一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法。本發(fā)明提供的方法包括如下步驟：(1)將功能磁珠與待測樣本共孵育；功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；(a)表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；(b)連接有鏈霉親和素和標記物的探針；(2)完成步驟(1)后，進行磁分離，收集上清液；(3)在與標記物相應的激發(fā)波長激發(fā)下，采用表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片檢測步驟(2)得到的上清液，根據(jù)信號值判斷待測樣本中是否含有靶標物質。本發(fā)明的方法具有成本低廉、簡單、快速的優(yōu)點，并保持了適配體靶標分子廣泛、特異性好且靈敏度高的優(yōu)點，可穩(wěn)定使用300次以上。
【專利說明】—種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法
【技術領域】
[0001]本發(fā)明涉及一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法。
【背景技術】
[0002]以核酸適配體為生物識別材料的傳感分析方法在最近二十多年得到了飛速發(fā)展。核酸適配體是一段能夠特異性識別目標污染物的RNA或單鏈DNA片段。早在上個世紀九十年代，Nature和Science期刊幾乎同時首次報道了核酸適配體材料及其篩選技術。經(jīng)過二十幾年的發(fā)展，目前已經(jīng)報道的核酸適配體材料已經(jīng)可以檢測環(huán)境中的上百種物質。
[0003]以核酸適配體為生物識別元件的傳感分析方法包括可分為均相和非均相(或異相)適配體傳感分析兩種方法。目前，均相法的核酸適配體傳感技術仍然是主流。比如，University of Illinois at Urbana-Champaign大學Lu Yi課題組利用在核酸適配體探針上固定熒光基團和猝滅基團，基于靶標物質識別后產(chǎn)生的DNA構象變化實現(xiàn)熒光信號的增強或減弱，從而建立起靶標物濃度與熒光信號的定量關系。均相反應速度快，檢測過程簡單，然而試劑消耗量大、檢測成本高。固相法通常以固定單鏈DNA探針為主，基于DNA探針對雜交鏈和靶標物親和能力的差異實現(xiàn)檢測。為實現(xiàn)多次使用，需要將雜交后的DNA鏈或靶標物洗脫。已經(jīng)報道的洗脫方法包括:酸洗/堿洗、加熱、高鹽洗脫、EDTA螯合、表面活性劑洗脫等。缺點是穩(wěn)定可重復使用的次數(shù)非常有限，通常在5-15次之間。究其原因是DNA的三級構象非常脆弱，在各種洗脫條件下，很難恢復到初始狀態(tài)。這樣低的穩(wěn)定重復使用次數(shù)也極大限制了固相DNA技術的發(fā)展和適用范圍。
【發(fā)明內容】
[0004]本發(fā)明的目的是提供一種基于核酸適配體探針熒光傳感分析檢測待測樣本中的靶標物質的方法。
[0005]本發(fā)明提供了一種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的方法，包括如下步驟:
[0006](I)將功能磁珠與所述待測樣本共孵育；所述功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；所述(a)為表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；所述(b)為連接有鏈霉親和素和標記物的探針；所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子；
[0007](2)完成步驟(1)后，進行磁分離，收集上清液；
[0008](3)在與標記物相應的的激發(fā)波長激發(fā)下，采用表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片檢測步驟(2)得到的上清液，根據(jù)信號值判斷待測樣本中是否含有靶標物質。
[0009]所述表面修飾有脫硫生物素的固相芯片的制備方法包括如下步驟:
[0010]( I )取固相芯片，使其表面羥基化；
[0011]( II )完成步驟(I )后，取固相芯片，使其表面修飾APTS ；
[0012](IV )完成步驟(II )后，取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素。
[0013]“取固相芯片，使其表面羥基化”的方法具體如下:①將固相芯片浸入Piraha溶液(98%^cH2SO4IH2O2 = 3:1，體積比)并120°C反應Ih 完成步驟①后，取出固相芯片，用超純水清洗直到PH值為中性，在室溫下用氮氣吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存lh。
[0014]“取固相芯片，使其表面修飾APTS”的方法具體如下:①取固相芯片，置于APTS溶液中反應Ih 完成步驟①后，取出固相芯片，用無水甲苯?jīng)_洗，在室溫下用氮氣吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶質為APTS，溶劑為無水甲苯，溶質的濃度為2% (體積比)。
[0015]“取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素”的方法具體如下:①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室溫反應lh，然后用乙醇沖洗，然后置于乙二胺溶液中室溫反應1.5h，然后置于NaBH4溶液中室溫反應15min ;②取25mg脫硫生物素、50mg EDC和50mg NHS,用1000 μ IDMF溶解，室溫反應3h，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3緩沖液并混勻，得到混合液完成步驟①后，取出固相芯片，加入步驟②得到的混合液中，室溫反應12小時完成步驟③后，取出固相芯片，用乙醇沖洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS緩沖液中，室溫反應lh。戊二醛溶液:溶質為戊二醛，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為2.5%。乙二胺溶液:溶質為乙二胺，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為10%。NaBH4溶液:溶質為NaBH4,溶劑為乙醇，溶質的濃度為10mg/ml。
[0016]所述“連接有鏈霉親和素和標記物的探針”的制備方法具體如下:①合成探針，在5’末端進行巰基修飾，在3’末端進行標記物修飾，命名為SH-DNA-標記物；②在10 μ I ImMSH-DNA-標記物中加入0.67 μ L TCEP溶液，避光室溫反應lh，以活化巰基；③取Amicon_3K，加入完成步驟②后得到的整個反應體系，再加入200yL Buffer A_l，然后12000rpm離心1min,用buffer A_2洗漆Amicon_3K,收集分子量大于3K的組分(溶液形式)；④取133 μ L 20mg/mL鏈霉親和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩渦震蕩5min，然后室溫反應lh, 12000rpm離心5min,取上清液；⑤取Amicon-1OK,加入步驟④得到的上清液,再加入200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 離心 1min,用 buffer A_2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于1K的組分(溶液形式)；⑥將步驟⑤得到的溶液加入步驟③得到的溶液中，避光室溫反應48h ;@取4111化011-101(，加入完成步驟?后得到的整個反應體系，再加入20(^1^ BufferA-1,12000rpm離心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的組分(溶液形式)，即為含有連接有鏈霉親和素和標記物的探針溶液。TCEP溶液:溶質為TCEP，溶劑超純水，溶質的濃度為30mM。Buffer A-1:含0.1M NaCl和0.1M磷酸鈉的水溶液，pH7.3。Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M 磷酸鈉和 0.05% (體積比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0017]所述“表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠”的制備方法包括如下步驟:①將38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0,0.1M的甲基咪唑緩沖液，然后加入0.65nmol所述核酸適配體，充分混合，得到混合液；②將步驟①得到的混合液加入約20mg磁珠中，室溫搖勻反應24小時，然后磁分離并收集磁珠，用2毫升預雜交緩沖液對磁珠表面未反應的羧基進行封閉，得到表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠。預雜交緩沖液:溶劑為pH7.4、0.1M的Tris緩沖液，含0.005M EDTA.0.5% (體積比)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mLBSA。
[0018]所述功能磁珠的制備方法具體包括如下步驟:①取約20mg表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠，用2mL雜交緩沖液懸浮，在60°C水浴中溫浴Ih ;②取10 μ L含有連接有鏈霉親和素和標記物的探針溶液，溶于2mL雜交緩沖液中，在60°C水浴中溫浴Ih 將步驟①得到的磁珠懸浮液和步驟②得到的溶液混合，室溫搖勻反應2.5h，得到功能磁珠懸浮液。雜交緩沖液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2的水溶液，pH
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[0019]所述標記物具體可為熒光標記物，更具體可為Cy5.5。所述與標記物相應的的激發(fā)波長具體可為650nm。
[0020]所述步驟(3)具體是在全光纖倏逝波生物傳感器中進行的。全光纖倏逝波生物傳感器的操作規(guī)程如下:打開激光器，激發(fā)波長為650nm ;以PBS緩沖液沖洗表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片直至基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，取待測溶液，開啟蠕動泵進樣25s，之后停止蠕動泵，使待測溶液在反應池內反應120s ;再次開啟蠕動泵，通入洗脫液(0.5g/100mL SDS水溶液，調pH至1.9) 90秒；最后通入PBS緩沖液，至基線平穩(wěn)。
[0021]所述磁珠具體可為羧基磁珠。
[0022]所述固相芯片具體可為光纖。
[0023]所述靶標物質為赭曲霉素A。
[0024]所述核酸適配體具體如序列表的序列I所示。所述探針具體如序列表的序列2所
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[0025]本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的試劑盒，包括功能磁珠和表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；所述(a)為表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；所述(b)為連接有鏈霉親和素和標記物的探針；所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子。
[0026]本發(fā)明還保護一種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的試劑盒，包括“表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠”和“連接有鏈霉親和素和標記物的探針”;所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子。
[0027]所述表面修飾有脫硫生物素的固相芯片的制備方法包括如下步驟:
[0028]( I )取固相芯片，使其表面羥基化；
[0029]( II )完成步驟(I )后，取固相芯片，使其表面修飾APTS ；
[0030]( IV )完成步驟(II )后，取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素。
[0031]“取固相芯片，使其表面羥基化”的方法具體如下:①將固相芯片浸入Piraha溶液(98%^cH2SO4IH2O2 = 3:1，體積比)并120°C反應Ih 完成步驟①后，取出固相芯片，用超純水清洗直到PH值為中性，在室溫下用氮氣吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存lh。
[0032]“取固相芯片，使其表面修飾APTS”的方法具體如下:①取固相芯片，置于APTS溶液中反應Ih 完成步驟①后，取出固相芯片，用無水甲苯?jīng)_洗，在室溫下用氮氣吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶質為APTS，溶劑為無水甲苯，溶質的濃度為2% (體積比)。
[0033]“取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素”的方法具體如下:①取固相芯片，置于戊二醛溶液中室溫反應lh，然后用乙醇沖洗，然后置于乙二胺溶液中室溫反應1.5h，然后置于NaBH4溶液中室溫反應15min ;②取25mg脫硫生物素、50mg EDC和50mg NHS,用1000 μ IDMF溶解，室溫反應3h，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3緩沖液并混勻，得到混合液完成步驟①后，取出固相芯片，加入步驟②得到的混合液中，室溫反應12小時完成步驟③后，取出固相芯片，用乙醇沖洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS緩沖液中，室溫反應lh。戊二醛溶液:溶質為戊二醛，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為2.5%。乙二胺溶液:溶質為乙二胺，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為10%。NaBH4溶液:溶質為NaBH4,溶劑為乙醇，溶質的濃度為10mg/ml。
[0034]所述“連接有鏈霉親和素和標記物的探針”的制備方法具體如下:①合成探針，在5’末端進行巰基修飾，在3’末端進行標記物修飾，命名為SH-DNA-標記物；②在10 μ I ImMSH-DNA-標記物中加入0.67 μ L TCEP溶液，避光室溫反應lh，以活化巰基；③取Amicon_3K，加入完成步驟②后得到的整個反應體系，再加入200μ L Buffer A_l，然后12000rpm離心1min,用buffer A-2洗漆Amicon_3K,收集分子量大于3K的組分(溶液形式)；④取133 μ L 20mg/mL鏈霉親和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩渦震蕩5min，然后室溫反應lh, 12000rpm離心5min,取上清液；⑤取Amicon-1OK,加入步驟④得到的上清液,再加入200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 離心 1min,用 buffer A-2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于1K的組分(溶液形式)；⑥將步驟⑤得到的溶液加入步驟③得到的溶液中，避光室溫反應48h ;⑦取Amicon-lOK，加入完成步驟⑥后得到的整個反應體系，再加入200 μ L BufferA-1,12000rpm離心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的組分(溶液形式)，即為含有連接有鏈霉親和素和標記物的探針溶液。TCEP溶液:溶質為TCEP，溶劑超純水，溶質的濃度為30mM。Buffer A-1:含0.1M NaCl和0.1M磷酸鈉的水溶液，pH7.3。Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M 磷酸鈉和 0.05% (體積比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0035]所述“表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠”的制備方法包括如下步驟:①將38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0,0.1M的甲基咪唑緩沖液，然后加入0.65nmol所述核酸適配體，充分混合，得到混合液；②將步驟①得到的混合液加入約20mg磁珠中，室溫搖勻反應24小時，然后磁分離并收集磁珠，用2毫升預雜交緩沖液對磁珠表面未反應的羧基進行封閉，得到表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠。預雜交緩沖液:溶劑為pH7.4、0.1M的Tris緩沖液，含0.005M EDTA.0.5% (體積比)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mLBSA。
[0036]所述功能磁珠的制備方法具體包括如下步驟:①取約20mg表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠，用2mL雜交緩沖液懸浮，在60°C水浴中溫浴Ih ;②取10 μ L含有連接有鏈霉親和素和標記物的探針溶液，溶于2mL雜交緩沖液中，在60°C水浴中溫浴Ih ;③將步驟①得到的磁珠懸浮液和步驟②得到的溶液混合，室溫搖勻反應2.5h，得到功能磁珠懸浮液。雜交緩沖液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2的水溶液，pH
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[0037]所述標記物具體可為熒光標記物，更具體可為Cy5.5。所述與標記物相應的的激發(fā)波長具體可為650nm。
[0038]所述磁珠具體可為羧基磁珠。
[0039]所述固相芯片具體可為光纖。
[0040]所述靶標物質為赭曲霉素A。
[0041]所述核酸適配體具體如序列表的序列I所示。所述探針具體如序列表的序列2所
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[0042]本發(fā)明的目的在于提出一種高穩(wěn)定高重復使用的核酸適配體探針熒光傳感分析方法。本發(fā)明的主要特征在于:以核酸適配體為生物識別探針，固相傳感，激光誘導熒光，高穩(wěn)定重復使用次數(shù)。具體而言(見圖1):將核酸適配體固定在磁珠表面，并且雜交上一段互補鏈，這段互補DNA鏈綴合了鏈霉親和素和熒光標記物。同時，在固相芯片界面修飾脫硫生物素。當系統(tǒng)中存在目標污染物時，互補鏈被競爭下來，并且與在固相界面修飾的脫硫生物素結合，熒光物質被激發(fā)，獲得的信號與系統(tǒng)中存在目標污染物成定量關系，從而達到檢測的目的。本發(fā)明方法測定目標污染物濃度具有成本低廉、簡單、快速的優(yōu)點，并保持了適配體靶標分子廣泛、特異性好且靈敏度高的優(yōu)點，可穩(wěn)定使用300次以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0043]圖1為本發(fā)明提供的方法的原理示意圖。
[0044]圖2為實施例1的步驟一的流程示意圖。
[0045]圖3為實施例1的步驟二的流程示意圖。
[0046]圖4為實施例1的步驟三的流程示意圖。
[0047]圖5為實施例2的結果。
[0048]圖6為實施例3的結果。
【具體實施方式】
[0049]以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重復實驗，結果取平均值。實施例中所用的PBS緩沖液，如無特殊說明，均為pH7.4、1mM的PBS緩沖液。脫硫生物素:sigma，貨號為D1411。鏈霉親和素::Thermo，貨號為prod#21135。赭曲霉素A:pribolab，貨號為IAC-040-3。APTS的全稱為“(3-氨基丙基)三乙氧基硅烷”。TCEP的中文全稱為“(三(2-羧乙基)膦”,英文全稱為“Tris (2-carboxyethyl) phosphine) ”。Sulfo-SMCC的中文全稱為“4-(N-馬來酰亞胺甲基)環(huán)己烷-1-羧酸磺酸基琥珀酰亞胺酯鈉鹽”。
[0050]DNA分子甲為特異性結合赭曲霉素A的核酸適配體，其核苷酸序列(序列表的序列 I)為 5-NHo-AcGATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA~3，。DNA 分子乙為與DNA分子甲部分互補的單鏈DNA分子，其核苷酸序列(序列表的序列2)為5，-AAAAAAAAAAAATGTCCGATGCTC-3?。
[0051]用于本實施例的倏逝波檢測儀器(全光纖倏逝波生物傳感器)見專利ZL200610089497.4(CN1873450A)。
[0052]實施例1、試劑盒的制備
[0053]一、表面修飾有脫硫生物素的光纖的制備
[0054]流程示意圖見圖2。
[0055]1、取光纖，使其表面羥基化。
[0056]具體方法:(I)將光纖(570/600/900，購于南京春輝科技實業(yè)有限公司)浸入piraha溶液(98賺H2SO4:H2O2 = 3:1，體積比)并120°C反應Ih ； (2)完成步驟(1)后，取出光纖，用超純水清洗直到pH值為中性，在室溫下用氮氣吹干，然后置于70°C真空干燥箱中保存Ih。
[0057]2、完成步驟I后，取光纖，使其表面修飾APTS。
[0058]具體方法:(I)完成步驟I后，取光纖，置于APTS溶液中反應Ih ; (2)完成步驟(1)后，取出光纖，用無水甲苯?jīng)_洗，在室溫下用氮氣吹干，然后置于200°C烘烤lh。APTS溶液:溶質為APTS，溶劑為無水甲苯，溶質的濃度為2% (體積比)。
[0059]3、完成步驟2后，取光纖，使其表面修飾脫硫生物素。
[0060]具體方法:(I)完成步驟2后，取光纖，置于戊二醛溶液中室溫反應lh，然后用乙醇沖洗，然后置于乙二胺溶液中室溫反應1.5h,然后置于NaBH4溶液中室溫反應15min ； (2)取25mg脫硫生物素、50mg EDC和50mg NHS，用1000 μ I DMF溶解，室溫反應3h (混合旋轉)，然后加入200 μ I ρΗ8.7、IM的NaHCO3-Na2CO3緩沖液并混勻，得到混合液；⑶完成步驟(1)后，取出光纖，加入步驟(2)得到的混合液中，室溫反應12小時；(4)完成步驟(3)后，取出光纖，用乙醇沖洗，然后置于含2mg/mL BSA的PBS緩沖液中，室溫反應lh。
[0061]戊二醛溶液:溶質為戊二醛，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為2.5%。
[0062]乙二胺溶液:溶質為乙二胺，溶劑為乙醇，溶質的體積百分比濃度為10%。
[0063]NaBH4溶液:溶質為NaBH4,溶劑為乙醇，溶質的濃度為10mg/ml。
[0064]二、制備連接有鏈霉親和素和熒光標記物的探針
[0065]流程示意圖見圖3。
[0066]1、合成DNA分子乙，在5’末端進行巰基修飾，在3’末端進行Cy5.5修飾，命名為SH-DNA-Cy5.5。
[0067]2、在ΙΟμΙ 1禮3!?)嫩-075.5中加入0.67 4 1^1^?溶液，避光室溫反應111，以活化巰基。TCEP溶液:溶質為TCEP，溶劑超純水，溶質的濃度為30mM。
[0068]3、取Amicon-3K(Amicon，貨號為UFC500396-1)，加入完成步驟2后得到的整個反應體系，再加入200 μ L Buffer A_l,然后12000rpm離心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-3K,收集分子量大于3K的組分(溶液形式)。
[0069]Buffer A-1:含 0.1M NaCl 和 0.1M 磷酸鈉的水溶液，pH7.3。
[0070]Buffer A-2:含 0.1M NaCl、0.1M磷酸鈉和 0.05% (體積比)Tween 20 的水溶液，ρΗ7.3。
[0071]4、取133yL 20mg/mL鏈霉親和素水溶液，加入0.33mg Sulfo-SMCC，漩渦震蕩5min,然后室溫反應lh, 12000rpm離心5min,取上清液。
[0072]5、取Amicon-lOK (Amicon，貨號為UFC501096-1)，加入步驟4得到的上清液，再加A 200 μ L Buffer A_l, 12000rpm 離心 1min,用 buffer A-2 洗漆 Amicon-lOK,收集分子量大于10K的組分(溶液形式)。
[0073]6、將步驟5得到的溶液加入步驟3得到的溶液中，避光室溫反應48h。
[0074]7、取Amicon-lOK，加入完成步驟6后得到的整個反應體系，再加入200μ L BufferA-1,12000rpm離心1min,用buffer A-2洗漆Amicon-lOK,收集分子量大于10K的組分(溶液形式)，命名為STV-p1be-Cy5.5溶液。以鏈霉親和素計，STV-probe-Cy5.5溶液的濃度為 200mg/mL。
[0075]三、制備表面修飾核酸適配體的磁珠
[0076]流程示意圖見圖4。
[0077]1、取 ImL 羧基磁珠(Bangs Laboratories Inc, B1Mag BP618 ;懸浮液形式，磁珠濃度為20.3mg/ml)，磁分離并棄去上清，用DEPC水洗滌磁珠2_3次(每次清洗后均經(jīng)磁分離棄去上清液)。
[0078]2、將38.4mg EDC溶于2mL pH 7.0、0.1M的甲基咪唑緩沖液，然后加入0.65nmolDNA分子甲，充分混合，得到混合液。
[0079]3、將步驟2得到的混合液加入步驟I得到的磁珠中，室溫搖勻反應24小時，然后磁分離并收集磁珠，用2毫升預雜交緩沖液對磁珠表面未反應的羧基進行封閉(室溫孵育4h)，得到磁珠-核酸適配體綴合物混合液。
[0080]預雜交緩沖液:溶劑為ρΗ7.4、0.IM的Tris緩沖液，含0.005Μ EDTA、0.5% (體積t匕)N-月桂酰肌氨酸和lg/100mL BSA。
[0081]四、磁珠-核酸適配體綴合物與STV-probe_Cy5.5的雜交
[0082]流程示意圖見圖4。
[0083]1、取2mL步驟三制備的磁珠_核酸適配體綴合物混合液(含約20mg磁珠)，磁分離后棄去上清，用雜交緩沖液洗滌三次，然后用2mL雜交緩沖液懸浮，在60°C水浴中溫浴lh。
[0084]2、取10μ L步驟二得到的STV-probe-Cy5.5溶液，溶于2mL雜交緩沖液中，在60°C水浴中溫浴lh。
[0085]3、將步驟I得到的磁珠懸浮液和步驟2得到的溶液混合，室溫搖勻反應2.5h，得到功能磁珠懸浮液。
[0086]雜交緩沖液:含1mM Tris、120mM NaCl、5mM KCl、20mM CaCl2 的水溶液，pH 8.5。
[0087]實施例2、檢測赭曲霉素A
[0088]采用DMF為溶劑，制備lmg/mL的赭曲霉素A儲備液。
[0089]1、取實施例1的功能磁珠懸浮液(含約20mg磁珠)，用含2mg/mL BSA的PBS緩沖液清洗兩遍，棄去上清液。
[0090]2、完成步驟I后，取磁珠，加入赭曲霉素A儲備液，加入含2mg/mL BSA的PBS緩沖液，使反應體系的總體積為350yL,混勻15min。赭曲霉素A儲備液設置不同的加入量，使得反應體系的初始時刻赭曲霉素A的濃度為6.4nM、38.2nM、95.4nM、158.7nM、222.6nM、445.3nM、635.0nM、1269.6nM、3174.9nM 或 3710.0nM,每個濃度設置三個重復。
[0091]3、完成步驟2后，進行磁分離，收集上清液(待測溶液)。
[0092]4、全光纖倏逝波生物傳感器的操作規(guī)程:打開激發(fā)器，激發(fā)波長為650nm ;以PBS緩沖液沖洗實施例1的步驟一制備的光纖直至基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，取步驟3得到的待測溶液，開啟螺動泵進樣25s,之后停止螺動泵,使待測溶液在反應池內反應120s ;再次開啟蠕動泵，通入洗脫液(0.5g/100mL SDS水溶液，調pH至1.9)90秒；最后通入PBS緩沖液，
至基線平穩(wěn)。
[0093]在一個待測溶液的檢測完成后，利用洗脫液和pH7.4,0.1M的PBS緩沖液交替沖洗實施例1的步驟一制備的光纖，使STV-probe-Cy5.5從實施例1的步驟一制備的光纖上脫落下來，然后進行下一個待測溶液的檢測，通過這種檢測方法能夠將傳統(tǒng)的DNA結合洗脫過程轉化成蛋白質的洗脫過程，從而達到很高的穩(wěn)定重復應用次數(shù)。
[0094]結果見圖5，對赭曲霉素A的檢出限為12nM(4.9ng/mL)，線性范圍為12ηΜ_32μΜ。
[0095]實施例3、實施例1的步驟一制備的光纖的可重復利用次數(shù)
[0096]采用DMF為溶劑，制備lmg/mL的赭曲霉素A儲備液。
[0097]1、取實施例1的功能磁珠懸浮液(含約20mg磁珠)，用含2mg/mL BSA的PBS緩沖液清洗兩遍，棄去上清液。
[0098]2、完成步驟I后，取磁珠，加入赭曲霉素A儲備液，加入含2mg/mL BSA的PBS緩沖液，使反應體系的總體積為350 μ L (反應體系的初始時刻赭曲霉素A的濃度為3 μ Μ),混勻15min。
[0099]3、完成步驟2后，進行磁分離，收集上清液(待測溶液)。
[0100]4、全光纖倏逝波生物傳感器的操作規(guī)程:打開激光器，激發(fā)波長為650nm ;以PBS緩沖液沖洗實施例1的步驟一制備的光纖直至基線平穩(wěn)；基線平穩(wěn)后，取步驟3得到的待測溶液，開啟螺動泵進樣25s,之后停止螺動泵,使待測溶液在反應池內反應120s ;再次開啟蠕動泵，通入洗脫液(0.5g/100mL SDS水溶液，調pH至1.9) 90秒；最后通入PBS緩沖液，
至基線平穩(wěn)。
[0101]重復對步驟3得到的待測溶液進行檢測。在一個待測溶液的檢測完成后，利用洗脫液和pH7.4、0.1M的PBS緩沖液交替沖洗實施例1的步驟一制備的光纖，使STV-probe-Cy5.5從實施例1的步驟一制備的光纖上脫落下來，然后進行下一個待測溶液的檢測，通過這種檢測方法能夠將傳統(tǒng)的DNA結合洗脫過程轉化成蛋白質的洗脫過程，從而達到很高的穩(wěn)定重復應用次數(shù)。
[0102]結果見圖6。本發(fā)明中涉及的光纖可重復使用至少300次。
【權利要求】
1.一種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的方法，包括如下步驟: (1)將功能磁珠與所述待測樣本共孵育；所述功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；所述(a)為表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；所述(b)為連接有鏈霉親和素和標記物的探針；所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子； (2)完成步驟(1)后，進行磁分離，收集上清液； (3)在與標記物相應的的激發(fā)波長激發(fā)下，采用表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片檢測步驟(2)得到的上清液，根據(jù)信號值判斷待測樣本中是否含有靶標物質。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于:所述表面修飾有脫硫生物素的固相芯片的制備方法包括如下步驟: (1)取固相芯片，使其表面羥基化； (2)完成步驟(1)后，取固相芯片，使其表面修飾APTS; (3)完成步驟(2)后，取固相芯片，使其表面修飾脫硫生物素。
3.如權利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述固相芯片為光纖。
4.如權利要求1至3中任一所述的方法，其特征在于:所述靶標物質為赭曲霉素A。
5.如權利要求1至4中任一所述的方法，其特征在于:所述磁珠為羧基磁珠。
6.如權利要求1至5中任一所述的方法，其特征在于:所述核酸適配體如序列表的序列I所示，所述探針如序列表的序列2所示。
7.—種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的試劑盒，包括功能磁珠和表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片；所述功能磁珠是將(a)和(b)雜交得到的；所述(a)為表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠；所述(b)為連接有鏈霉親和素和標記物的探針；所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子。
8.—種檢測待測樣本中是否含有靶標物質的試劑盒，包括“表面修飾有脫硫生物素或生物素的固相芯片”、“表面修飾有特異識別靶標物質的核酸適配體的磁珠”和“連接有鏈霉親和素和標記物的探針”;所述探針為與所述核酸適配體部分互補的單鏈核酸分子。
9.如權利要求7或8所述的試劑盒，其特征在于:所述固相芯片為光纖；所述磁珠為羧基磁珠。
10.如權利要求7至9中任一所述的方法，其特征在于:所述靶標物質為赭曲霉素A;所述核酸適配體如序列表的序列I所示，所述探針如序列表的序列2所示。
【文檔編號】C12Q1/68GK104178568SQ201410360025
【公開日】2014年12月3日 申請日期:2014年7月25日 優(yōu)先權日:2014年7月25日
【發(fā)明者】周小紅, 向宇, 王若瑜, 施漢昌 申請人:清華大學