用Hotstart Taq酶，將使得TO、RV和HSV的Ct值在104IU/ml的濃度下較之優(yōu)選 的酶上升2-5 ;而采用Fast Taq酶，將使得RV和HCMV的Ct值在104IU/ml的濃度下較之優(yōu) 選的酶上升7-12,非常接近45的判斷界限，在樣本中病毒濃度低的時候，會非常容易出現(xiàn) 假陰性結(jié)果。經(jīng)過我們多年研究，終于發(fā)現(xiàn)B684Taq DNA聚合酶（可購自上海西唐生物科 技有限公司或上海浩源生物科技有限公司）效果最好，配合如下優(yōu)化條件，能夠使得同時 擴(kuò)增能夠完成，相互的擴(kuò)增曲線形態(tài)能夠清晰地區(qū)分，而且消除了假陽性結(jié)果。
[0134] 3. 2探針和引物比例的優(yōu)化
[0135] 在四種病毒（各104IU/ml)的熒光PCR體系中進(jìn)行多次擴(kuò)增（使用B684 Taq DNA聚合酶），當(dāng)引物探針比例為3 :1時，TO、RV、HCMV和HSV的Ct值的多次結(jié)果分別為 29. 18-31. 78、28· 25-30. 86、24· 33-25. 63 和 25. 84-28. 57 ;當(dāng)引物探針比例為 2 :1 時，T0、 RV、HCMV 和 HSV 的 Ct 值的多次結(jié)果分別為 3L 22-33. 55、32· 06-33. 95、25· 83-26. 25 和 28. 98-29. 67 ;當(dāng)引物探針比例為4 :1時，TO、RV、HCMV和HSV的Ct值的多次結(jié)果分別為 32. 02-34. 68、29. 77-31. 53、24. 83-26. 29 和 27. 98-30. 31。所以在擴(kuò)增體系中，各種引物的 濃度為16pmol/種；各種熒光探針的濃度為4pmol/種。
[0136] 實(shí)施例2
[0137] 以弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒II型，沙眼衣原體、淋病奈瑟菌、 生殖支原體、人形支原體、解脲支原體、人乳頭瘤病毒等樣品的總核酸為模板，采用本實(shí)驗(yàn) 設(shè)計(jì)的引物和探針進(jìn)行實(shí)時熒光PCR反應(yīng)，結(jié)果只有弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純 皰疫病毒Π 產(chǎn)生突光信號，擴(kuò)增情況參見表1，各種病毒單管同時的PCR擴(kuò)增曲線不例參見 附圖1。這表明本方法對于弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒、單純皰疹病毒II的檢測具有特 異性。
[0138] 表1單管檢測四種優(yōu)生優(yōu)育檢查中病原體方法特異性熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0139]

【權(quán)利要求】
1. 在單個PCR反應(yīng)管中同時檢測樣品中四種靶核酸的實(shí)時熒光PCR方法，所述靶核酸 來自弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒，所述方法包括： (1) 提取樣品中的核酸，獲得病毒總核酸提取液； (2) 在所述單個PCR反應(yīng)管中混合核酸提取液、反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、 dNTP、靶核酸引物對和探針，其中所述探針標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，而且各種探針標(biāo)記 的熒光基團(tuán)的熒光檢測波長互不相同，這些靶核酸引物對和探針是： TO-L ：CTGGTATGTACGCAATAG TO-R ：GTCCTTGTATCATGTCAATA RV-L ：GGTCAAGTTCCATACAGA RV-R ：GGTGTAATTCATAATGTACTCA HCMV-L ：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA HCMV-R ：CATGCAAACTTCTCATTTATTG HSV-L ：GCATCTATACCTCTTTCTGA HSV-R ：CGATCCGTTGATAAACATC TO-P ：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC RV-P ：AGGACCGTCTGGCAACTCTC HCMV-P ：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC HSV-P ：TGAAACAGACACGCCAACTGG (3) 進(jìn)行PCR反應(yīng)，并實(shí)時檢測不同波長的熒光信號； (4) 判斷是否有靶核酸存在于樣品中。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，提取樣品中的核酸系采用磁珠提取法提 取，其特征在于步驟如下：向樣品加入核酸萃取液，保溫后加入磁珠，混合均勻，施加磁場 后，棄去其中液體，然后兩次洗滌，第一次洗滌使用包含高氯酸鈉和乙醇的洗滌液，第二次 洗滌使用包含乙醇的洗滌液，最后采用包含pH緩沖液Tris-HCl洗脫。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于：所述核酸萃取液包含異硫氰酸胍、乙二胺 四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液Tris-HCl。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：每種靶核酸引物對與該靶核酸探針在所 述單個PCR反應(yīng)管中的摩爾比為2?4 :1。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：各種探針標(biāo)記有不同的熒光基團(tuán)，優(yōu)選熒 光基團(tuán)是 FAM，TAMRA，ROX，Cy5。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：所述DNA聚合酶不是Hotstart Taq DNA 聚合酶、Fast Taq DNA聚合酶或pfu酶，優(yōu)選是B684Taq DNA聚合酶。
7. 用于權(quán)利要求1?6之任一所述的方法的檢測試劑盒，其包括： (1)磁珠提取法所需試劑，包括： 核酸萃取液，包含異硫氰酸胍、乙二胺四乙酸鈉、吐溫-20、高氯酸鈉、乙醇和pH緩沖液 Tris-HCl ； 第一次洗滌所用的洗滌液，包含高氯酸鈉和乙醇； 第二次洗滌所用的洗滌液，包含乙醇； 洗脫所用的洗脫液，包含pH緩沖液Tris-HCl。 (2)PCR反應(yīng)所需試劑 反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、DNA聚合酶、dNTP、靶核酸引物對和探針，其中所述探針兩端 標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，而且各種探針標(biāo)記的熒光基團(tuán)的熒光檢測波長互不相同。
8. 權(quán)利要求7所述的試劑盒在制備用于在單個PCR反應(yīng)管中同時檢測四種靶核酸的實(shí) 時熒光PCR方法（優(yōu)選是權(quán)利要求1?6之任一所述的方法）的制品中的應(yīng)用，其中所述 靶核酸來自弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒和單純皰疹病毒。
9. 引物和探針的混合物，其包括： TO-L ：CTGGTATGTACGCAATAG TO-R ：GTCCTTGTATCATGTCAATA RV-L ：GGTCAAGTTCCATACAGA RV-R ：GGTGTAATTCATAATGTACTCA HCMV-L ：CCTAGTATATTTGCCTCCTTA HCMV-R ：CATGCAAACTTCTCATTTATTG HSV-L ：GCATCTATACCTCTTTCTGA HSV-R ：CGATCCGTTGATAAACATC TO-P ：TTCGTCTGCCACTGTCATAAGC RV-P ：AGGACCGTCTGGCAACTCTC HCMV-P ：CGGTCGCACGGATTATTCCTTC HSV-P :TGAAACAGACACGCCAACTGG。
10. 權(quán)利要求9所述的混合物，其中每種靶核酸弓丨物對與該靶核酸探針的摩爾比為2? 4 ： 1 〇
【文檔編號】C12Q1/04GK104120195SQ201410392049
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2014年8月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月11日
【發(fā)明者】齊潔婷, 劉勁林, 陳紅干, 張必新, 王川, 陳悅科, 郭志武 申請人:蘇州華益美生物科技有限公司