集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構(gòu)建、回收方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構(gòu)建、回收方法。所公開的芯片由樣品流動(dòng)層和氣動(dòng)控制層組成，樣品流動(dòng)層設(shè)有入口、微腔、出口和微管道網(wǎng)絡(luò)，氣動(dòng)控制層設(shè)有進(jìn)氣入口、氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)。氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接。氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的高度大于末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)的高度。本發(fā)明可以在單個(gè)微流控芯片內(nèi)連續(xù)完成腫瘤細(xì)胞的精確定位捕獲、三維腫瘤形成與在線分析及其回收操作。該操作具有極強(qiáng)的時(shí)間與空間控制性及靈活性，便于多學(xué)科研究學(xué)者掌握；同時(shí)具有操作簡單快捷、樣品低消耗、細(xì)胞定位精確與高效高通量等特點(diǎn)，適用于多種三維腫瘤構(gòu)建與分析操作。
【專利說明】集成微流控芯片及其用于三維腫瘤定位、構(gòu)建、回收方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及微流控芯片【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種集成微流控芯片及其用于實(shí)時(shí)控制性的高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤組織構(gòu)建與回收。
【背景技術(shù)】
[0002]癌癥是由于細(xì)胞的分裂失控和異常生長而引起的疾病，常伴隨著惡性腫瘤的形成，進(jìn)而導(dǎo)致人類和動(dòng)物疾病并最終造成死亡。廣泛開展腫瘤研究是探索癌癥作用機(jī)理與推動(dòng)臨床治療進(jìn)展的源動(dòng)力。目前，常規(guī)的動(dòng)物體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究方法能夠高度還原特定腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程，但在動(dòng)態(tài)檢測，微環(huán)境控制以及腫瘤組織實(shí)時(shí)操作分析方面缺乏足夠的優(yōu)勢。相比較，常規(guī)體外腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)法在很多方面能夠彌補(bǔ)這些欠缺，如腫瘤細(xì)胞直接操作、細(xì)胞監(jiān)測分析等。體外細(xì)胞培養(yǎng)主要包括二維培養(yǎng)和三維培養(yǎng)。其中三維腫瘤培養(yǎng)因具有更好的體內(nèi)腫瘤生物學(xué)特性仿生能力，近年來受到國內(nèi)外研究人員的認(rèn)可和關(guān)注。迄今為止，體外制備三維腫瘤組織的方法眾多，包括懸滴法，瓊脂糖表面培養(yǎng)法和旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法等。這些方法對于體外腫瘤仿生研究具有較強(qiáng)的推動(dòng)作用，但由于這些細(xì)胞操作方法仍處于宏觀界面操作水平，很難完成微觀尺度下的一些操作。同時(shí)，其制備方法操作較為繁瑣、且需要較多的人力，所制備的三維腫瘤均一度較低。這在很大程度上限制了基于三維腫瘤的后期試驗(yàn)的研究進(jìn)度及其研究結(jié)果的精準(zhǔn)性。因此，大力開發(fā)、開展微觀界面條件下的腫瘤細(xì)胞操作與三維腫瘤仿生構(gòu)建，對于更有效地進(jìn)行腫瘤研究、早日突破腫瘤治療難題是具有重大科學(xué)意義和社會(huì)意義的。
[0003]微流控芯片，作為本世紀(jì)極具代表性的一種微型操作與分析平臺(tái)，在細(xì)胞研究微型化的發(fā)展道路上扮演著非常重要的角色。微流控芯片的顯著特征在于它的微型化，即微米級的芯片單元、微米級尺度下的細(xì)胞操作分析、生物樣本的微納升甚至皮升級操作處理與檢測分析水平。目前，基于微流控芯片的腫瘤細(xì)胞操作多為被動(dòng)式操作，在很大程度上缺乏細(xì)胞操作靈活性與時(shí)空控制能力。已開發(fā)的芯片微功能單元，如微篩、微孔，盡管能夠完成腫瘤細(xì)胞的原位捕獲，但由于其結(jié)構(gòu)固定，無法實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)空間控制的腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤構(gòu)建與分析及其回收操作與后分析研究。此外，如果采用極端條件處理進(jìn)行樣品回收，如使用極高流速液流，勢必會(huì)造成三維腫瘤結(jié)構(gòu)的破壞以及腫瘤細(xì)胞在這些固定微功能單元位置的殘留，不利于三維腫瘤操作。因此，開發(fā)一種可控式高通量腫瘤細(xì)胞定位與三維腫瘤仿生構(gòu)建芯片是十分有必要的。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0004]本發(fā)明目的在于，提供一種含有氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的集成微流控芯片，并提供一種用于平行高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收的芯片操作方法。該芯片操作簡單、快捷，便于多學(xué)科研究學(xué)者掌握。
[0005]為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下的技術(shù)方案:
[0006]一種集成微流控芯片，該微流控芯片由樣品流動(dòng)層和氣動(dòng)控制層構(gòu)成，所述樣品流動(dòng)層設(shè)有入口、微腔、出口和微管道網(wǎng)絡(luò)，所述氣動(dòng)控制層設(shè)有進(jìn)氣入口、氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)，所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接，所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的高度大于末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)的高度。
[0007]優(yōu)選的，氣動(dòng)控制層高度與微管道網(wǎng)絡(luò)高度的比值大于等于2，且小于等于5。
[0008]所述微流控芯片樣品流動(dòng)層設(shè)有I個(gè)入口、4_16個(gè)微腔、4-16個(gè)出口和一個(gè)對稱微管道網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)微腔對應(yīng)連接一個(gè)出口，并且微腔與出口之間通過對稱微管道網(wǎng)絡(luò)連接；所述氣動(dòng)控制層設(shè)有I個(gè)進(jìn)氣入口、144-1152個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和一個(gè)末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)，所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接；優(yōu)選的，每36-72個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)與樣品流動(dòng)層的一個(gè)微腔自下而上重疊對應(yīng)。
[0009]本發(fā)明提供的集成微流控芯片，所述芯片制備材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，與涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料進(jìn)行不可逆封接，從而確保所使用微流控芯片質(zhì)量以及芯片內(nèi)各個(gè)微功能單元的完整性。
[0010]優(yōu)選的，本發(fā)明提供的集成微流控芯片，所述微流控芯片樣品流動(dòng)層高度為100-500 μ m ;所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)高度為20-150 μ m，末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)高度為10-30 μm。
[0011]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明提供的集成微流控芯片，所述氣動(dòng)控制層中的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)高度大于微管道網(wǎng)絡(luò)高度。氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)與樣品流動(dòng)層之間的PDMS膜厚度明顯小于氣動(dòng)控制層微管道網(wǎng)絡(luò)與樣品流動(dòng)層之間的PDMS膜厚度。當(dāng)在外源氣壓為12_30psi作用下，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的PDMS膜形變明顯大于氣動(dòng)控制層微管道網(wǎng)絡(luò)對應(yīng)的PDMS膜形變，并能夠形成更高的三維結(jié)構(gòu)。
[0012]氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和微管道網(wǎng)絡(luò)的不同高度在于實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)微腔位置的精確定位，并減少腫瘤細(xì)胞被微管道網(wǎng)絡(luò)攔截和在微腔其他位置的殘留。本發(fā)明的微流控芯片適用于所有動(dòng)物正常細(xì)胞、胚胎、腫瘤細(xì)胞，及各種微米級顆粒材料的富集操作。
[0013]本發(fā)明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收，所述細(xì)胞樣品為哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞系。
[0014]本發(fā)明提供了一種基于集成微流控芯片的高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收的操作方法，具體步驟如下:
[0015]在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細(xì)胞黏附物的溶液由樣品流動(dòng)層入口，通過對稱微管道網(wǎng)絡(luò)，灌注進(jìn)入微腔內(nèi)，對微腔進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾；
[0016]然后灌注新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗微腔；
[0017]灌注細(xì)胞密度為I X 15-1 X 17個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞進(jìn)入微腔內(nèi)；
[0018]然后通過氣動(dòng)控制層的進(jìn)氣入口對氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定外源氣壓作用12-30psi，使其由二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S結(jié)構(gòu)，所形成的三維結(jié)構(gòu)可完成對腫瘤細(xì)胞的攔截定位捕獲；
[0019]當(dāng)細(xì)胞定位操作完成后，灌注新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行3-20天的細(xì)胞培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞自聚集形成三維腫瘤組織，進(jìn)而開展微流控芯片內(nèi)的三維腫瘤在線分析；
[0020]當(dāng)需要回收三維腫瘤組織時(shí)，可以隨時(shí)撤銷施加于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的外源氣壓，使其還原為二維結(jié)構(gòu)，腫瘤組織隨液流離開氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的微腔內(nèi)捕獲位點(diǎn)，并到達(dá)樣品流動(dòng)層出口。
[0021]本發(fā)明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收過程中，使用含抗細(xì)胞黏附物的溶液對樣品流動(dòng)層微腔進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾，所述抗細(xì)胞黏附物為牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗細(xì)胞黏附蛋白或抗細(xì)胞黏附聚合物。
[0022]相對于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的集成微流控芯片的有益效果在于:可以在單個(gè)微流控芯片內(nèi)連續(xù)完成腫瘤細(xì)胞的定位捕獲、三維腫瘤仿生構(gòu)建與分析及其回收操作。相對于以往微流控芯片內(nèi)腫瘤細(xì)胞操作及三維腫瘤構(gòu)建方法，其具有更好的時(shí)間與空間控制性及靈活性，同時(shí)具有操作簡單快捷、樣品低消耗、細(xì)胞定位精確與高效高通量等特點(diǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1本發(fā)明微流控芯片的樣品流動(dòng)層和氣動(dòng)控制層平面結(jié)構(gòu)參考示意圖，其中I為流動(dòng)層進(jìn)樣入口，2和3為流動(dòng)層管道出口，4為氣動(dòng)控制層中進(jìn)氣入口。
[0024]圖2為樣品流動(dòng)層單個(gè)微腔和氣動(dòng)控制層單組氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)陣列單元參考示意圖，其中21為腫瘤細(xì)胞和液流入口，22為腫瘤細(xì)胞和液流出口，23為氣動(dòng)控制層中氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的進(jìn)氣入口，24為氣動(dòng)控制層的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)，25為氣動(dòng)控制層中微管道網(wǎng)絡(luò)，26為樣品流動(dòng)層微腔內(nèi)的微柱子。
[0025]圖3為施加一定外源氣壓條件下的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)參考示意圖，其中31為氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的二維狀態(tài)，32為氣動(dòng)控制層的微管道網(wǎng)絡(luò)。
[0026]圖4為施加一定外源氣壓情況下的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)參考不意圖,其中41為氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的三維狀態(tài)，42為氣動(dòng)控制層的微管道網(wǎng)絡(luò)，43為施加外源氣壓的進(jìn)氣入口。
[0027]圖5為本發(fā)明微流控芯片內(nèi)腫瘤細(xì)胞進(jìn)樣參考示意圖，其中51為細(xì)胞進(jìn)樣入口，52為細(xì)胞進(jìn)樣出口，53為單個(gè)腫瘤細(xì)胞，54為二維狀態(tài)的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)，55為氣動(dòng)控制層的微管道網(wǎng)絡(luò)。
[0028]圖6為本發(fā)明微流控芯片內(nèi)細(xì)胞定位捕獲參考示意圖，其中61為三維狀態(tài)的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)，62為已捕獲的腫瘤細(xì)胞群，63為施加外源氣壓的進(jìn)氣入口。
[0029]圖7為本發(fā)明微流控芯片微腔內(nèi)新鮮細(xì)胞培養(yǎng)基灌注參考示意圖，其中71為細(xì)胞懸液中的腫瘤細(xì)胞。
[0030]圖8為本發(fā)明微流控芯片內(nèi)三維腫瘤自聚集形成參考示意圖，其中81為單個(gè)三維腫瘤。
[0031]圖9為實(shí)施例2微流控芯片內(nèi)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)捕獲細(xì)胞形成的三維腫瘤熒光標(biāo)記圖。
[0032]圖10為微流控芯片內(nèi)三維腫瘤回收示意圖，其中101為即將離開微腔的單個(gè)三維腫瘤。
【具體實(shí)施方式】
[0033]本發(fā)明的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)具有兩種空間結(jié)構(gòu)狀態(tài):包括二維靜息狀態(tài)和三維激發(fā)狀態(tài)。當(dāng)在大氣壓下，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)為二維結(jié)構(gòu)；當(dāng)在一定外源氣壓作用下，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)與樣品流動(dòng)層之間的PDMS膜發(fā)生形變，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)受激發(fā)而形成三維結(jié)構(gòu)。其中，三維氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)在于對腫瘤細(xì)胞的定位、三維腫瘤組織構(gòu)建控制性操作。二維氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)在于對所仿生構(gòu)建的腫瘤組織的回收操作。
[0034]本發(fā)明的集成微流控芯片的制備材料為聚二甲基硅氧烷(PDMS)，與涂有PDMS聚合物的玻璃或透明塑料材料進(jìn)行不可逆封接，從而確保所使用微流控芯片質(zhì)量以及芯片內(nèi)各個(gè)微功能單元的完整性。
[0035]本發(fā)明所述的高度均指工作腔內(nèi)的高度。
[0036]本發(fā)明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收，所述細(xì)胞樣品為哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞系。
[0037]本發(fā)明提供了一種基于集成微流控芯片的高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收的操作方法，具體步驟如下:在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細(xì)胞黏附物的溶液由樣品流動(dòng)層入口，通過對稱微管道網(wǎng)絡(luò)，灌注進(jìn)入微腔內(nèi)，對微腔進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾；然后灌注新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗微腔；灌注細(xì)胞密度為I X 15-1 X 17個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞進(jìn)入微腔內(nèi)；然后通過氣動(dòng)控制層的進(jìn)氣入口對氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)進(jìn)行一定外源氣壓作用12_30psi，使其由二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S結(jié)構(gòu)，所形成的三維結(jié)構(gòu)可完成對腫瘤細(xì)胞的攔截定位捕獲；
[0038]當(dāng)細(xì)胞定位操作完成后，灌注新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行3-20天的細(xì)胞培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞自聚集形成三維腫瘤組織，進(jìn)而開展微流控芯片內(nèi)的三維腫瘤在線分析；
[0039]當(dāng)需要回收三維腫瘤組織時(shí)，可以隨時(shí)撤銷施加于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的外源氣壓，使其還原為二維結(jié)構(gòu)，腫瘤組織隨液流離開氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的微腔內(nèi)捕獲位點(diǎn)，并到達(dá)樣品流動(dòng)層出口。
[0040]本發(fā)明提供的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤仿生構(gòu)建及其腫瘤回收過程中，使用含抗細(xì)胞黏附物的溶液對樣品流動(dòng)層微腔進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾，抗細(xì)胞黏附物為牛血清白蛋白、聚乙二醇及其它已知的抗細(xì)胞黏附蛋白或抗細(xì)胞黏附聚合物。
[0041]以下將參照附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)描述。應(yīng)當(dāng)理解，優(yōu)選實(shí)施例僅為了說明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0042]實(shí)施例1:
[0043]本實(shí)施例所使用的集成微流控芯片為 申請人:的實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)并制備。制備集成微流控芯片所使用的材料為PDMS聚合物，不可逆封接于涂有PDMS薄膜的玻璃表面。
[0044]本實(shí)施例所使用的集成微流控芯片由樣品流動(dòng)層和氣動(dòng)控制層構(gòu)成。
[0045]如圖1所示，樣品流動(dòng)層包含I個(gè)入口⑴、8個(gè)微腔、8個(gè)出口(2和3)和I個(gè)對稱微管道網(wǎng)絡(luò)。每個(gè)微腔對應(yīng)連接I個(gè)出口(2和3)，8個(gè)微腔呈對稱分布，并由對稱微管道網(wǎng)絡(luò)與入口(I)連接。
[0046]氣動(dòng)控制層包含I個(gè)進(jìn)氣入口(4)、360個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和I個(gè)末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)。樣品流動(dòng)層高度為100 μ m，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)高度為30 μ m，微管道網(wǎng)絡(luò)高度為15 μ m，其高度比值為2。氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接。
[0047]本實(shí)施例所使用集成微流控芯片的氣動(dòng)控制層單組氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)陣列與樣品流動(dòng)層單個(gè)微腔自下而上重疊對應(yīng)，每組陣列由45個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)組成(如圖2所示)。該微流控芯片樣品流動(dòng)層共包含了 8個(gè)微腔(圖1所示)，分別對應(yīng)于氣動(dòng)控制層的8組氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)陣列。
[0048]本實(shí)施例所使用集成微流控芯片可同時(shí)實(shí)現(xiàn)360個(gè)平行的腫瘤細(xì)胞精確定位操作。
[0049]當(dāng)未施加壓力(Opsi，即大氣壓下)時(shí)，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)呈二維形態(tài)(如圖3所示)；當(dāng)施加一定外源氣壓(12-30psi)時(shí)，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)呈三維空間形態(tài)(如圖4所示)，可以完成對腫瘤細(xì)胞的主動(dòng)機(jī)械式攔截定位捕獲操作。
[0050]在外源氣壓作用下，氣動(dòng)控制層的氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)高度為100 μ m，微管道網(wǎng)絡(luò)高度為25 μ m，其高度比值增大為4。
[0051]氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和微管道網(wǎng)絡(luò)的不同高度不僅實(shí)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞在氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)微腔位置的精確定位，同時(shí)也減少腫瘤細(xì)胞被微管道網(wǎng)絡(luò)攔截和在微腔其他位置的殘留。
[0052]實(shí)施例2:
[0053]該實(shí)施例為實(shí)施例1提供的微流控芯片的高通量H印G2肝癌細(xì)胞定位捕獲與三維腫瘤構(gòu)建:
[0054]首先對實(shí)施例1所述微流控芯片進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾，即通過微量注射泵將濃度為2mg/mL的牛血清白蛋白(BSA)溶液以5 μ L/min的流量由芯片流動(dòng)層入口⑴導(dǎo)入，BSA經(jīng)對稱微管道進(jìn)入微腔內(nèi)；室溫孵育2小時(shí)；然后用新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液灌注清洗；
[0055]對實(shí)施例1所述微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞灌注，即將細(xì)胞密度為I X 15個(gè)/mL的肝癌細(xì)胞懸液以5 μ L/min的流量由芯片流動(dòng)層入口(I)導(dǎo)入，細(xì)胞經(jīng)對稱微管道進(jìn)入細(xì)胞微腔內(nèi)(圖5所示);
[0056]給予氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)一定氣壓(12psi)，使其呈現(xiàn)為三維空間形態(tài)(如圖4所示)，從而捕獲肝癌細(xì)胞(如圖6所示)，一定數(shù)量的細(xì)胞群被定位于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的流動(dòng)層微腔位置(62)；
[0057]進(jìn)一步灌注不含腫瘤細(xì)胞的新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗掉微腔內(nèi)的殘留細(xì)胞懸液(如圖7所示)；
[0058]將該芯片放置于37°C、5% CO2飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)7天，使肝癌細(xì)胞自聚集形成三維腫瘤組織(如圖8所示)；然后進(jìn)行選擇性熒光標(biāo)記檢測分析(如圖9所示)。
[0059]實(shí)施例3:
[0060]該實(shí)施例為實(shí)施例1提供的微流控芯片的高通量MCF-7乳腺癌細(xì)胞定位捕獲與三維腫瘤構(gòu)建。
[0061]首先對實(shí)施例1所述微流控芯片進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾，即通過微量注射泵將濃度為lmg/mL的脫脂奶粉溶液以5 μ L/min的流量由芯片流動(dòng)層入口⑴導(dǎo)入，脫脂奶粉溶液經(jīng)對稱微管道進(jìn)入微腔內(nèi)；室溫孵育2小時(shí)；然后用新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液灌注清洗；
[0062]首先對實(shí)施例1的微流控芯片進(jìn)行細(xì)胞灌注，即通過微量注射泵將細(xì)胞密度為I X 17個(gè)/mL的乳腺癌細(xì)胞懸液以15 μ L/min的流量由芯片流動(dòng)層入口⑴導(dǎo)入，細(xì)胞經(jīng)對稱微管道進(jìn)入細(xì)胞微腔內(nèi)(參考圖5所示)；
[0063]給予氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)一定氣壓(30psi)，使其呈現(xiàn)為三維空間形態(tài)，從而捕獲乳腺癌細(xì)胞(參考圖6所示)，一定數(shù)量的細(xì)胞群被定位于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的流動(dòng)層微腔位置
(62)；
[0064] 進(jìn)一步灌注不含腫瘤細(xì)胞的新鮮DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗掉微腔內(nèi)的殘留細(xì)胞懸液(參考圖7所示)；
[0065]將該芯片放置于37°C、5% CO2飽和濕度條件下連續(xù)培養(yǎng)15天，使乳腺癌細(xì)胞自聚集形成三維腫瘤組織；然后進(jìn)行乳腺癌相關(guān)藥物篩選分析。
[0066]實(shí)施例4:
[0067]該實(shí)施例為提供實(shí)施例2所述微流控芯片內(nèi)的三維腫瘤組織回收。根據(jù)特定需求，準(zhǔn)備對微流控芯片內(nèi)三維腫瘤進(jìn)行回收時(shí)，可任意選擇特定的時(shí)間點(diǎn)撤銷作用于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的外源氣壓，使其降至Opsi，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)還原為二維形態(tài)。芯片樣品流動(dòng)層微腔內(nèi)三維腫瘤被釋放，并隨液流排出，進(jìn)入芯片流動(dòng)層出口(如圖10所示)，從而實(shí)現(xiàn)三維腫瘤組織的回收。
【權(quán)利要求】
1.一種集成微流控芯片，該集成微流控芯片包括樣品流動(dòng)層和氣動(dòng)控制層組成，所述樣品流動(dòng)層設(shè)有入口、微腔、出口和微管道網(wǎng)絡(luò)，所述氣動(dòng)控制層設(shè)有進(jìn)氣入口、氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)，所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接，其特征在于:所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的高度大于末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)的高度。
2.如權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的高度與末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)的高度比值大于等于2，且小于等于5。
3.如照權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片的制備材料為聚二甲基硅氧烷。
4.按照權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述微流控芯片樣品流動(dòng)層設(shè)有I個(gè)入口、4-16個(gè)微腔、4-16個(gè)出口和I個(gè)對稱微管道網(wǎng)絡(luò)，每個(gè)微腔對應(yīng)連接一個(gè)出口，并且微腔與出口之間通過對稱微管道網(wǎng)絡(luò)連接；所述芯片氣動(dòng)控制層設(shè)有I個(gè)進(jìn)氣入口、144-1152個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)和一個(gè)末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)，氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)由末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)與進(jìn)氣口相連接；每36-72個(gè)氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)與一個(gè)微腔自下而上重疊對應(yīng)。
5.按照權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片，其特征在于:所述樣品流動(dòng)層高度為100-500 μ m;所述氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的高度為20-150 μ m，所述末端封閉的微管道網(wǎng)絡(luò)高度為10-30 μ mD
6.如權(quán)利要求1所述的集成微流控芯片用于高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤組織構(gòu)建及回收，其特征在于:所述細(xì)胞樣品為哺乳動(dòng)物腫瘤細(xì)胞及腫瘤細(xì)胞系。
7.如權(quán)利要求6所述的高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤組織構(gòu)建及其回收，其特征在于:包括: 在流速范圍為5-20 μ L/min條件下，將含抗細(xì)胞黏附物的溶液由樣品流動(dòng)層入口，通過對稱微管道網(wǎng)絡(luò)，灌注進(jìn)入微腔內(nèi)，對微腔進(jìn)行抗細(xì)胞黏附修飾； 然后灌注新鮮腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，清洗微腔； 灌注細(xì)胞密度為I X 15-1 X 17個(gè)/mL的腫瘤細(xì)胞懸液，細(xì)胞進(jìn)入微腔內(nèi); 然后通過氣動(dòng)控制層的進(jìn)氣入口對氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)進(jìn)行12-30psi外源氣壓作用，使其由二維結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)變?yōu)槿S結(jié)構(gòu)，所形成的三維結(jié)構(gòu)可完成對腫瘤細(xì)胞的攔截定位捕獲； 當(dāng)細(xì)胞定位操作完成后，灌注新鮮腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)液，進(jìn)行3-20天的細(xì)胞培養(yǎng)，腫瘤細(xì)胞自聚集形成三維腫瘤組織； 當(dāng)需要回收三維腫瘤組織時(shí)，可以隨時(shí)撤銷施加于氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)的外源氣壓，使其還原為二維結(jié)構(gòu)，腫瘤組織隨液流離開氣動(dòng)控制結(jié)構(gòu)對應(yīng)的微腔內(nèi)捕獲位點(diǎn)，并到達(dá)樣品流動(dòng)層出口。
8.按照權(quán)利要求7所述的高通量腫瘤細(xì)胞定位、三維腫瘤組織構(gòu)建及其回收，其特征在于:所述抗細(xì)胞黏附物為牛血清白蛋白或聚乙二醇。
【文檔編號】C12M1/04GK104164360SQ201410366445
【公開日】2014年11月26日 申請日期:2014年7月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月29日
【發(fā)明者】劉文明, 王進(jìn)義, 王建春, 許娟, 李天保, 涂琴, 王垚磊 申請人:西北農(nóng)林科技大學(xué)