水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9及其分子標記方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9及其分子標記方法。對抗黑條矮縮病水稻品種9194(♀)與感病品種蘇御糯(♂)雜交獲得的F2單株的基因型和相應F2:3家系的黑條矮縮病抗性級別進行遺傳連鎖分析，獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，其中qRBSDV9位于標記RM3912-RM257之間。通過抗黑條矮縮病基因的分子標記來檢測抗性品種9194及其衍生品種(系)中是否含有黑條矮縮病抗性基因位點，可預測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
【專利說明】水稻品種91 94抗黑條矮縮病位點qRBSDV9及其分子標記方 法
[0001] 分案說明
[0002] 本申請是2013-03-29日申請的申請?zhí)枮?013101097989,發(fā)明名稱為"水稻品種 9194抗黑條矮縮病位點及其分子標記方法"的中國發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0003] 本發(fā)明屬于分子遺傳學領域，涉及水稻品種9194 qRBSDV9抗黑條矮縮病位點及其 分子標記方法。 技術背景
[0004] 水稻是我國的重要糧食作物。水稻黑條矮縮病是一種由水稻黑條矮縮病毒（Rice black-streaked dwarf virus, RBSDV)引起的病毒病，主要由灰飛風以持久性不經卵方式進 行傳播。近年來，隨著耕作制度和栽培方式的變化、冬季氣候變暖和感病品種的大面積推 廣，傳毒介體灰飛虱發(fā)生量日益上升，水稻黑條矮縮病在江蘇、浙江、江西和福建大規(guī)模發(fā) 生，并迅速上升為生產上最主要的病毒病害，給水稻的安全生產帶來很大威脅。水稻黑條矮 縮病的典型癥狀是病株矮縮，葉色濃綠僵硬，葉背、葉鞘和莖桿有早期蠟白色，后期為黑褐 色的短條紋不規(guī)則突起，嚴重發(fā)病株不抽穗。目前生產上針對此類病害尚無特效農藥，主要 是早期通過對灰飛虱的防治，減輕其危害，但防治效果并不理想，且污染環(huán)境，破壞生態(tài)平 衡。防治病毒病最理想的方法是選育和利用抗病品種，篩選、發(fā)掘和創(chuàng)新抗病種質是開展抗 黑條矮縮病育種的前提和基礎。
【發(fā)明內容】
[0005] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術的上述不足，提供水稻品種9194抗黑條矮縮病位 點及其分子標記方法。
[0006] 本發(fā)明的目的可通過如下技術方案實現(xiàn)：
[0007] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點，包括位于分子標記RM282-RM14898之間的 qRBSDV3,位于分子標記RM20069-RM30之間的qRBSDV6、位于分子標記RM3912-RM257之間 的qRBSDV9和位于分子標記RM26062-RM536之間的qRBSDVll ;所述的分子標記RM282引物 為SEQ ID NO. 1/SEQ ID N0. 2,存在qRBSDV3時的擴增條帶為146bp條帶；所述的分子標記 RM14898引物為SEQ ID NO. 3/SEQ ID N0. 4,存在qRBSDV3時的擴增條帶為176bp條帶；所述 的分子標記RM20069引物為SEQ ID NO. 5/SEQ ID N0. 6,存在qRBSDV6時的擴增條帶為162bp 條帶；所述的分子標記RM30弓丨物為SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8,存在qRBSDV6時的擴增條帶 為136bp條帶；所述的分子標記RM3912引物為SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,存在qRBSDV9時 的擴增條帶為191bp條帶；所述的分子標記RM257引物為SEQ IDN0. 11/SEQ IDN0. 12,存在 qRBSDV9時的擴增條帶為155bp條帶；所述的分子標記RM26062引物為SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,存在qRBSDVll時的擴增條帶為149bp條帶；所述的分子標記RM536引物為SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16,存在qRBSDVll時的擴增條帶為242bp條帶。
[0008] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的分子標記方法：用分子標記RM282引 物：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2 或者用分子標記RM14898 引物：SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,擴增 水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM282引物能夠擴增出146bp的擴 增片段，或用分子標記RM14898引物能夠擴增出176bp的擴增片段，則標志著水稻品種抗黑 條矮縮病位點qRBSDV3的存在。
[0009] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的分子標記方法：用分子標記RM20069 弓丨物：SEQ ID NO. 5/SEQ ID N0. 6,或者用分子標記 RM30 引物：SEQ ID NO. 7/SEQ ID N0. 8 擴增 水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM20069引物能夠擴增出162bp的 擴增片段，或用分子標記RM30引物能夠擴增出136bp的擴增片段，則標志著水稻品種抗黑 條矮縮病位點qRBSDV6的存在。
[0010] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標記方法：用分子標記RM3912 引物：SEQ ID NO. 9/SEQ ID N0. 10,或者用分子標記 RM257 引物：SEQ ID NO. 11/SEQ ID N0. 12 擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM3912引物能夠擴增出 191bp的擴增片段，或用分子標記RM257引物能夠擴增出155bp的擴增片段均標志著水稻品 種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在。
[0011] 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDVl 1的分子標記方法：用分子標記 RM26062 引物：SEQ ID NO. 13/SEQ ID N0. 14,或者用分子標記 RM536 引物：SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM26062引物能夠擴 增出149bp的擴增片段，或用分子標記RM536引物能夠擴增出242bp的擴增片段，則標志著 水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的存在。
[0012] 篩選所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標記的方法，包含如下步驟：
[0013] (1)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配 制雜種匕，構建了包含200個單株的F 2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應的F2:3家 系，進行抗黑條矮縮病鑒定；
[0014] ⑵用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA，采用簡單重復序列標記SSR對 兩親本進行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴增儀上進行，擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上 進行電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F 2群體中進行分析，獲取群體基因型資料；
[0015] (3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMARKER/EXP3. 0,用Kosambi函數(shù)將重組值轉換為遺傳距離；
[0016] (4)采用田間誘發(fā)結合室內接種鑒定進行黑條矮縮病的抗性鑒定；
[0017] (5)利用MAPMARKER/EXP3. 0軟件對各個分子標記的群體基因型和相應家系的黑 條矮縮病抗性級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離。利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件復合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內進行掃描。QTL 的檢測采用5%總體顯著水平，相應L0D統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，共重 復抽樣1000次。同時估計了各位點的加性效應和貢獻率；
[0018] (6)獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，分別為qRBSDV3， 位于標記RM282-RM14898之間；qRBSDV6,位于標記RM20069-RM30之間；qRBSDV9,位于標記 RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標記RM26062-RM536之間。通過抗黑條矮縮病主基因 的分子標記來檢測抗性品種9194及其衍生品種（系）中是否含有該主基因位點，可預測其 黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
[0019] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點在水稻育種中的應用。
[0020] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點優(yōu)選在快速篩選抗黑條矮縮病品 種或品系中的應用。
[0021] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標記引物在水稻育種中的 應用。
[0022] 本發(fā)明所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標記引物在快速篩選抗黑 條矮縮病品種或品系中的應用。
[0023] 有益效果
[0024] 前期， 申請人:對來源于20個國家共960份水稻品種進行了抗黑條矮縮病田間誘 發(fā)和人工接種鑒定，篩選到4個黑條矮縮病發(fā)病率較低的水稻品種，其中水稻品種9194， 連續(xù)三年每年三個地點田間鑒定均對黑條矮縮病表現(xiàn)高抗，進一步室內鑒定結果也表明， 該品種具有較高的黑條矮縮病抗性。該抗源的發(fā)掘為抗水稻黑條矮縮病基因的定位、克隆 和育種利用提供了基礎材料。本發(fā)明利用9194與感病品種蘇御糯雜交獲得的F 2群體進 行遺傳連鎖分析，獲得四個抗黑條矮縮病基因位點，分別為qRBSDV3, qRBSDV6, qRBSDV9和 qRBSDVll。通過與上述四個基因位點連鎖的分子標記來檢測抗性品種9194及其衍生品種 (系）中是否含有抗黑條矮縮病基因位點，可預測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。本發(fā)明所提供的水稻品種9194抗黑條矮縮病主效基因位點的分 子標記方法，具有以下優(yōu)點：
[0025] (1)通過本發(fā)明在國際上首次用SSR標記定位了水稻品種9194中的抗黑條矮縮病 的基因位點。
[0026] (2)通過本發(fā)明分子標記定位的抗性基因位點位置明確，鑒定方便。通過檢測這些 與抗黑條矮縮病基因位點連鎖的分子標記，即可以預測水稻植株的黑條矮縮病抗性，用于 水稻品種或品系的基因型檢測，以判斷該品種或品系是否具有黑條矮縮病抗性，進而快速 篩選抗病品種或品系用于水稻育種?？剐曰蛭稽c的檢測方便快速，不受環(huán)境影響；
[0027] (3)輔助育種選擇目標明確，節(jié)約成本。在傳統(tǒng)育種方法中，首先要收集具有抗源 的親本與栽培品種進行一系列雜交，而且要對黑條矮縮病的抗性進行單株選擇。對水稻黑 條矮縮病進行表型鑒定復雜，同時受環(huán)境影響，由于黑條矮縮病不能經卵傳毒，要經飼養(yǎng)灰 飛虱、帶毒和接種傳毒等復雜的鑒定過程，非常困難，表型鑒定的結果可靠性低。因此，抗黑 條矮縮病育種不僅費時，而且難度大，成本高。通過檢測抗黑條矮縮病基因位點，可以在苗 期就鑒定出抗黑條矮縮病的單株，淘汰其它植株，不僅節(jié)約生產成本而且大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0028] 圖19194和蘇御糯接種后的抗性表現(xiàn)。
[0029] 圖29194和蘇御糯F2群體抗黑條矮縮病次數(shù)分布圖。
[0030] 圖3水稻品種9194抗黑條矮縮病基因在染色體上的分布。
[0031] 圖4抗黑條矮縮病基因緊密連鎖分子標記的電泳圖譜。M:Mark ;1:9194 ;2:蘇御 糯；3 A ;4-13:極抗單株；14-23 :極感單株。
【具體實施方式】 [0032] 材料與方法：
[0033] ( -）9194/蘇御糯F2群體構建及表型鑒定
[0034] (1)以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配 制雜種，構建了 9194/蘇御糯F2分離群體，每個F2單株通過自交獲得相應的9194/蘇御糯 F2:3豕系。
[0035] (2)表型鑒定
[0036] (2.1)田間誘發(fā)鑒定
[0037] 材料分別種植于東?？h黃川鎮(zhèn)、贛榆縣土城鎮(zhèn)和灌云縣東辛農場試驗田，選用四 周為麥田的地塊種植待鑒定材料，以保證獲得足量蟲源。2010和2011年材料均在5月10 日（麥收前3周）分兩個重復進行播種，每個重復單個品種播80粒，均勻撒播1行，行長 50cm，行距10cm。6月27日移栽，單苗栽插，行株距15cmX 20cm，每個品種栽插60穴。常 規(guī)肥水管理，不施用任何農藥。2012年鑒定材料分別于5月5日、5月10日和5月15日分 3個播期進行播種，每個品種播150粒，移栽時間分別為6月20日、6月25日和6月30日， 每個品種栽插120穴，其他種植方式與2010和2011年相同。黑條矮縮病誘發(fā)如下：首先通 過盤拍法調查灰飛虱蟲口密度，將33cmX45cmX 5cm的搪瓷盆對準秧苗基部輕拍植株，使 灰飛虱拍落于盤中，然后迅速將落入盤中的灰飛虱導入高約為60cm，直徑約為35cm的塑料 桶內。于6月上旬在試驗田進行調查，種植材料田塊對角線定5點取樣，每點拍0. 30m2,記 載灰飛虱數(shù)量。隨機對從實驗田塊采集來的100頭灰飛虱進行水稻黑條矮縮病毒的RT-PCR 檢測，確定攜毒率。
[0038] 于7月下旬水稻分蘗盛期統(tǒng)計發(fā)病率。此時發(fā)病植株表現(xiàn)出明顯的病狀：極明顯 的矮縮、心葉突破下葉葉鞘而出、部分植株表現(xiàn)為從下葉枕口呈螺旋狀伸出、部分葉片的頂 端出現(xiàn)旋狀卷曲。而健康稻株表現(xiàn)分蘗旺盛，生命力強，但尚未拔節(jié)，發(fā)病植株和健康植株 反差非常明顯。另外，此時的發(fā)病植株很少有中間型病狀，以每個試驗點2個重復的發(fā)病百 分率平均值作為品種抗黑條矮縮病表型值進行統(tǒng)計。
[0039] (2. 2)人工接種黑條矮縮病毒
[0040] 將親本、抗病和感病對照品種浸種催芽，播種200粒露白發(fā)芽種子于 70. 5cmX 50. 5cmX41. 5cm的塑料箱內，底部接塑料管通水，保持水層約3cm。當秧苗長至 2. 5-3. 0葉時間苗，淘汰病弱苗，保留約150株整齊一致的健苗，每個塑料箱頂端用紗布封 口。于2012年6月10日接入從東海黃川（試驗點中灰飛虱帶毒率最高）采集的灰飛虱進 行接種，每天驅趕灰飛虱數(shù)次。7d后拿掉紗布，移走苗上的灰飛虱，把接種后的苗移栽到大 田，長至分蘗盛期時調查病情。人工接種同期每個品種做三個重復，按每苗20頭灰飛虱計 算接蟲。
[0041] (二）9194/蘇御糯F2群體的分子標記分析
[0042] (1)用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA。
[0043] (2) SSR分析參照 Chen et al. (1997)的程序。10 μ 1 反應體系包括：10mM Tris-HCl ρΗ8· 3, 50mM KC1, 1. 5mM MgC12, 50 μ M dNTPs, 0· 2 μ Μ引物，0· 5U Taq polymerase (TaKaRa,大 連）和 20ng of DNA模板。擴增反應在PTC-200(MJ Research Inc. )PCR儀上進行：94°C 4min ; 94°C lmin, 55°C lmin，72°C 1. 5min，35 個循環(huán)；72°C 7min。擴增產物用 8% 的非變性 PAGE 膠分離，通過銀染顯色，銀染程序根據(jù)Sanguinetti etal. (1994)的方法制定而成。擴增的 DNA條帶利用裝有熒光燈的燈箱進行觀察。記錄結果，親本間有多態(tài)的引物在F2群體中進 行分析，獲取群體基因型資料；
[0044] (3)根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMAKER/EXP3. 0,最小L0D值設為2,獲得連鎖圖譜；
[0045] (4)利用 Windows QTL Cartographer V2· 0 軟件（Wang et al.，2〇〇3)復合區(qū)間作圖 法（Composite interval mapping, CIM)，以2cM為步長在全基因組范圍內進行掃描。QTL的 檢測采用5%總體顯著水平，相應L0D統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗（Permutation test) (Churchill and Doerge，1994)方法進行估計，共重復抽樣1000次。同時估計了各位點的 加性效應和貢獻率。利用MAPMAKER/3. 0分析軟件進行黑條矮縮病抗性與SSR標記的分離 分析。并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離（cM)。
[0046] (三）結果與分析：
[0047] 9194和蘇御糯經黑條矮縮病的田間和室內鑒定其平均發(fā)病率分別8. 9%和78%， 表明9194具有較高的黑條矮縮病抗性，而蘇御糯對黑條矮縮病高度敏感（圖1)。200個F2:3 家系對黑條矮縮病的抗性頻率分布呈連續(xù)分布，表明該群體中可能存在多個抗黑條矮縮病 位點（圖2)。從&群體中挑選三個地點及室內鑒定均表現(xiàn)高抗或高感的單株各10株，進行 12條染色體的連鎖分析，在水稻第3,6,9和11染色體發(fā)現(xiàn)與目標性狀有連鎖跡象。進一步 構建了第3,6,9和11全染色體的連鎖圖譜，結合表型數(shù)據(jù)，利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件進行抗黑條矮縮病的QTL檢測。結果在水稻第3染色體標記RM282-RM14898之 間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV3, L0D值為2. 34,貢獻率為5. 4% ;在水稻第6染色 體標記RM20069-RM30之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV6, L0D值為4. 42,貢獻率為 10. 3%;在水稻第9染色體標記RM3912-RM257之間檢測到一個抗黑條矮縮病QTL qRBSDV9， L0D值為6. 63,貢獻率為35. 5% ;在水稻第11染色體標記RM26062-RM536之間檢測到一個 抗黑條矮縮病QTL qRBSDVl 1，L0D值為3. 55，貢獻率為31. 1 %。上述四個QTLs可解釋表型 變異82. 3% (圖3)。
[0048] 分子標記RM282引物：
[0049] 上游引物：CTGTGTCGAAAGGCTGCAC (SEQ ID NO. 1)
[0050] 下游引物：CAGTCCTGTGTTGCAGCAAG(SEQ ID Ν0· 2)
[0051] 分子標記RM14898引物：
[0052] 上游引物：ATGTTCAACCTTGTCCCGACTAACC (SEQ ID N0. 3)
[0053] 下游引物：TAAAGACGGCAGCTATCACTTTGC (SEQ ID Ν0· 4)
[0054] 用分子標記RM282引物：SEQ ID NO. 1/SEQ ID NO. 2或者用分子標記RM14898引 物：SEQ ID NO. 3/SEQ ID NO. 4,擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記 RM282引物能夠擴增出146bp的擴增片段，或用分子標記RM14898引物能夠擴增出176bp的 擴增片段，則標志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV3的存在（圖4)。
[0055] 分子標記RM20069引物：
[0056] 上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG (SEQ ID N0. 5)
[0057] 下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG (SEQ ID NO. 6)
[0058] 分子標記RM30引物：
[0059] 上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG (SEQ ID NO. 7)
[0060] 下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT (SEQ ID NO. 8)
[0061] 用分子標記RM20069引物：SEQ ID NO. 5/SEQ ID NO. 6,或者用分子標記RM30引 物：SEQ ID NO. 7/SEQ ID NO. 8擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記 RM20069引物能夠擴增出162bp的擴增片段，或用分子標記RM30引物能夠擴增出136bp的 擴增片段，則標志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV6的存在（圖4)。
[0062] 分子標記RM3912引物：
[0063] 上游引物：GCGAGCGAGAGGAGAGATAGACG (SEQ ID N0. 9)
[0064] 下游引物：CGAATTCGGCACGAGTAATAGGG (SEQ ID Ν0· 10)
[0065] 分子標記RM257引物：
[0066] 上游引物：ACACTGTAGCGGCCACTG (SEQ ID Ν0· 11)
[0067] 下游引物：CCTCCACTGCTCCACATCTT (SEQ ID Ν0· 12)
[0068] 用分子標記RM3912引物：SEQ ID NO. 9/SEQ ID NO. 10,或者用分子標記RM257引物： SEQ ID NO. 11/SEQ ID NO. 12擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記 RM3912引物能夠擴增出191bp的擴增片段，或用分子標記RM257引物能夠擴增出155bp的 擴增片段均標志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在（圖4)。
[0069] 分子標記RM26062引物：
[0070] 上游引物：TTTGCGTTTGCGTTTGCGTAGG (SEQ ID N0. 13)
[0071] 下游引物：ACCCGTACACCTCCACACAGTGC(SEQ ID Ν0· 14)
[0072] 分子標記RM536引物：
[0073] 上游引物：TCTCTCCTCTTGTTTGGCTC (SEQ ID N0. 15)
[0074] 下游引物：ACACACCAACACGACCACAC(SEQ ID Ν0· 16)
[0075] 用分子標記RM26062引物：SEQ ID NO. 13/SEQ ID NO. 14,或者用分子標記RM536引 物：SEQ ID NO. 15/SEQ ID NO. 16擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標 記RM26062引物能夠擴增出149bp的擴增片段，或用分子標記RM536引物能夠擴增出242bp 的擴增片段，則標志著水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDVll的存在（圖4)。
[0076] 通過與上述四個基因位點連鎖的分子標記來檢測抗性品種9194及其衍生品種 (系）中是否含有抗黑條矮縮病基因位點，可預測其黑條矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條 矮縮病水稻的選擇效率。
[0001] _m列表_ <110>南京農、丨丨(大學 <丄20>水稻品種9194抗黑條矮縮病位點以故及其分+標記方法 <160> 20 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213) 人工序列 <220> <221>分子標記RM282上游引物 <400> 1 ctgtgtcgaa aggctgcac 19 <210> 2 <211> 19 <212> DNA <213〉人T_序列 <220〉 <221〉分了標記RM282下游引物 <400> 2 cagtcctgtg ttgcagcaag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213>人工序列 <220> <221>分子標記RM14898 h游引物 <400> 3
[0002] atgttcaacc ttgtcccgac taacc 25 <210> 4 <211〉 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221〉分子標記RM14898下游引物 <400> 4 taaagacggc agctatcact ttgc 24 <210> 5 <211〉 19 <212> DNA <213> 人工序列 <220> <221〉分子標記RM20069上游引物 <400> 5 gcgagcgaga ggagagatag acg 23 <210> 6 <211〉 19 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM20069下游引物 <400> 6 cgaattcggc acgagtaata ggg 23
[0003] <210> 7 <211〉 18 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM30上游引物 <400> 7 acactgtagc ggccactg 18 <210〉 8 <211> 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM30下游引物 <400> 8 cctccactgc tccacatctt 20 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM3912上游引物 <400> 9 gcgagcgaga ggagagatag acg 23
[0004] <210〉 10 <211〉 23 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221〉分子標記RM3912下游引物 <400> 10 cgaattcggc acgagtaata ggg 23 <210> 11 <211> 18 <212〉 DNA <213>人工序列 <220> <221〉分子標記RM257上游引物 <400> 11 acactgtagc ggccactg 18 <210> 12 <211〉 20 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221〉分了標記RM257下游引物 <400> 12 cctccactgc tccacatctt 20 <210> 13
[0005] <211> 22 <212> DNA <213〉人工序列 <220> <221〉分子標記RM26062上游引物 <400> 13 tttgcgtttg cgtttgcgta gg 22 <210> 14 <211> 23 <212〉 DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM26062下游引物 <400> 14 acccgtacac ctccacacag tgc 23 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213〉人丄序列 <220〉 <221〉分了標記RM536上游引物 <400> 15 tctctcctct tgtttggctc 20 <210> 16 <211〉 20
[0006] <212> DNA <213〉人工序列 <220〉 <221〉分子標記RM536下游引物 <400> 16 acacaccaac acgaccacac 20
【權利要求】
1. 水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標記方法，其特征在于：用分子標 記 RM3912 引物：SEQ IDNO. 9/SEQ IDNO. 10,或者用分子標記 RM257 引物：SEQ IDNO. 11/SEQ ID NO. 12擴增水稻抗黑條矮縮病品種或育種材料DNA，如果用分子標記RM3912引物能夠擴 增出191bp的擴增片段，或用分子標記RM257引物能夠擴增出155bp的擴增片段均標志著 水稻品種抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的存在。
2. 篩選權利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點的分子標記的方法，其特征 在于包含如下步驟： (1) 以抗黑條矮縮病品種9194為母本，感黑條矮縮病粳稻品種蘇御糯為父本，配制雜 種匕，構建了包含200個單株的F2分離群體，每個F 2單株通過自交獲得相應的F2:3家系， 進行抗黑條矮縮病鑒定； (2) 用SDS法提取親本、Fi及F2群體各株系的DNA，采用簡單重復序列標記SSR對兩親 本進行多態(tài)性篩選，PCR在PTC-200擴增儀上進行，擴增產物在8%聚丙烯酰胺凝膠上進行 電泳分析，親本間有多態(tài)的引物在F 2群體中進行分析，獲取群體基因型資料； (3) 根據(jù)連鎖交換規(guī)律，利用群體基因型資料構建水稻的遺傳圖譜，所用軟件為 MAPMARKER/EXP3. 0,用Kosambi函數(shù)將重組值轉換為遺傳距離； (4) 采用田間誘發(fā)結合室內接種鑒定進行黑條矮縮病的抗性鑒定； (5) 利用MAPMARKER/EXP3. 0軟件對各個分子標記的群體基因型和相應家系的黑條 矮縮病抗性級別進行連鎖分析，并將Kosambi函數(shù)轉換為遺傳距離，利用Windows QTL Cartographer V2. 0軟件復合區(qū)間作圖法，以2cM為步長在全基因組范圍內進行掃描，QTL的 檢測采用5%總體顯著水平，相應L0D統(tǒng)計量的顯著閾值用排列測驗方法進行估計，共重復 抽樣1000次，同時估計了各位點的加性效應和貢獻率； (6) 獲得抗黑條矮縮病品種9194抗黑條矮縮病基因位點四個，分別為qRBSDV3,位 于標記RM282-RM14898之間；qRBSDV6,位于標記RM20069-RM30之間；qRBSDV9,位于標記 RM3912-RM257之間；qRBSDVll，位于標記RM26062-RM536之間，通過抗黑條矮縮病主基因的 分子標記來檢測抗性品種9194及其衍生品種（系）中是否含有該主基因位點，預測其黑條 矮縮病抗性水平，大大提高抗黑條矮縮病水稻的選擇效率。
3. 權利要求1所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標記引物，其 特征在于包括分子標記RM3912引物：SEQ IDNO. 9/SEQ IDNO. 10,或者分子標記RM257引物： SEQ IDNO. 11/SEQ IDNO. 12〇
4. 權利要求3所述的水稻品種9194抗黑條矮縮病位點qRBSDV9的分子標記引物在水 稻育種中的應用。
5. 根據(jù)權利要求4所述的應用，其特征在于所述的分子標記引物在快速篩選抗黑條矮 縮病品種或品系中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104046693SQ201410291342
【公開日】2014年9月17日 申請日期:2013年3月29日 優(yōu)先權日:2013年3月29日
【發(fā)明者】萬建民, 劉裕強, 江玲, 孫志廣, 胡金龍, 王寶祥, 王 琦, 趙志剛, 王益華, 陳亮明, 劉世家, 劉喜, 陳賽華, 張文偉, 田云錄, 王春明, 徐大勇 申請人:南京農業(yè)大學