一種用于檢測vkh綜合征的試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種用于檢測VKH綜合征的試劑盒，該試劑盒包含用于擴(kuò)增位點rs78377598、rs77258390、rs78597810、rs12568393、rs12561798、rs76436269、rs3021304、rs442309和rs224058的基因片段的試劑的引物對，以及特異性檢測個體基因型的Sequenom?MassARRAY單堿基延伸引物。該試劑盒通過檢測受試者所述的SNP位點是否有變異，預(yù)測受試者對VKH綜合征的遺傳易感性，可用于早期篩查漢族人群VKH綜合征的發(fā)生，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。
【專利說明】—種用于檢測VKH綜合征的試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，特別涉及一種用于檢測VKH綜合征的試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]Vogt一Koyanagi一Harada (VKH)綜合征又名伏格特-小柳-原田綜合征,是一種累及全身多系統(tǒng)的炎癥性疾病。該綜合征的其特征為:①突發(fā)性色素膜炎；②眉毛及毛發(fā)變白、禿發(fā)及白癜風(fēng)等皮膚損害；③頭痛、頭暈、惡心等神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)；④耳鳴、耳聾及眩暈等內(nèi)耳癥狀。
[0003]VKH綜合征以急性發(fā)作開始，病程遷延反復(fù)。分兩個臨床類型，即以滲出性虹膜睫狀體炎為主的Vogt-小柳型(VK型)和滲出性脈絡(luò)膜炎為主的原田型(H型)。VKH綜合征多發(fā)生于有色人種，中國、日本、巴西及美國印第安人為高危人群，并且其好發(fā)于青壯年，以20-40歲為多，男女無明顯差別。雙眼同時受累是VKH綜合征的重要臨床表現(xiàn)，據(jù)統(tǒng)計約占患者總數(shù)的94% _100*%，雙眼先后受累者間隔多小于10天。
[0004]VKH綜合征是我國葡萄膜炎中常見的一種類型，約占所有葡萄膜炎患者的14%。其確切病因目前尚不清楚，所致的葡萄膜炎具有發(fā)作頻繁、受累組織廣泛，病程長及并發(fā)癥多等特點。VKH綜合征如未得到及時有效的治療，可引起許多并發(fā)癥，如帶狀角膜變性、角膜水腫、并發(fā)性白內(nèi)障、繼發(fā)性青光眼、黃斑部及視盤水腫、黃斑表面褶紋樣改變以及視網(wǎng)膜脫離等，造成嚴(yán)重后果。預(yù)后與炎癥的控制程度相關(guān)，反復(fù)多次的炎癥可致眼部病情遷延及并發(fā)癥，使眼組織的進(jìn)一步破壞和視力的逐漸下降，最后嚴(yán)重影響患者視功能，降低患者的勞動力，并對其生理、心理造成不同程度的妨礙。
[0005]VKH綜合征是一種多因素復(fù)雜疾病，現(xiàn)被普遍認(rèn)為是一種免疫遺傳基因病，在遺傳和環(huán)境等因素共同作用下，由T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)以黑色素相關(guān)抗原、視網(wǎng)膜S抗原或光感受器維生素A類結(jié)合蛋白為靶點，引起眼部抗原-抗體反應(yīng)而表現(xiàn)出免疫源性葡萄膜炎。虹膜睫狀體的病理改變在本質(zhì)上與脈絡(luò)膜改變相同，系由上皮樣細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞等構(gòu)成的病灶，有時可見有淋巴細(xì)胞的有絲分裂征象，但在虹膜內(nèi)上皮樣細(xì)胞形成不及脈絡(luò)膜內(nèi)明顯。既往流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)VKH綜合征有明顯的家族聚集傾向，呈現(xiàn)地域性聚集，特定種群發(fā)病率高等現(xiàn)象，這些現(xiàn)象揭示了遺傳因素在其致病機(jī)理中發(fā)揮重要作用。VKH綜合征屬于多基因遺傳復(fù)雜疾病，并不遵循經(jīng)典孟德爾遺傳定律，在這類遺傳病中，每個基因?qū)Ρ硇偷呢暙I(xiàn)相差不大，其遺傳性狀表達(dá)受多對等效、微效和累加的多基因控制，環(huán)境因素在其中所起的作用也不可忽視。
[0006]近年來，遺傳學(xué)理論、研究手段和認(rèn)識水平的不斷進(jìn)步和發(fā)展給疾病遺傳學(xué)研究帶來了新的思路和突破。應(yīng)用候選基因篩查、連鎖分析等技術(shù)進(jìn)行VKH綜合征的基因定位和候選基因的克隆篩查工作，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了多個VKH綜合征的候選基因位點。在日本人群中，HLA-DR4/DR53與VKH綜合征有強(qiáng)相關(guān)性早被證實，隨后在中國，北美，西班牙人群中，此遺傳區(qū)域與VKH綜合征的易感性得到進(jìn)一步驗證。其他候選基因包括TRAF5 (rsl 14065494)、JAKl(rs4916004)、PTPN22(rs974404)、CTLA4(rsl87762111)、STAT4(rs34946552)、0PN(rsl42608941)、TNIPl (rs2287721)、TNFAIP3 (rs3799491)、MIF (rs2012133)等。目前，對VKH綜合征遺傳易感性研究成果多集中于人類白細(xì)胞抗原(HLA-DR4/DR53，HLA-DRl,HLADRBI * 0405等)與此病的相關(guān)性，非HLA抗原與此病的相關(guān)性報道并不多見，而且大部分報道結(jié)果很難在其他人群中重復(fù)。
[0007]未來針對VKH綜合征治療的發(fā)展趨勢是切實有效、療效持久、降低復(fù)發(fā)的綜合治療手段，以長久地保存患者有用的視功能，提高患者的生活質(zhì)量。為此，需要尋求更加有效和精準(zhǔn)的遺傳標(biāo)記物和檢測方法，以利于早期篩查VKH綜合征高危人群，并實施早期的檢測和預(yù)防，減少其視力損害。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測VKH綜合征的試劑盒，該試劑盒通過檢測位于染色體區(qū)域 1ρ31.2 的 SNP 位點 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269，[以及位于1ρ31.2且與上述位點連鎖遺傳的rsll7633859、rsl2564219、 rsl2563505、 rs3401735 2、 rsll4661385、 rsll7301158、 rsll500927Urs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985];位于染色體區(qū)域6p21.3的SNP位點rs3021304[以及連鎖遺傳位點rsl 14800139];和位于染色體區(qū)域10q21.3的SNP位點rs442309和rs224058[以及位于10q21.3且與上述位點連鎖遺傳的rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]的變異，用于早期篩查漢族人群VKH綜合征，為臨床診斷和治療提供依據(jù)。
[0009]本發(fā)明的技術(shù)方案是:
[0010]用于檢測VKH綜合癥的試劑盒，包含用于擴(kuò)增位點rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 的基因片段的試劑的引物對，以及特異性檢測個體基因型的Sequenom MassARRAY單堿基延伸引物。
[0011]所述基因片段的試劑的引物rs78377598基因片段的試劑的PCR引物對序列如SEQID N0.1~2所示；rs77258390基因片段的的PCR引物對序列如SEQ IDN0.3~4所示；rs78597810基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.5~6所示；rsl2568393基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.7~8所示；rsl2561798基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.9~10所示；rs76436269基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.11~12所示；rs3021304基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.13~14所示；rs442309基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.15~16所示；rs224058基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.17~18所示。
[0012]所述特異性檢測個體基因型的Sequenom MassARRAY單堿基延伸引物的序列如SEQID N0.19 ~27 所示。
[0013]所述試劑盒還包括Taq酶，SAP，SAP Buffer,無酶水，以及位點rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和rs224058的標(biāo)準(zhǔn)DNA樣本。
[0014]本發(fā)明的試劑盒中含有特異性擴(kuò)增目的片段的PCR引物對、特異性檢測個體基因型的Sequenom MassARRAY單喊基延伸引物，以及用于PCR擴(kuò)增和進(jìn)行Sequenom MassARRAY分型檢測試劑盒的常規(guī)組件、試劑、操作步驟等。
[0015] 申請人:在研究中發(fā)現(xiàn)，在漢族人中當(dāng)位點rs78377598C — T變異、rs77258390G — A 變異、rs78597810T — C 變異、rsl2568393G — A 變異、rsl2561798T — C變異、rs76436269G — A變異、[以及連鎖遺傳位點rsll7633859A — G變異、rsl2564219G — A 變異、rsl2563505C — T 變異、rs34017352A — C 變異、rsll4661385G — A變異、rsll7301158T — A 變異、rsll5009271C — A 變異、rs76091599C — G 變異、rs78865162C — T 變異、rs78917656T — G 變異、rs6693659C — A 變異、rsl2566159C — T 變異、rsll7282985G — C 變異]、rs3021304C — G 變異[連鎖遺傳位點 rsll4800139G — A 變異]、rs442309C — T變異和/或rs224058G — A變異[以及連鎖遺傳位點rs224048G — A變異、rs224052G — T 變異、rs224057C — T 變異、rsl0995307T — C 變異、rsl0995281T — C變異、rs7088592A — G 變異、rs224071G — A 變異、rs224031T — G 變異、rs224032G — A 變異、rs224033C — G變異]，即上述33個位點之一發(fā)生變異，均不同程度地增加了 VKH綜合征的患病風(fēng)險。
[0016]本發(fā)明的測定方法用于測定來源于人的基因組DNA，臨床取材樣本來源廣泛，如體液(如血液、腹水和房水)、組織細(xì)胞(如皮膚組織、虹膜組織)等，通過提取和純化這些樣本均可制備基因組DNA。
[0017]本發(fā)明首次公開了上述多態(tài)性位點與VKH綜合征的相關(guān)性，提供了一種預(yù)測VKH綜合征易感性的試劑盒，該試劑盒可用于I)此疾病的輔助診斷:通過所述試劑盒明確受試者的這33個位點的基因型，預(yù)測受試者對VKH綜合征的易感性。2)指導(dǎo)個體化治療，新藥開發(fā):在臨床實踐和科研中，rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269, [rsll7633859、 rsl2564219、 rsl2563505、 rs34017352、 rsll4661385、rsll7301158、rsll500927U rs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985] ；rs3021304[rsll4800139] ；rs442309 和 rs224058[rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]可用作藥物設(shè)計的分子靶標(biāo)的篩選，以幫助尋找具有調(diào)節(jié)這些基因表達(dá)的活性分子，促進(jìn)新藥開發(fā)。3)為判斷預(yù)后提供分子生物學(xué)依據(jù)。攜帶有上述位點危險等位基因的病人可能在一定程度上預(yù)后差于其他未攜帶有危險等位基因的病人。
[0018]本發(fā)明所述試劑盒可對VKH綜合征高危的人群進(jìn)行早期的篩查、正確診斷、及時有效治療，對可能發(fā)生的嚴(yán)重并發(fā)癥盡早發(fā)現(xiàn)以及預(yù)防病變發(fā)展。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0019]圖1-3是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs78377598位點的基因分型圖譜；
[0020]圖4-6是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs77258390位點的基因分型圖譜；
[0021]圖7-9是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs78597810位點的基因分型圖譜；
[0022]圖10-12是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rsl2568393位點的基因分型圖
-1'Tfe1曰；
[0023]圖13-15是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rsl2561798位點的基因分型圖
-1'Tfe1曰；
[0024]圖16-18是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs76436269位點的基因分型圖
-1'Tfe1曰；
[0025]圖19-21是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs3021304位點的基因分型圖譜；
[0026]圖22-24是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs442309位點的基因分型圖譜；
[0027]圖25-27是Sequenom MassARRAY SNP技術(shù)檢測rs224058位點的基因分型圖譜。
【具體實施方式】
[0028]本發(fā)明所用試劑均為市售產(chǎn)品，其中。乙二胺四乙酸二鈉(EDTA)作為抗凝劑，QIAGEN QIAamp DNA Mini Blood Kit (購自德國QIAGEN公司)為市售的快速高效抽提基因組DNA的試劑盒。
[0029]實施例1樣本收集和基因組DNA的提取
[0030]樣本來自于重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，共收集VKH患者1559例，其中男性占55.0%,女性占45.0 % ;正常對照者5640例，其中男性占50.8 %，女性占49.2 %。所有受試者均為漢族，且自愿簽署知情同意書，這一研究也得到了倫理委員會批準(zhǔn)。
[0031]根據(jù)QIAGEN QIAamp DNA Mini Blood Kit 試劑盒(購自德國 QIAGEN 公司)說明書提供的操作步驟，制備人外周血基因組DNA。
[0032]實施例2 包括 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269, [rsl17633859、 rsl2564219、 rsl2563505、 rs34017352、 rsll4661385、rsll7301158、rsll500927U rs76091599、rs78865162、rs78917656、rs6693659、rsl2566159、rsll7282985] ；rs3021304[rsll4800139] ；rs442309 和 rs224058[rs224048、rs224052、rs224057、rsl0995307、rsl0995281、rs7088592、rs224071、rs224031、rs224032、rs224033]單核苷酸多態(tài)性DNA片段的PCR擴(kuò)增和基因型分析
[0033]本發(fā)明采用Sequenom MassARRAY SNP 檢測技術(shù)對位點 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 變異進(jìn)行檢測(如下所示)。
[0034]I)用 SEQ ID N0.1 ~2、SEQ ID N0.3 ~4、SEQ ID N0.5 ~6、SEQ ID N0.7 ~8、SEQ ID N0.9 ~10、SEQ ID N0.11 ~12、SEQ ID N0.13 ~14、SEQ ID N0.15 ~16、SEQ IDN0.17~18所示的引物進(jìn)行包含特異位點的目的基因片段；
[0035]PCR 擴(kuò)增:94°C 4min ；94°C 20s, 56V 30s, 72V lmin,共 45 個循環(huán)；72°C 5min ；4°C保持。每個反應(yīng)體積為5ul，包括2ul Taq酶，1.5ul無酶水，PCR上游和下游引物各0.25ul，Iul DNA樣本溶液(濃度為50ng/ul)。
[0036]2) PCR產(chǎn)物堿性磷酸化處理；
[0037]①在PCR 結(jié)束后,將 PCR 產(chǎn)物用 SAP (shrimp alkaline phosphatase,奸喊性憐酸酶)處理，以去除體系中游離的dNTPs。
[0038]②配制堿性磷酸酶處理反應(yīng)液，SAP Mix。每個反應(yīng)體積為2ul，其中包括1.53ul無酶水，0.17ul SAP Buffer,0.3ul SAP Enzyme。
[0039]③反應(yīng)條件:37°C 40min, 85°C 5min, 4°C保持，啟動PCR儀進(jìn)行堿性磷酸酶處理。
[0040]3)用特異的單堿基延伸引物包括 SEQ ID N0.28、SEQ ID N0.29、SEQ ID N0.30、SEQ ID N0.3KSEQ ID N0.32,SEQ ID N0.33,SEQ ID N0.34,SEQ ID N0.35,SEQ ID N0.36進(jìn)行單喊基延伸；
[0041]將2ul單堿基延伸反應(yīng)液加入上述每個反應(yīng)體系中，按照以下PCR反應(yīng)條件進(jìn)行反應(yīng):
[0042]1.94°C for 30s, I1.94°C for 5s, II1.52°C for 5s, IV.80°C for 5s, V.go toIII, 4more times, V1.go to II, 39more times, VI1.72°C for 3min, VDI.4。。保持。
[0043]4)樹脂純化，芯片點樣，質(zhì)譜分析，檢測結(jié)果用TYPER 4.0軟件(sequenom)分型并輸出結(jié)果(見圖1-27)。
[0044]采用如下PCR引物對A-1以及單堿基延伸引物a-1根據(jù)上述方法進(jìn)行分型。
[0045]PCR 引物對 A(rs78377598)(如 SEQ ID N0.1 ~2 所示):
[0046]F: 5，ACGTTGGATGGAGACATTTATCAGTGCAGG 3，
[0047]R:5’ ACGTTGGATGCTCCAAGAAGAAGGGTATAG 3’
[0048]PCR 引物對 B(rs77258390)(如 SEQ ID N0.3 ~4 所示):
[0049]F: 5，ACGTTGGATGAAGAGGCAAAATGTCATCCC 3，
[0050]R:5’ AC GTTGGATGGAAAAATACAGCTGTGTGTG 3’
[0051]PCR 引物對 C(rs78597810)(如 SEQ ID N0.5 ~6 所示):
[0052]F: 5 ’ ACGTTGGATGATGACTGACTTGAAAACAGC 3，
[0053]R:5’ ACGTTGGATGGGAATGATGAACAACCCCTG 3’
[0054]PCR 引物對 D (rsl2568393)(如 SEQ ID N0.7 ~8 所示):
[0055]F: 5 ’ ACGTTGGATGGTTGATAGTGGTGATTTGTC 3，
[0056]R:5， ACGTTGGATGGAACTGAATTCTTAAGAAGC 3’
[0057]PCR 引物對 E(rsl2561798)(如 SEQ ID N0.9 ~10 所示):
[0058]F: 5 ’ ACGTTGGATGGTTGATAGTGGTGATTTGTC 3，
[0059]R:5，ACGTTGGATGGAACTGAATTCTTAAGAAGC 3’
[0060]PCR 引物對 F(rs76436269)(如 SEQ ID N0.11 ~12 所示):
[0061]F: 5 ’ ACGTTGGATGCAGATTACAACTAGCCAAGG 3，
[0062]R:5， ACGTTGGATGGAGGACAATAAAAGCTCCAC 3，
[0063]PCR 引物對 G(rs3021304)(如 SEQ ID N0.13 ~14 所示):
[0064]F: 5，ACGTTGGATGCCTAGTCTCACTGTCACCTC 3，
[0065]R:5’ ACGTTGGATGTTGGTAAGGCAAGTGTCATA 3’
[0066]PCR 引物對 H(rs442309)(如 SEQ ID N0.15 ~16 所示):
[0067]F: 5 ’ ACGTTGGATGTCTCTGTGAAGTGAAGGGAC 3，
[0068]R:5， ACGTTGGATGGTTCTGTTCTTTGCAGACCG 3，
[0069]PCR 引物對 I (rs224058)(如 SEQ ID N0.17 ~18 所示):
[0070]F: 5 ’ ACGTTGGATGTAGGCACGTGATAGTGATTC 3，
[0071]R: 5，ACGTTGGATGTGGGTAGTCTAAATCCCAGG 3’
[0072]所得到的擴(kuò)增序列如下(其中序列中的方框中表示堿基發(fā)生變異)
[0073]序列28(rs78377598):l26bp
[0074](方框處為SNP)
[0075]AaaccaagatGTTCAACATGTCCAGACAAGtaaatctaagactagagacatttatcagtgcaggatacctccc C/T tatcttcacgattatctgctaaCAGCTATACCCTTCTTCTTGgAgaaAttGc
[0076]序列29(rs77258390):96bp
[0077](方框處為SNP)
[0078]AgGacattTtAAGAGGCAAAATGTCATCCCattatacacacacacatac A/G cacatgcacgcacat
gCACACACAGCTGTATTTTTCtATatAcaGT
[0079]序列30(rs78597810):114bp
[0080](方框處為SNP)
[0081 ] taaTctaAaaATGACTGACTTGAAAACAGCttgtatttaatttaaaatgatggggaatttcacaa C/T
attggttacattttaagtCAGGGGTTGTTCATCATTCCaAgaatgtac
[0082]序列31(rsl2568393):112bp
[0083](方框處為SNP)
[0084]CtGgaatcTaGTTGATAGTGGTGATTTGTCtaagattgtt A/G taataccttcagctcaaaaatttgt
acagaggtgaaaattaGCTTCTTAAGAATTCAGTTCagaaacgtta
[0085]序列32(rsl2561798):112bp
[0086](方框處為SNP)
[0087]ctGgaatcTaGTTGATAGTGGTGATTTGTCtaagattgttgtaataccttcagctcaaaaatttg C/T
acagaggtgaaaattaGCTTCTTAAGAATTCAGTTCagaaacgtta
[0088]序列33(ι^76436269):101bp
[0089](方框處為SNP)
[0090]GgaaaGGtTaCAGATTACAACTAGCCAAGGaaagaagttcacagggca A/G agtcagtcccgaaataa
caaatGTGGAGCTTTTATTGTCCTCttcCtgtgGa
[0091]序列34(rsll7633859):119bp
[0092](方框處為SNP)
[0093]ggagTGagccATCGTGCCAGGCCATAAATGggatttttgatgaaccattact A/G ttttttttttaaa
cattggataaaatttatatgtaaAATTTTACTTGATTTCTTTCagatttggtT
[0094]序列35Crs3O2I3O4):88bp
[0095](方框處為SNP)
[0096]AaaccaGtacCCTAGTCTCACTGTCACCTCcccagccttgatgctcctccT C/G tacctaTATGACAC
TTGCCTTACCAACAgatgAttT
[0097]序列36(rs442309):98bp
[0098](方框處為SNP)
[0099]ttGgTcagcaTCTCTGTGAAGTGAAGGGACtaccca,C/T gcacacatggcctctctgccctagaagagccCGGTCTGCAAAGAACAGAACttgaCAtaaa
[0100]序列37(rs224058):106bp
[0101](方框處為SNP)
[0102]tgGgatGtaGTAGGCACGTGATAGTGATTCaaagattagtctccaaagttaaattctgctgttc C/T g
taaaagtggcCCTGGGATTTAGACTACCCAtgatCcttGT
[0103]延伸引物a(rs78377598)(如 SEQ ID N0.19 所示):
[0104]5， cccTGCAGGATACCTCCC 3，
[0105]延伸引物b(rs77258390)(如 SEQ ID N0.20 所示):
[0106]5’ CCATTATACACACACACATAC 3’
[0107]延伸引物c(rs78597810)(如 SEQ ID N0.21 所示):
[0108]5’ TGATGGGGAATTTCACAA 3’
[0109]延伸引物d(rsl2568393)(如 SEQ ID N0.22 所示):
[0110]5’ AGTGGTGATTTGTCTAAGATTGTT 3’
[0111]延伸引物e(rsl2561798)(如 SEQ ID N0.23 所示):
[0112]5 ’ AGCTAATTTTCACCTCTGT 3，
[0113]延伸引物f (rs76436269)(如 SEQ ID N0.24 所示):
[0114]5， aaacGAAGTTCACAGGGCA 3，
[0115]延伸引物h(rs3021304)(如 SEQ ID N0.25 所示):
[0116]5 ’ ACTTGATGCTCCTCCT 3，
[0117]延伸引物i (rs442309)(如 SEQ ID N0.26 所示):
[0118]5’ gaatTGAAGGGACTACCCA 3’
[0119]延伸引物j (rs224058)(如 SEQ ID N0.27 所示):
[0120]5’ CCCAGGGCCACTTTTAC 3’
[0121]統(tǒng)計方法:利用SPSS 13.0軟件進(jìn)行分析，檢測Hardy-Weinberg平衡，數(shù)量變量采用t檢驗，質(zhì)量變量采用卡方檢驗。雙側(cè)P〈0.05認(rèn)為有統(tǒng)計學(xué)意義的差異。結(jié)果如下(圖1-27為SNP基因分型結(jié)果圖):
[0122]SNP位點多態(tài)性與VKH綜合征密切相關(guān)
[0123]
【權(quán)利要求】
1.一種用于檢測VKH綜合征的試劑盒，其特征在于:該試劑盒包含用于擴(kuò)增位點rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309和rs224058的基因片段的試劑的引物對，以及特異性檢測個體基因型的Sequenom MassARRAY單喊基延伸引物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于:所述基因片段的試劑的引物 rs78377598基因片段的試劑的PCR引物對序列如SEQ ID N0.1~2所示； rs77258390基因片段的PCR引物對序列如SEQ ID N0.3~4所示； rs78597810基因片段的PCR引物對序列如SEQ ID N0.5~6所示； rsl2568393基因片段的PCR引物對序列如SEQ ID N0.7~8所示； rsl2561798基因片段的PCR引物對序列如SEQ ID N0.9~10所示； rs76436269基因片段的PCR引物對序列如SEQ ID N0.11~12所示； rs3021304基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.13~14所示； rs442309基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.15~16所示； rs224058基因片段的的PCR引物對序列如SEQ ID N0.17~18所示。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于:所述特異性檢測個體基因型的Sequenom MassARRAY單喊基延伸引物的序列如SEQ ID N0.19~27所不。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所示的試劑盒，其特征在于:所述試劑盒還包括Taq酶，SAP,SAPBuffer,無酶水，以及位點 rs78377598、rs77258390、rs78597810、rsl2568393、rsl2561798、rs76436269、rs3021304、rs442309 和 rs224058 的標(biāo)準(zhǔn) DNA 樣本。
【文檔編號】C12Q1/68GK104164505SQ201410388922
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年8月8日 優(yōu)先權(quán)日:2014年8月8日
【發(fā)明者】楊培增, 楊正林, 侯勝平, 杜利平, 雷博 申請人:重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院