一個高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)LeMYB1基因毛狀根株系的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一個能高產(chǎn)紫草藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉(zhuǎn)LeMYB1基因毛狀根株系。該株系通過構(gòu)建一個受茉莉酸甲酯高效誘導(dǎo)表達(dá)的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因LeMYB1的植物過表達(dá)載體，然后將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834后，侵染硬紫草的無菌苗而獲得。該株系易于繁殖、生長迅速，所產(chǎn)紫草寧及其衍生物的含量是直接用ATCC15834侵染硬紫草無菌苗所獲得的毛狀根株系的2.88倍。本發(fā)明不僅可有效解決我國硬紫草資源的日益短缺、人工栽培周期長、受氣候及地理?xiàng)l件制約等問題，并且可高效大量生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物。該高產(chǎn)株系將為利用硬紫草毛狀根工廠化生產(chǎn)硬紫草藥用天然產(chǎn)物提供材料支撐，具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景。
【專利說明】一個高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBI基因毛狀根株系
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于植物生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及將攜帶編碼轉(zhuǎn)錄因子基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，然后再侵染硬紫草無菌苗而誘導(dǎo)出高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的轉(zhuǎn)基因毛狀根株系O
【背景技術(shù)】
[0002]紫草屬紫草科多年生藥用草本植物，主要包括新疆紫草(Arnebia euchroma(Royle)Johnst.) > 內(nèi)蒙紫草(Arnebia guttata Bunge.)、硬紫草(Lithospermumerythrorhizon Sieb.et Zucc)和漠紫草(Onosma paniculatum Bur.et Franch)等。其根系可產(chǎn)生紫草寧及其衍生物等藥用天然產(chǎn)物活性成分，具有抗免疫缺血、抗腫瘤，治療風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多硬化癥、艾滋病、過敏性紫癜、銀屑病以及保肝護(hù)肝、降血糖、降血粘度、降壓、解熱、鎮(zhèn)痛止痛等功效[1_4]。另外，紫草的多糖成分能增強(qiáng)機(jī)體特異性和非特異性免疫能力；紫草油具有治療燒傷、燙傷、急慢性膿耳、口腔潰瘍、褥瘡、痔瘡、急慢性濕疹以及促進(jìn)傷口愈合等功效[5_7]。紫草色素的抗真菌作用還可作為生物毒素用于番茄葉霉病的防治[8’9]。此外，紫草素還可作為天然色素，被聯(lián)合國食品添加劑法典委員會列入食品、化妝品、藥品添加劑范圍，廣泛用于化妝品、防曬制品(如塑料制品)、食品、藥品等著色以及印染、洗滌劑的添加劑等，被國際譽(yù)為紅色素之王[1°_12]。因此，紫草已逐漸成為醫(yī)療、食品色素和化妝品及防病治病開發(fā)新藥研究的熱點(diǎn)。
[0003]隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)展，采用細(xì)胞培養(yǎng)工程技術(shù)生產(chǎn)并提高人類所需的紫草寧及其衍生物，成為一種非常重要的生物技術(shù)手段。上世紀(jì)70年代，日本即已成功運(yùn)用兩階段培養(yǎng)體系，即在光照條件下B5固體培養(yǎng)基上繁殖紫草細(xì)胞，然后在黑暗條件下利用M9液體生產(chǎn)培養(yǎng)基中培養(yǎng)紫草細(xì)胞進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)紫草寧[13]。然而在植物細(xì)胞培養(yǎng)過程中普遍存在細(xì)胞系不穩(wěn)定，細(xì)胞生長緩慢，不耐剪切及代謝物產(chǎn)量低等問題，成為其實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)的瓶頸。
[0004]毛狀根體系的建立可為大量生產(chǎn)天然活性物質(zhì)提供有效的手段。發(fā)根農(nóng)桿菌(Agrobacterium rhizogenes)是屬于根瘤菌科農(nóng)桿菌屬革蘭氏陰性菌,能侵染絕大多數(shù)雙子葉植物和少數(shù)單子葉植物，誘發(fā)被侵染植物受傷部位產(chǎn)生毛狀根。發(fā)根農(nóng)桿菌之所以具有這種致根特性是由于它具有能誘導(dǎo)毛狀根產(chǎn)生的Ri質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒是發(fā)根農(nóng)桿菌染色體外的一個大質(zhì)粒，帶有冠癭堿合成基因和生長素合成基因。毛狀根培養(yǎng)是較細(xì)胞培養(yǎng)產(chǎn)生天然產(chǎn)物更優(yōu)越的實(shí)驗(yàn)材料M。此外，由于發(fā)根農(nóng)桿菌攜帶的Ri質(zhì)粒能將外源基因整合到寄主染色體、其誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛狀根易獲得再生植株等優(yōu)點(diǎn)，因此，建立特定植物的轉(zhuǎn)基因毛狀根體系，提高毛狀根中次生代謝物的產(chǎn)量，在定向植物分子育種方面具有廣泛應(yīng)用前景。近年來利用發(fā)根農(nóng)桿菌已成功轉(zhuǎn)化多種藥用植物并建立了毛狀根轉(zhuǎn)基因體系，極大地方便了藥用天然產(chǎn)物得生產(chǎn)及遺傳育種研究。
[0005]茉莉酸是一種能調(diào)控植物生長發(fā)育、抗逆境、創(chuàng)傷脅迫反應(yīng)及植物次生代謝合成等多個生理過程的激素。茉莉酸類物質(zhì)能誘導(dǎo)植物細(xì)胞生產(chǎn)更多的次生代謝產(chǎn)物，如茉莉酸可誘導(dǎo)植物產(chǎn)生尼古丁、芥子油苷、苜蓿堿、異類黃酮等生物堿和酚酸類次生代謝產(chǎn)物。紫草寧同樣受到茉莉酸及其甲酯類衍生物的高效誘導(dǎo)合成[15_17]。在茉莉酸類物質(zhì)調(diào)節(jié)植物次生代謝產(chǎn)物合成中的過程中，轉(zhuǎn)錄因子起到相當(dāng)重要的作用。
[0006]在本實(shí)驗(yàn)室室前期研究外源茉莉酸甲酯(MeJA)誘導(dǎo)紫草寧合成的功能蛋白質(zhì)組學(xué)過程中，我們發(fā)現(xiàn)了一個受到外源MeJA誘導(dǎo)表達(dá)的R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白，結(jié)合其他植物中已有的對R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子的研究結(jié)果_，推測其很可能參與介導(dǎo)了 MeJA促進(jìn)紫草寧及衍生物合成的生物學(xué)過程。
[0007]紫草的LeMYBl是本實(shí)驗(yàn)室克隆的一個編碼R2R3類MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白基因[19]。紫草細(xì)胞從B5轉(zhuǎn)入M9中后，LeMYBl受誘導(dǎo)表達(dá)，且受到MeJA的高效調(diào)控；而且該基因在紫草根部(紫草寧合成的特異性部位)高表達(dá)，推測該基因參與茉莉酸介導(dǎo)的對紫草寧的合成調(diào)控[19]。
[0008]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將紫草本身的LeMYBl基因轉(zhuǎn)入紫草中過表達(dá)，提高紫草毛狀根中紫草寧的含量，從中篩選出高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，在理論上是完全可行的。
[0009]通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物的紫草毛狀根株系，不僅在系統(tǒng)研究紫草藥用天然產(chǎn)物生物合成途徑及其分子調(diào)控機(jī)制方面具有重要的理論意義，并在商業(yè)化生產(chǎn)紫草藥用天然產(chǎn)物方面具有非常重要的應(yīng)用前景和價值。盡管目前國內(nèi)外有利用毛狀根為材料對紫草寧合成調(diào)控進(jìn)行的相關(guān)研究，但并無將紫草R2R3類MYB蛋白的相關(guān)基因轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌，誘導(dǎo)出能高效合成紫草藥用天然產(chǎn)物的紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根并藉此提高紫草寧合成的相關(guān)報(bào)道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0010]本發(fā)明需要解決的問題是通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得一個高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根株系，主要是通過將所選擇的LeMYBl基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834，然后侵染硬紫草無菌苗，誘導(dǎo)出含目的基因的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根，對獲得的轉(zhuǎn)基因毛狀根擴(kuò)大培養(yǎng)并進(jìn)行分子鑒定和藥用天然產(chǎn)物含量測定。
[0011]本發(fā)明的技術(shù)方案包括如下步驟:
[0012](I)將硬紫草種子表面清洗干凈，低溫浸泡在自來水中兩天，期間換水2-3次，然后用濕砂和種子混勻后放入4°C冰箱層積處理約I個月左右，種子出芽后，用自來水沖洗掉沙子，用0.1 %升汞消毒發(fā)芽的種子5分鐘，然后用無菌水沖洗5-7次，將水吸干后接種在1/2MS無激素的固體培養(yǎng)基上于25°C，16小時光照8小時黑暗培養(yǎng)2周。待幼苗長至2_4cm高度并伸展出第2-3對真葉時用作被侵染材料。
[0013](2)轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備:高保真酶擴(kuò)增目的基因LMYB1，將獲得的目的片段與真核表達(dá)載體pBI121-eGFP連接，將連接產(chǎn)物用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性克隆，用YEB液體培養(yǎng)基擴(kuò)增至0D600 = 0.8時，添加乙酰丁香酮(AS)，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0014](3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根:用無菌針浸蘸上述活化的具有侵染特性的菌液，用針尖穿刺硬紫草幼苗的第1-2對真葉的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，穿刺莖節(jié)處一下，共穿刺2-3次。然后將侵染的幼苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于25°C弱散射光培養(yǎng)培養(yǎng)。針刺一周左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，隨后在侵染部位的白色突起首先變成絨毛狀，然后長出一條或多條白色的毛狀根。將誘發(fā)的毛狀根從侵染點(diǎn)部位剪切下來，培養(yǎng)在含有頭孢霉素500mg/L的B5培養(yǎng)基上，每周轉(zhuǎn)接一次，直至徹底除菌后，移到不含抗生素的B5培養(yǎng)基上擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0015](4)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根的液體培養(yǎng)基培養(yǎng):將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)。
[0016](5)轉(zhuǎn)基因毛狀根分子鑒定:提取野生型和轉(zhuǎn)基因毛狀根材料的DNA，運(yùn)用PCR方法同時檢測農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因和35S-LeMYBl-GFP融合基因，判斷硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根是否為真正的轉(zhuǎn)基因株系。
[0017](6)紫草寧合成及測定:將鑒定的轉(zhuǎn)基因紫草毛狀根經(jīng)B5液體生長培養(yǎng)基培養(yǎng)15天后轉(zhuǎn)入M9生產(chǎn)紫草寧液體培養(yǎng)基，置于26°C黑暗條件下?lián)u動培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度；用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧的M9液體，提取紫草寧及其衍生物，紫外分光光度計(jì)測定含量，以野生型紫草毛狀根(只用不含外源基因的ATCC15834侵染而獲得的硬紫草毛狀根)為對照，計(jì)算轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量變化。
[0018]本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其有益效果是:
[0019]如前所述，野生紫草資源的日益匱乏及缺乏真正高效的人工合成紫草寧及其衍生物的培養(yǎng)體系，已經(jīng)成為紫草寧藥用研究及商業(yè)化應(yīng)用的一個制約因素。至今未見通過誘導(dǎo)出轉(zhuǎn)入LeMYBl基因的毛狀根，藉此提高紫草寧及其衍生物產(chǎn)量的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。本發(fā)明首次將一個紫草R2R3類MYB家族蛋白的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子基因LeMYBl轉(zhuǎn)入植物表達(dá)載體，將該載體轉(zhuǎn)入發(fā)根農(nóng)桿菌后再轉(zhuǎn)入紫草無菌苗，誘導(dǎo)出紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根；獲得的硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根中紫草寧含量較野生型紫草毛狀根顯著提高。該方法可克服紫草愈傷細(xì)胞誘導(dǎo)、培養(yǎng)困難，細(xì)胞易于老化褐化、紫草寧產(chǎn)量不高、產(chǎn)量不穩(wěn)定、夏季難產(chǎn)或不產(chǎn)紫草寧等諸多問題；解決了利用愈傷細(xì)胞進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化存在的技術(shù)難度高、周期長、轉(zhuǎn)化效率偏低等問題，轉(zhuǎn)基因毛狀根誘導(dǎo)和繁殖不受外界環(huán)境、季節(jié)等因素制約，大大提高了紫草轉(zhuǎn)基因效率；轉(zhuǎn)入的LeMYBl基因有助于紫草藥用天然產(chǎn)物合成的分子調(diào)控機(jī)制研究，對紫草功能基因鑒定和研究及植物分子育種具有重要指導(dǎo)意義，對其他轉(zhuǎn)基因困難的木本植物提供了可靠的借鑒方法；獲得的紫草寧高產(chǎn)轉(zhuǎn)基因毛狀根株系具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景和商業(yè)價值。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)出的轉(zhuǎn)LeMYBl基因的硬紫草毛狀根
[0021]圖2轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根在B5固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)
[0022]圖3轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根在B5液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)
[0023]圖4轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根RolC基因、35S_LeMYBl-GFP-R融合基因的檢測
[0024]圖5轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根在M9液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)時大量產(chǎn)生藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)
[0025]圖6轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根與野生型毛狀根中紫草寧及其衍生物含量的測定及比較
【具體實(shí)施方式】
[0026]實(shí)施例1、硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根的誘導(dǎo)
[0027](I)硬紫草無菌苗培養(yǎng):選取飽滿的硬紫草種子，無菌水清洗后置于4°C環(huán)境中黑暗培養(yǎng)1-2個月，直至種子發(fā)芽；挑取剛發(fā)芽的種子，清水洗干凈；用0.1 %的升汞消毒5min，再用無菌水清洗5-7次；置于MS基本培養(yǎng)基，26°C _28°C光照培養(yǎng)，獲得一定數(shù)量的紫草無菌苗。一個月后，當(dāng)紫草無菌苗長出兩片真葉后，作為誘導(dǎo)毛狀根的外植體。
[0028](2)過表達(dá)載體構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因侵染菌液制備:根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室已克隆的紫草LeMYBl序列(Genbank Access1n N0.KC818628)設(shè)計(jì)引物 LeMYBl-OM-F:5' -GACTCTAGAATGGTGAGAGCACCATGTTGTG-3 ' ；LeMYB1-OM-R:5 ' -GGTGGATCCCGGGCCCGCTACTGATTTTCCAGC-3 ',高保真酶擴(kuò)增目的片段；將獲得的目的片段切膠回收，并與pBI121-eGFP載體連接，構(gòu)建PB 1121 -LeMYB 1-eGFP質(zhì)粒；將pB 1121 -LeMYB I _eGFP質(zhì)粒用凍融法轉(zhuǎn)化發(fā)根農(nóng)桿菌ATCC15834感受態(tài)細(xì)胞；挑取陽性克隆，轉(zhuǎn)入YEB液體培養(yǎng)基，在26_28°C，10rpm的搖床中擴(kuò)增至0D600 = 0.8時，添加100 μ M的AS，作為轉(zhuǎn)基因侵染菌液。
[0029](3)針刺莖節(jié)法誘導(dǎo)硬紫草轉(zhuǎn)基因毛狀根:用接種針蘸上述活化的具有侵染特性的轉(zhuǎn)基因菌液，用針尖穿刺紫草無菌苗的莖節(jié)處，針尖每浸蘸菌液一次，刺莖節(jié)處一下，每株共穿刺2-3次；將侵染的無菌苗轉(zhuǎn)移到MS固體培養(yǎng)基上于26°C黑暗培養(yǎng)。一周左右即可發(fā)現(xiàn)侵染部位出現(xiàn)白色突起，2天后在侵染部位的白色突起長出絨毛狀根系，然后長出一條或多條毛狀根(圖1);以不含外源基因的野生型ATCC15834菌液按照上述相同方法，誘導(dǎo)出紫草野生型毛狀根 ，作為對照材料。
[0030]實(shí)施例2、硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根的培養(yǎng)
[0031](I)毛狀根除菌培養(yǎng):誘導(dǎo)出來的毛狀根經(jīng)過一星期的生長，剪取長度約Icm的毛狀根，轉(zhuǎn)入B5+500mg/L頭孢霉素的固體培養(yǎng)基除菌，再過一星期轉(zhuǎn)入B5+250mg/L頭孢霉素，直至除去殘留的發(fā)根農(nóng)桿菌；將徹底除菌的毛狀根轉(zhuǎn)入B5固體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)(圖2)；
[0032](2)毛狀根液體培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng):將固體擴(kuò)大培養(yǎng)的毛狀根轉(zhuǎn)入B5液體培養(yǎng)基，10rpm的搖床中光照擴(kuò)大培養(yǎng)(圖3)。
[0033]實(shí)施例3、硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根的分子鑒定
[0034]取一定數(shù)量毛狀根，提取毛狀根DNA，設(shè)計(jì)檢測RolC與35S-LeMYB1-eGFP融合基因的引物分別為 RolC-F:5’ -ACAAGCCACTTCTGTTTCCC-3’ ；RolC-R:5’ -CAGCGACTGCAACCAGTTTA-3’，35S-F-50:5/ -CACTATCCTTCGCAAGACCCT-3' ；GFP-R-100:5' -GCTGAACTTGTGGCCGTTT-3'，用PCR方法擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測序比對，檢測毛狀根中農(nóng)桿菌Ri質(zhì)粒中RolC基因存在與否，野生型和轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根均檢測到RolC基因的存在，說明獲得的均為毛狀根；但35S-LeMYBl-GFP-R融合基因只在轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根中檢測到(圖4)，表明其確實(shí)為轉(zhuǎn)LeMYBl基因的毛狀根。
[0035]實(shí)施例4、硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根紫草寧含量測定
[0036](I)將硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根及野生型毛狀根轉(zhuǎn)入M9液體培養(yǎng)基，置于260CUOOrpm的搖床中黑暗培養(yǎng)，一周后紫草寧含量即可達(dá)到很高濃度(圖5);
[0037](2)用石油醚浸泡紫草毛狀根及含有紫草寧及其衍生物的M9液體，紫外分光光度計(jì)測定含量，以野生型紫草毛狀根為對照，計(jì)算轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根中紫草寧含量(圖6)。紫草寧含量總量包括紫草細(xì)胞或毛狀根和分泌到M9培養(yǎng)基中的紫草寧及其衍生物含量總和。具體方法如下:稱取在M9培養(yǎng)體系中的毛狀根，并取含有分泌的紫草寧及其衍生物的M9培養(yǎng)基，用石油醚浸泡，反復(fù)提取，直到提取液無色，合并提取液，紫外分光光度計(jì)測定0D520的吸光值，由下列方程得到紫草寧及其衍生物含量:含量(mg/gFW)=41.66X0D520X 稀釋倍數(shù)。
[0038](3)紫草寧及其衍生物含量測定顯示，所得到的這一個轉(zhuǎn)LeMYBl基因的硬紫草毛狀根(0M3)中紫草寧含量比野生型毛狀根中的含量提高2.88倍，而且該株系具有生長速度快、繁殖容易的特點(diǎn)，適于商業(yè)化生產(chǎn)所用，命名為LeMYB 1-0M3。
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【權(quán)利要求】
1.一個高產(chǎn)藥用天然產(chǎn)物(紫草寧及其衍生物)的硬紫草轉(zhuǎn)LeMYBl基因毛狀根株系。
2.權(quán)利要求1中所 述的硬紫草轉(zhuǎn)基因高產(chǎn)株系的商業(yè)化應(yīng)用。
【文檔編號】C12N15/82GK104178510SQ201410366272
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月28日
【發(fā)明者】戚金亮, 楊永華, 趙胡, 方榮俊, 趙華, 韓秋敏, 朱煜, 吳鳳瑤, 張東霞, 葛素囡, 王小明, 陸桂華, 楊榮武 申請人:南京大學(xué)