尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)、引物及其用途
【專利摘要】本發(fā)明公開了尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)、引物及其用途，尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)包括10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，其序列分別如SEQ?ID?NO：1-SEQ?ID?NO：10所示。所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，其序列分別如SEQ?ID?NO：11-SEQ?ID?NO：30所示。所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)或者所述的引物的用途，包括分子生態(tài)學(xué)研究，譜系分析，種質(zhì)資源調(diào)查，輔助育種和個(gè)體識(shí)別，所述10對(duì)引物在15個(gè)尖嘴魟個(gè)體中的基因分型結(jié)果顯示，等位基因數(shù)為3-24個(gè)，平均等位基因數(shù)為13.6個(gè)。期望雜合度He為0.5-0.984，觀測(cè)雜合度Ho為0.429-1，表明這10對(duì)引物多態(tài)性高，可以滿足尖嘴魟的個(gè)體識(shí)別。
【專利說明】尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)、引物及其用途
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及，尤其涉及的是一種尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)序列、引物及其用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 尖嘴魟（Dasyatis zugei)隸屬鲼形目、魟科，是一種生活在近海區(qū)域的軟骨魚。受 到污染、過度捕撈、漁業(yè)養(yǎng)殖等影響，目前種群數(shù)量日益減少，亟待保護(hù)。對(duì)其保護(hù)需要了解 其種群結(jié)構(gòu)及遺傳背景等遺傳學(xué)信息，目前國內(nèi)尚沒有開展軟骨魚的分子遺傳學(xué)研究。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，首次提供尖嘴魟的微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物，也是目前國 內(nèi)首次針對(duì)軟骨魚類的分子遺傳學(xué)研究結(jié)果。
[0004] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：
[0005] 尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)，包括10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，其序列分別如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO :10 所示。
[0006] 所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，其序列分別如SEQ ID NO :11-SEQ ID NO :30所 /_J、1 o
[0007] 所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)或者所述的引物的用途，包括分子生態(tài)學(xué)研究，譜系分 析，種質(zhì)資源調(diào)查，輔助育種和個(gè)體識(shí)別，所述10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)組合使用，或 者其對(duì)應(yīng)的引物組合使用。
[0008] 所述10對(duì)引物在15個(gè)尖嘴魟個(gè)體中的基因分型結(jié)果顯示，等位基因數(shù)為3-24 個(gè)，平均等位基因數(shù)為13. 6個(gè)。期望雜合度He為0. 5-0. 984,觀測(cè)雜合度Ho為0. 429-1， 表明這10對(duì)引物多態(tài)性高，可以滿足尖嘴魟的個(gè)體識(shí)別。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0009] 圖1尖嘴魟DNA 1 %瓊脂糖-EB凝膠電泳結(jié)果；M :Trans2K DNA Marker ; 1-4 :尖嘴 魟全基因組DNA ;Y :空白對(duì)照；
[0010] 圖2 AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物1%瓊脂糖-ΕΒ凝膠電泳結(jié)果；M :Trans2K DNA Marker ;1-8 : AFLP擴(kuò)增產(chǎn)物；Y :空白對(duì)照；
[0011] 圖3菌落PCR 2 %瓊脂糖-EB凝膠電泳結(jié)果；M :Trans2K DNA Marker (同圖2); 1-8 :菌落PCR結(jié)果，其中2、6、7和8號(hào)為雙帶，被認(rèn)為陽性重組子；Y:空白對(duì)照；
【具體實(shí)施方式】
[0012] 以下結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說明。
[0013] 1、DNA 抽提
[0014] 利用尖嘴魟肌肉組織，提取基因組DNA。抽提方法采用SDS/蛋白酶K裂解、酚-氯 仿抽提途徑（Sambrook et al. ,1999)。DNA抽提效果見圖1(展示部分）·
[0015] 2、尖嘴魟微衛(wèi)星富集文庫的構(gòu)建
[0016] 取基因組DNA 250ng左右，使用限制性內(nèi)切酶Msel打斷，同時(shí)與Msel的AFLP受 體接頭（5'_TAC TCA GGA CTC AT-3' /5' -GAC GAT GAG TCC TGA G-3'）進(jìn)行連接。將消 化產(chǎn)物稀釋十倍以后，使用AFLP受體特異的引物（5'-GAT GAG TCC TGA GTA AN-3'，簡(jiǎn)稱 Msel-N)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物使用1%瓊脂糖-EB凝膠檢測(cè)，結(jié)果為大于200bp的彌散 帶，見圖2。
[0017] 分別使用帶有生物素接頭的探針仏〇12和（AG)12與上述PCR擴(kuò)增片段進(jìn)行雜交 后，使用鏈霉親和素磁珠進(jìn)行吸附洗脫，以獲得所需的單鏈微衛(wèi)星重復(fù)序列。以捕獲的DNA 為模板，以Msel-N為引物進(jìn)行雙鏈DNA恢復(fù)。PCR產(chǎn)物經(jīng)PCR清潔試劑盒（Axygen)純化， 并用1%瓊脂糖-EB凝膠檢測(cè)，結(jié)果為大于200bp的彌散帶則視為成功。
[0018] 將純化后的雙鏈恢復(fù)產(chǎn)物與 pEASY-Tl Simple Cloning Vector (TransGen Biotech)連接后轉(zhuǎn)化于 Trans5 a chemically competent cells (TransGen Biotech) 中。將已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞涂布于添加 0. 5mM IPTG和0. 5yg/mL X-Gal含0. 06mg/ml氨 芐（Amp)的LB固體培養(yǎng)基平板上，在恒溫培養(yǎng)箱中37°C培養(yǎng)13h，得到包含AC、AG兩種重 復(fù)的微衛(wèi)星文庫。
[0019] 3、陽性克隆的篩選、測(cè)序及引物設(shè)計(jì)
[0020] 挑取白色飽滿的菌落置于Amp+LB液體培養(yǎng)基中擴(kuò)大培養(yǎng)（37°C，5h)。采用三引 物PCR法（Zane et al，2002)檢測(cè)含有微衛(wèi)星片段的陽性重組子。實(shí)驗(yàn)中選用M13載體通 用引物（M13-47)和克隆對(duì)應(yīng)的無生物素標(biāo)記的探針仏〇 12八八6)12進(jìn)行反應(yīng)。如果產(chǎn)物在 2%瓊脂糖-EB凝膠電泳結(jié)果中出現(xiàn)兩條或兩條以上的條帶，則認(rèn)為該單克隆含有目的序 列，見圖3 (展示部分）。通過三引物法成功檢驗(yàn)出有目的序列的陽性重組子107個(gè)，對(duì)這些 重組子的質(zhì)粒使用M13通用引物進(jìn)行測(cè)序。
[0021] 4、序列分析、引物設(shè)計(jì)及微衛(wèi)星位點(diǎn)的初步篩選
[0022] 檢查測(cè)序結(jié)果，去除M13的載體序列后，使用TRF軟件（Tandem Repeats Finder, Version3. 2· 1)尋找其中含有微衛(wèi)星重復(fù)單元的序列（Benson，1999)。使用PRMER5軟件 (Lalitha，2000;Singh et al. ,1998)在重復(fù)單元序列上、下游的側(cè)翼序列中設(shè)計(jì)引物，將 目的片段設(shè)置為100_400bp之間。共選擇28個(gè)微衛(wèi)星重復(fù)位點(diǎn)作為備選標(biāo)記。
[0023] 5、基因分型數(shù)據(jù)的讀取和微衛(wèi)星位點(diǎn)的獲得
[0024] 對(duì)初選出的28個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的單側(cè)引物5'端加上熒光基團(tuán)標(biāo)記（FAM/HEX/ TAMRA)，然后使用15個(gè)尖嘴魟個(gè)體的DNA對(duì)上述微衛(wèi)星位點(diǎn)進(jìn)行擴(kuò)增篩選。首先對(duì)待選位 點(diǎn)的PCR進(jìn)行擴(kuò)增條件的優(yōu)化，循環(huán)設(shè)置為：95°C預(yù)變性5 min;95°C變性30 sec，48°C到 60°C中選擇8個(gè)溫度梯度退火30sec，72°C延伸60sec，反應(yīng)30個(gè)循環(huán)；72°C延伸10min。擴(kuò) 增產(chǎn)物使用2 %瓊脂糖-EB凝膠電泳檢測(cè)，確定出最合適的引物退火溫度。排除出現(xiàn)以下情 況的備選位點(diǎn)：在8個(gè)溫度梯度中均未得到清晰的單一條帶；擴(kuò)增結(jié)果不穩(wěn)定，在不同個(gè)體 中不具有重復(fù)性。對(duì)具有穩(wěn)定單一條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物使用Tamara500熒光分子量標(biāo)準(zhǔn)在ABI 3730DNA測(cè)序儀中使用聚丙烯酰胺凝膠進(jìn)行基因分型，基因分析的結(jié)果使用Genescan 2. 0 軟件進(jìn)行讀取。基因分型結(jié)果經(jīng)過分析后，去除出現(xiàn)下列情況的備選位點(diǎn)：無基因分型結(jié)果 的位點(diǎn)；在任一個(gè)體中等位基因數(shù)在兩個(gè)以上的位點(diǎn)；在15個(gè)野生尖嘴魟中等位基因在兩 個(gè)以下的位點(diǎn)。經(jīng)過篩選后，最終獲得10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，微衛(wèi)星序列如下所 示：
[0025] DzuI25(291bp)
[0026] ACATTGAATGACATTTAGAAATGGGAACAGAAGTGCTTGTCAGCCAACCATGAGTCTTCTTTAGATAAC AGCAACAACAAACAGCAAAACAGCAAACCAGATCCTTTCCCACACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACCACACACACACACACTCACACACACACACTCACACACACACACATACACACACACACACACACAC AGGCTATTATTTATACAAAATAGCATAGAAAGAAAGAGGCATTTATTCTCTTTTCACTCCTCACTCCT
[0027] DzuI45(520bp)
[0028] ATGGTGAAACTGAAGGAGCTGGACTTGGTGGGGATCACGCTATTGCCTGTGTTGGAGAGGCCTCGGTGT GCGAAGGTGGTGTGTAGTCCAACAGCGAGTGACTGTCTTAGTTGCTTGTCTTGTGATCACAAGACCCTGTTGGAAGT TGTTGGTGTGGAGCGCTGCAAGTCCAATTCCTGATTTATTGGCGGGGGGCGGGGGAGCTGCGTGGCCTCTGACCTGG CGAGGAGTGGGCCTCAAGCCGCAGTGTTGCCTGTTTACAGACACCCAGGAGAGAGGCATTGGAGTCGGAGGCGGCGT CAGAGCTGAAGCTGGGTGCTGCCATCTAGTGTTTGCCCAGCAGAATACAAGGTGCATGTTCGACTGCAACTGCTGCA GCATTAGCGGACTCACAGCCTTGGACTATTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGTGTCTGTGTGTGAT TGTCGGTACTGTGTCTTGGCCCCAGTACTAGCAACACTTTTGTTTGTCTGTAAACCTGGATATGGT
[0029] DzuI31(569bp)
[0030] ACTCCACCCTGCCACTTTCCCACTTGGCACAAGCTGCCATCACCCCTCCTCAGTCTGCCTATCATAGTT GCTGCATGTTTTACCTCTCCCGCTCTCCTCTTTACACTGGCCATCTTACCTCTCCAATCCTGGTCGTGACACAGGGT TTTGACCCAAAATGCCAGACCCCAGTTCCTCGATACACACAGATACTGCTTGATCACTGAGTTCATGCATCTGCATT CCGTCATATTGTAATGTGTGCGAGCAATATCTGATAACAGCATCTCCAGTGACATTGGGGGAGTGAGGGAAGTACTA ACTTTCCAATGGGGCATAAATCAAGGGGATTTACAAATACAGTCTTGTGCAAAAGTCTTACACACACACACACACAC ACACACACACACACAGAGAGCTAGGGTTTGTAAGACTTTATCTGGCAGGAGCAAAGGATGTTGGGAATGGTGAGGGT GGAGGACTGTAGGACTGGTGGTAGAGAGGAGTGACAAGACTGGGAGGGTGGTGCAGGTGCAGACACACCCAGCCCTG AGACACCAGGCAAGGTCATTTGATTCTAAACAATTGGT
[0031] DzuI46(472bp)
[0032] CGTTATGTAGGCAGTCCTGGAAACAAAGTTATAGAGAAATATCAGACAGAGGCAAAATACTTAGATGA GTCATTCCTTCAATGTCATCATTTTGCTCTTACTTTGATCGCTGAAATCTCCGGAGAAGTTGGTGAGGTATATTTC ATGTACCACAGTGGCAGAAATCGCTGCTTTCCTTCTCTTTGTGATACAGAATACATCCGTTTGATCCGTCAGAAC CATGCAGGCCCCCGACGGAGGGATTACTTACTCTCCTCACTCTATTTTTTCTGTATCCCTGTAGTTCTGCCCTCT CTCTCTCTCACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACTCTCTCTCTCTCTCTCACACACACACATCCTA CACACACACACACACACACACACACACACTCACACTCACACAGACACACACACACACACACACAAATATCCATGC CTCTTTGATTGTTTGCTGCTATGGAGAT
[0033] DzuI51(430bp)
[0034] CCCACCATGGGCAATAGAAAAGTCACTGTTGCAAACAGTGCAGCGAGCAACACTGTCATTATTTTTTAC CCCTATTAGGCAGGGGTACACTTCGGTGTAGTCTGGGGTGAAGTATGTTTTATATTTTCATTTTTTGGAACACTTTG CCATGGTTCATGTTTTCTCTCTTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACCG CATATACTGTAGCAGAGGTCCCAATACAGACTGGTTACAGACCTCCAGCCAGAACCACTACCATTGACAGCTACTTT CTATCTTCTATGGTCTGAGTCCAACATCCAAGTCACTGCAGATTGCATGCATCCTTTTCTCTGCATGAGCCCTCCAT GAGGGACCTGATCGAATAGGTTACTAAAATCCATGTAGACAACATCCTTACCT
[0035] DzuI57(720bp)
[0036] TGCCAAACAAAGTCACCCTCACTTTCCAAAACAAGAGAAAATCTGCAGATGCTCAAAATCCAAGCAACA CACACACACACACACACACACACACACACACACAAAATGCTGCAGGAACTCTGCAGGCTAGGTAGCATCCATGGAAA ATAATAAACAGTCGATGCTTCTGGCCAAGACTCCTTCGGCGCCCTCAGTTTCCCTCTGGATTTCACCCCAAGGGTTC AGGGAGTGATGATGGTTAGAACTGTTGGTCCTGAAACCCAAACCGTTTATACTGAGTAAATGCCTCGTCGCCATTGT CATTACTTTGCTAATGACTGAGGACAGACCAATCAGGTGCTAAATAGGTACATAATGGGTCTGTCATGTTTCTGTGA TCAGAACTTATCTCAGAAGCTTTATGCATGGTTGGGCAAATGTCAGTGCTGTAACTACACTGGACAGCTTGGCTAGA GATGCGACTAATACTGGAATAGAAACCTTCACCACTGCAATGGTTTCCCTTTGCCCTGTCTTATAGCCTTTACTGCA TCCTGCGCCTCTTGGCCGTTTCTTGGAGTGAAATGAGTGAGCTAAATCCTGGATACCAAGACAGCAGCTATCCCCAG GAGAAAGCATTTACTTTGAATGAAGATCGCTGTACATGGACTTATCAAAAGATGTTTGCAAATGCTGGAACAATACA AGTTTCTAACACTTAGATCAAAAGATTTTTTTTGT
[0037] DzuI71 (811bp)
[0038] ACTAACTAATGCCACATAAATACTGCATGATTATTTATCCCCTCGTGTGGCCAGTAGTCATCCGCCATC ATCTACAAATGGCCATTGAGATTCTTTTGACATAGGGAGGCCATTACCTCAAGGATTTGGCAGAGCAAGATCTTGGC AACAAGATCCAAAATGGTCAAACTGGCTCGGCTACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAC ACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAAA TTCCACCTAACTGCCCCCCATCTGTCAGACACTACCCTCTCAACTTCCTCCCCTTTCACTTGACCCCTTCCTTTCTC CCTCTTTCTTCTTCCGAATCCGGCCTCCTCCTCTCCATTTGCCAGGAGCCTGCTCCCTCTGATAATCACAGGTGTTC AGTTTATTAGTGTCTGCTTCCCAACTGCACGATACTTCCCCATTACAACTGGTCCCCAAAGTTACACCACCGCAGAA TTTCTGAAATTTCCCCAGAAAACCACAGGATGTTCTGCAAGTGACTACCCAAAGCCGCTCAACGTTGGCAGATGGTG GTTTCTTGGTGCTCTGTTGGTGGAGGACATGTGGGTTTTGAGGGAAAGGGTAGTGTGTGGAAGGCAGAGTTTAAGAT CATTGTATATGCTGAGCGATCCGATGATGAGCAATGAGGGACCCTCACTCCTGCAGAATGTAATCTCCTTCACAGTT AGGACTTACCAAAACCTTCACAGAGAGCTGAAAGAATGTTTGGTTTTGT
[0039] DzuI82(352bp)
[0040] CAAATAAAGGCGCCCTATACACACAGACAAGCTAAATCACACACACACACACACAATCTATAAATATTC TCTCTCCCTCACTCACTCACTCACACACATACACTACAGACATAGGCAGACTATCTCTCTTTTTCACCCACCTATCC CACCCCCTCTATACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACACAGTTGGAAGGAGACACA AATGAAATATAACGGGAAGTAACTCAATACAACTCTATCTTCGTTTATCACAGACACAATGGGACGAACCGTCTCCT CTGTGTGCGTCGGATTTCAAATATACAGAGATGCGTACACGATAAACCAGAT
[0041] DzuII15(410bp)
[0042] GGATAGTTCACGATAATACGGTATATATCCTGGAATGTAGAACGCAGCGGTACAACAGGTGGTGCTGCT GCATGACCTCCAGTGTCTAGCATTTGACCCTGACTTTGGATGCAAACTGTCTCCCTGTAGCTGCAAGGGTTTCTGCC AGATGCACTGCATTCCTGCCTTATCCCAAAGTTGTGCTGGCAGGTTAGCTGGCTGTTGTAAATTGCCGAGAGAGAGA GAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGTGTG TGTGTGTGTTGGCACGTGGCCTAGTGGGCAAGGCATCAGACTAGTAACCTGAAGGTCACAGGTTCAAGCCTCAGCTG AGGCAGCGAGTGTGTGTCCTTGAGCAAGGCAGT
[0043] DzuII64 (649bp)
[0044] CTATTTATGCCTGCCAGCATCTTTTATATCTACTTCTATACATGTAACTGTTCAGTATTTTTCCCAGTG GTCGCAGGATACATATATAAATGTTCTGCATTTCTCCTACTGATTACATTTGTATCATTCTGGAAAGCTCTGGAAGT TTCTCCGGTGTTGCATTATTTGTATAGGGGCTATCTGATTGGTTGACTCTTATCTACAGATTTGAATGAAATGTTCC TCATCTATGGGGGTTCAAAAAGCTCCTTGCTTCTCTCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTCCCTCTCTCTCTCTC TCTCTCTCTCCCTCTGCCCCTCTTACTGCCGGATTTCAATTTTCTTTCTTTCATTAGTGCTCCATAAAATGACAGGG AGGCAAGAAGTTTTGTGCCTCTTCCTGACTTCCGAAAGAATCTTGGATAAAATATATCAGAGTCCACGTGACACTGT CTGAGCGGAGCTTGTGCGTCCCCCCCAGGACCACGACGGTTCCCTCTGGGTTCTCTGGATCGCCCCTACTTCCGAAG ACATACGGATTCAAGTTGGTCCGGTGGCATTGTGAACATTCTTTGCTGTGATTCGCCCTCCGAACAGTCTGTGTCAG TGGTGACTCACCGAGTGCCTCCTCCATTCATCCCTGTCGGT
[0045] 10個(gè)位點(diǎn)的引物序列如下表1所示：
[0046] 表110個(gè)位點(diǎn)的引物序列
[0047]
[0048]
【權(quán)利要求】
1. 一種尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)，包括10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi)星位點(diǎn)，其序列分別如SEQ ID NO :1-SEQ ID NO :10 所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)的引物，其序列分別如SEQ ID NO: 11-SEQID NO :30 所示。
3. 權(quán)利要求1所述的尖嘴魟微衛(wèi)星位點(diǎn)或者權(quán)利要求2所述的引物的用途，包括分子 生態(tài)學(xué)研究，譜系分析，種質(zhì)資源調(diào)查，輔助育種和個(gè)體識(shí)別，所述10個(gè)穩(wěn)定的多態(tài)性微衛(wèi) 星位點(diǎn)組合使用，或者其對(duì)應(yīng)的引物組合使用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104087584SQ201410345130
【公開日】2014年10月8日 申請(qǐng)日期:2014年7月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月21日
【發(fā)明者】張潔, 陳驍, 張保衛(wèi), 王慧 申請(qǐng)人:張潔