一種蛻皮激素受體基因EcR dsRNA及其在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種蛻皮激素受體相關(guān)基因EcR?dsRNA在控制蚜蟲危害中的應(yīng)用。本發(fā)明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的雙鏈RNA。本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到麥長管蚜蛻皮激素受體相關(guān)基因EcR?cDNA的dsRNA，采用體外飼喂dsRNA方法，可抑制麥長管蚜體內(nèi)EcR基因的表達(dá)，導(dǎo)致麥蚜生長發(fā)育受阻并產(chǎn)生致死效應(yīng)。
【專利說明】-種蛻皮激素受體基因 EcR dsRNA及其在控制蚜蟲危害中 的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種蛻皮激素受體基因 EcR dsRNA及其在控 制蚜蟲危害中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 麥蚜（尤其是麥長管蚜）是危害中國小麥生產(chǎn)的主要害蟲之一，據(jù)統(tǒng)計，中國每年 小麥蚜蟲危害面積可高達(dá)〇. 17億公頃，占小麥總種植面積的62%，造成減產(chǎn)15%-30%，嚴(yán) 重時可高達(dá)50%。近年來，由于全球氣候變暖、耕作制度變化等因素，使蚜蟲的繁殖能力和 適應(yīng)性顯著增強，其危害日趨嚴(yán)重。目前，蚜蟲防治以噴灑農(nóng)藥為主，但大量使用農(nóng)藥，不僅 對人畜有害，而且造成了嚴(yán)重的環(huán)境污染。培育抗蚜蟲小麥和蔬菜品種是防止蚜蟲危害的 最有效途徑，但由于現(xiàn)有種質(zhì)資源中缺乏有效的抗蚜基因，抗性機制尚不明確，常規(guī)育種難 以奏效。挖掘和利用新型抗蚜基因并通過基因工程培育小麥抗蚜新種質(zhì)具有重要意義。
[0003] 植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)已成為農(nóng)作物抗蟲基因工程的熱點之一，通過寄主植物表 達(dá)相應(yīng)昆蟲特異基因的dsRNA，昆蟲取食植物后沉默其相應(yīng)的基因從而達(dá)到控制害蟲危 害的目的。RNAi現(xiàn)象其作用過程是雙鏈RNA(dsRNA)進(jìn)入生物體內(nèi)，被Dicer酶切割成 21-23nt的siRNA，siRNA與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物結(jié)合，與互補序列的靶mRNA結(jié)合，被Dicer 識別，造成靶基因表達(dá)量的下降。近年來，利用dsRNA體外飼喂或注射來篩選RNA靶標(biāo)基 因，導(dǎo)致靶標(biāo)基因表達(dá)和沉默，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于昆蟲生長發(fā)育關(guān)鍵基因的鑒定和功能分析。 孟山都公司通過植物介導(dǎo)的昆蟲腸道特異基因 RNAi技術(shù)成功獲得了抗玉米根螟的轉(zhuǎn)基因 玉米，有效緩解了長期應(yīng)用Bt轉(zhuǎn)基因玉米誘發(fā)昆蟲產(chǎn)生抗性等問題，目前已完成生產(chǎn)性試 驗。棉鈴蟲腸道中特異P450基因可提高棉鈴蟲幼蟲對棉花次生代謝物質(zhì)和棉酚的耐受性， 試驗表明，利用表達(dá)棉鈴蟲P450基因 dsRNA的轉(zhuǎn)基因煙草和棉花葉片飼喂棉鈴蟲幼蟲，可 導(dǎo)致幼蟲體內(nèi)P450基因的表達(dá)量下降，同時幼蟲發(fā)育受阻，表現(xiàn)出抗棉鈴蟲性能；Zha等從 褐飛虱中腸中克隆了 3個高度表達(dá)的基因：NlHTl、Nlcar和Nltry，構(gòu)建載體，轉(zhuǎn)化水稻，褐 飛虱取食轉(zhuǎn)基因水稻后，體內(nèi)3種基因的mRNA表達(dá)水平下降了 40%到70%，并且在水稻的 篩管部發(fā)現(xiàn)了 dsRNA和siRNA的存在。Pitino等將桃蚜的MpC002 (主要在唾液腺中表達(dá)） 和Rack-Ι (主要在腸道中表達(dá)）2個基因分別導(dǎo)入煙草和擬南芥中，用轉(zhuǎn)基因植物飼喂桃 蚜，導(dǎo)致桃蚜體內(nèi)的MPC002或Rack-Ι的表達(dá)量降低了高達(dá)60%，蚜蟲的產(chǎn)仔數(shù)目減少。
[0004] 小麥抗蚜蟲種質(zhì)資源缺乏，抗性機制尚不明確，常規(guī)育種難以奏效，每年給農(nóng)業(yè)生 產(chǎn)造成巨大經(jīng)濟損失。迫切需要挖掘和鑒定新型抗蚜基因并通過基因工程育種提高小麥抗 蚜特性。
[0005] 蚜蟲是不完全變態(tài)發(fā)育，發(fā)育過程中要經(jīng)歷蛻皮。已知蛻皮激素與它的核受 體EcR和異源二聚體配體USP在細(xì)胞核內(nèi)形成轉(zhuǎn)錄復(fù)合體，調(diào)控EcR和USP激素接受子 3 (HR3)，E75, Broad Complex (BR-C)，E93, bFTZ-Fl和E74等轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，這些轉(zhuǎn)錄因子 再進(jìn)一步調(diào)控下游效應(yīng)基因如蛋白酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控蚜蟲的蛻皮、生長發(fā)育和繁殖。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006] 本發(fā)明的一個目的是提供了 dsRNA。
[0007] 本發(fā)明提供的dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示 的核苷酸組成的雙鏈RNA。
[0008] 上述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段也是本發(fā)明保護(hù)的范圍，上 述dsRNA的編碼基因具體為序列表中序列1所示的核苷酸。
[0009] 上述dsRNA或上述的編碼基因在如下1)_4)中至少一種中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù) 的范圍：
[0010] 1)防治蚜蟲或制備防治蚜蟲產(chǎn)品；
[0011] 2)促進(jìn)蚜蟲死亡或制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品；
[0012] 3)抑制蚜蟲生長中或制備抑制蚜蟲生長產(chǎn)品；
[0013] 4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因 ECR的表達(dá)或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育 相關(guān)基因 ECR的表達(dá)產(chǎn)品。
[0014] 上述應(yīng)用為將上述dsRNA導(dǎo)入蚜蟲，實現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長 和/或抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因 ECR的表達(dá)；所述導(dǎo)入具體為飼喂；
[0015] 所述蚜蟲具體為麥長管蚜。
[0016] 本發(fā)明的另一個目的是提供具有功能的產(chǎn)品，其活性成分為上述dsRNA或其編碼 基因；
[0017] 所述功能為如下1)-4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進(jìn)蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲 生長；4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因 EcR(序列1)表達(dá)。
[0018] 所述蚜蟲具體為麥長管蚜。
[0019] 本發(fā)明的實驗證明，本發(fā)明得到麥長管蚜蛻皮相關(guān)基因 EcR的dsRNA，采用體外飼 喂dsRNA方法，進(jìn)行了利用RNAi技術(shù)沉默麥長管蚜體內(nèi)EcR基因，導(dǎo)致麥長管蚜產(chǎn)生致死 效應(yīng)，并且隨著dsRNA濃度增大和飼喂時間延長，麥長管蚜的死亡率均逐漸增加。結(jié)果表明 蚜蟲生長發(fā)育相關(guān)基因 EcR的保守序列可應(yīng)用于通過植物介導(dǎo)的RNAi技術(shù)提高小麥抗蚜 性的研究。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020] 圖1為基因 EcR和GFP的PCR擴增情況
[0021] 圖2為目的基因和對照基因的dsRNA
【具體實施方式】
[0022] 下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0023] 下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0024] 下述實施例中麥長管蚜（錢幼亭，周廣和，張淑香，張向才.麥長管蚜有性世代的 研究.植物保護(hù)，1982, 1:14-15。公眾可從中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所獲得）由中國 農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，飼養(yǎng)蚜蟲的小麥品種為科農(nóng)199,將蚜蟲接種到小麥幼苗 上，放入人工氣候箱中（溫度（20±2)°C，濕度60%-80%，光周期L : D = 16 : 8)進(jìn)行 繁殖。
[0025] 質(zhì)粒提取試劑盒購自Biomega公司，內(nèi)切酶BamH I、EcoR V及Hiscribe T7體外 轉(zhuǎn)錄試劑盒購自NEB公司，大腸桿菌菌株DH5 α、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司，rTaq DNA 聚合酶購自 TaKaRa 公司，MinElute PCR Cleaning Kit、MinElute Gel Extraction Kit、RNA Cleaning Kit購自Qiagen公司，各種氨基酸及其它試劑均購自北京拜爾迪公司。
[0026] 實施例1、生長發(fā)育相關(guān)基因 EcR dsRNA的獲得
[0027] 1、麥長管蚜總RNA的提取和cDNA的合成
[0028] 分別取約20頭麥長管蚜，按照北京全式金公司的Trizol試劑盒說明書提取總 RNA，用RNA Cleaning Kit進(jìn)行純化，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，操作步驟均參考試劑盒說明 書。
[0029] 2、引物設(shè)計與基因克隆
[0030] 根據(jù)豌豆蚜和桃蚜EcR基因保守序列（genbank登錄號分別為NM_001159360和 EF174334,提交時間分別為2012年8月31日和2007年4月17日），利用Primer Primer5. 0 軟件設(shè)計引物P1 (表1)，由北京華大基因公司合成，以麥長管蚜cDNA為模板擴增并測序得 到麥長管蚜蛻皮相關(guān)基因 EcR(序列1)。綠色熒光蛋白基因（GFP)片段從國家小麥改良中 心實驗室保存的GFP質(zhì)粒上擴增，利用Primer Primer5. 0軟件設(shè)計引物P2(表1)。
[0031] PCR 反應(yīng)體系為 10 X PCR Buffer5 μ L、dNTP (2. 5mmol · Γ1) 4 μ L、rTaqO. 5 μ L， Forward primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、Reverse primer (20 μ mol · I71) 1 μ L、cDNA/GFP 質(zhì)粒 lyL，用 ddH20 補足至 50yL。PCR 的反應(yīng)條件為 94°C 4min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 30s， 39 個循環(huán)；72°C lOmin ;4°C保存。
[0032] 以麥長管蚜的cDNA為模板，用PI作為引物進(jìn)行擴增，得到472bp PCR產(chǎn)物（含 40bp的T7啟動子序列），經(jīng)過測序，該472bp PCR產(chǎn)物具有序列表中的序列1 (可人工合 成）所示的核苷酸。
[0033] 以GFP質(zhì)粒為模板，用P2作為引物進(jìn)行擴增，得到360bp PCR產(chǎn)物（含40bp的T7 啟動子序列），其具有序列表中的序列3 (可人工合成）所示的核苷酸。
[0034] 將上述PCR電泳結(jié)果如圖1所示，M :Trans2K DNA marker ;1 :EcR基因；2 :GFP，可 以看出得到目的片段。
[0035] 表1為PCR擴增引物
[0036]
【權(quán)利要求】
1. dsRNA，為由序列表中序列2所示的核苷酸和其反向互補序列所示的核苷酸組成的 雙鏈RNA。
2. 權(quán)利要求1中所述dsRNA的編碼基因或含有該編碼基因的DNA片段。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的編碼基因，其特征在于：所述dsRNA的編碼基因的核苷酸序 列為序列表中序列1。
4. 權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編碼基因在如下1)-4)中至少一種中的 應(yīng)用： 1) 防治蚜蟲或制備防治蚜蟲產(chǎn)品； 2) 促進(jìn)蚜蟲死亡或制備促進(jìn)蚜蟲死亡產(chǎn)品； 3) 抑制!牙蟲生長中或制備抑制!牙蟲生長廣品； 4) 抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因 EcR的表達(dá)或在制備抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān) 基因 ECR的表達(dá)產(chǎn)品。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于：所述應(yīng)用為將權(quán)利要求1或2所述dsRNA 導(dǎo)入蚜蟲，實現(xiàn)防治蚜蟲、促進(jìn)蚜蟲死亡、抑制蚜蟲生長和/或抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān) 基因 EcR的表達(dá)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述導(dǎo)入為飼喂。
7. 根據(jù)權(quán)利要求4-6中任一所述的應(yīng)用，其特征在于： 所述蚜蟲為麥長管蚜。
8. -種具有功能的產(chǎn)品，其活性成分為權(quán)利要求1所述dsRNA或權(quán)利要求2所述的編 碼基因，所述功能為如下1)_4)中任意一種：1)防治蚜蟲；2)促進(jìn)蚜蟲死亡；3)抑制蚜蟲生 長；4)抑制蚜蟲體內(nèi)生長發(fā)育相關(guān)基因 EcR表達(dá)。
【文檔編號】C12N15/113GK104109672SQ201410328241
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月10日 優(yōu)先權(quán)日:2014年7月10日
【發(fā)明者】夏蘭琴, 陳紅梅, 孫永偉 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所