一種梨果皮光滑度主效qtl位點(diǎn)的snp分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種與梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)的SNP標(biāo)記引物及其應(yīng)用。梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)的緊密連鎖SNP標(biāo)記Pybd02_010，正向引物序列如SEQ?ID?NO.1所示，反向引物序列如SEQ?ID?NO.2所示。利用該特異引物基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果皮光滑度的SNP標(biāo)記，可對果皮光滑度進(jìn)行良好分型，即檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異。本發(fā)明提供的梨果皮光滑度主效QTL分子標(biāo)記可用于梨果皮光滑度性狀的分子標(biāo)記輔助選擇育種，對于加快梨品種的遺傳改良進(jìn)程，提高育種選擇效率具有重要的理論和實(shí)踐指導(dǎo)意義。
【專利說明】一種梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)的SNP分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于分子遺傳育種領(lǐng)域，提供了一種梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)的SNP分子標(biāo)記引物及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]我國是世界梨屬(Pyrus L.)植物最主要的起源地之一，遺傳多樣性豐富。梨的栽培種分布廣泛，除了海南省和臺灣省，都有栽培。梨果實(shí)的營養(yǎng)價值高，香甜多汁，而深受消費(fèi)者喜愛。果實(shí)的外觀質(zhì)量是衡量果實(shí)等級的重要因素之一，而果皮光滑度是對果實(shí)外觀質(zhì)量評價的第一直觀要素。隨著人們生活水平的提高，人們對果品質(zhì)量的要求也越來越高，果面粗糙、皸皮，有果銹和小黑點(diǎn)的果實(shí)逐漸被淘汰出優(yōu)等果實(shí)之外。果皮光滑度亦是梨果采后分級的重要標(biāo)準(zhǔn)，無果銹是商品果實(shí)的首選指標(biāo)。在生產(chǎn)上，人們常通過套袋等栽培技術(shù)改善果皮的光滑度。另外，選育果皮光滑的品種可以大大降低套袋勞動成本，節(jié)約生產(chǎn)資料。因此選育果皮光滑整潔的品種是梨育種的重要目標(biāo)之一。
[0003]由于絕大多數(shù)梨品種是自交不親和的，梨的遺傳組成表現(xiàn)高度雜合性；同時，由于多年生果樹的農(nóng)藝性狀多數(shù)表現(xiàn)為數(shù)量性狀遺傳特征，有關(guān)梨的重要性狀遺傳規(guī)律研究相對滯后，也難以開展目標(biāo)性狀的遺傳改良。近年來，隨著分子標(biāo)記技術(shù)的迅速發(fā)展、高密度的分子遺傳圖譜的出現(xiàn)，以及數(shù)量性狀作圖方法的不斷完善，使得數(shù)量性狀基因座(QTL)定位變成了現(xiàn)實(shí)，也為提高目標(biāo)數(shù)量性狀優(yōu)良基因型選擇的可能性、準(zhǔn)確性及預(yù)見性奠定了基礎(chǔ)。利用分子標(biāo)記定位數(shù)量性狀QTL，其實(shí)質(zhì)就是分析分子標(biāo)記與目標(biāo)性狀QTL之間的連鎖關(guān)系，即利用已 知座位的分子標(biāo)記來定位未知座位的QTL，通過計算分子標(biāo)記與QTL之間的交換率，來確定QTL的具體位置?；讷@得的標(biāo)記基因型分離與數(shù)量性狀表型之間的關(guān)系，可直接確定控制數(shù)量性狀位點(diǎn)，開發(fā)可應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選擇育種的技術(shù)，這已在許多重要農(nóng)作物上取得了成功應(yīng)用。
[0004]目前有關(guān)梨數(shù)量性狀的QTL定位研究仍屬起步階段，已有的研究主要是針對一些病害或生長性狀，對梨果皮光滑度性狀的QTL定位及檢測QTL位點(diǎn)上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度差異的SNP分子標(biāo)記的開發(fā)應(yīng)用研究尚未有報道。因此，開展梨果皮光滑度性狀的QTL定位，基于相應(yīng)序列信息開發(fā)SNP分子標(biāo)記，并建立雜交后代早期輔助選擇技術(shù)體系，對于提高梨果實(shí)品質(zhì)，提高育種效率，節(jié)約生產(chǎn)成本顯得尤為重要。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是定位梨果皮光滑度主效QTL，根據(jù)貢獻(xiàn)位點(diǎn)序列信息開發(fā)基于高分辨率溶解曲線鑒定梨果皮光滑度的SNP特異標(biāo)記Pybd02_010，檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異。通過該分子標(biāo)記可以預(yù)測梨果皮光滑度的大小，為實(shí)現(xiàn)果皮光滑度性狀的早期鑒定和篩選提供分子輔助選擇技術(shù)支持。
[0006]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn):[0007]一種與梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth緊密連鎖的SNP標(biāo)記引物對，其中，
[0008]正向引物SMOOTH-F:5’ - GTGGAGGAAGTGCTCGAACT - 3’ (SEQ ID N0.1)，
[0009]反向引物SMOOTH-R:5’ - ACACTGCAAGTAATCATAGCTCT - 3’ (SEQ ID N0.2)。
[0010]本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記引物對在梨分子育種中的應(yīng)用，利用所述的引物對SM00TH-F/SM00TH-R基于高分辨率溶解曲線鑒定檢測登錄號為AJSU00000000梨基因組序列Scaffold283.0的第416246個堿基處是否存在一個與梨果實(shí)果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth，同時檢測QTL位點(diǎn)上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異，預(yù)測梨果皮光滑度，以實(shí)現(xiàn)梨果皮光滑度性狀的早期鑒定和篩選。
[0011]本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記引物對在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0012]本發(fā)明所述的引物用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:利用本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在LightCyclerB 480II的Gene Scanning軟件中1.5vers1n自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮光滑的品種和表達(dá)果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的 差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)的果皮光滑度和對照相似。
[0013]其中，所述的已知具有與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮粗糙的品種優(yōu)選為‘碭山酥梨’，表達(dá)果皮光滑的品種優(yōu)選為‘八月紅’。
[0014]所述的HRM 反應(yīng)的反應(yīng)體系按照 LightCycler* 480High Resolut1n Melting
Master試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCyclers 480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行；10 μ L 反應(yīng)體系:含有 2ng.μ L-1 梨基因組 DNA 模板、I XMaster Mix,2.0mmol.L-1MgCl2'
0.2mmol -L-1權(quán)利要求1所述的引物對；擴(kuò)增程序采用降落式PCR:95°C預(yù)變性lOmin，然后95°C變性10s、60~55°C，每循環(huán)下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序進(jìn)行45個循環(huán)；
[0015]PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解的程序?yàn)?95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再從65°C連續(xù)升溫至95°C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40°C。
[0016]一種與梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth緊密連鎖的SNP標(biāo)記，該分子標(biāo)記由引物對:正向引物SM00TH-F:SEQ ID N0.1和反向引物SM00TH-R:SEQ ID N0.2擴(kuò)增梨基因組DNA得到。
[0017]本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記在梨分子育種中的應(yīng)用，該分子標(biāo)記位于梨的第2連鎖群的76.3cM處，Kruskal-Wallis統(tǒng)計測驗(yàn)值為15.118，在α = 0.001顯著水平下顯著，利用區(qū)間作圖法的LOD值為2.72，解釋14.1 %的遺傳變異。
[0018]本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。
[0019]本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth的SNP標(biāo)記方法，利用本發(fā)明所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在LightCycler* 480II的Gene Scanning軟件中1.5vers1n自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮光滑的品種和表達(dá)果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)的果皮光滑度和對照相似；其中所述的已知具有與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮粗糙的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)果皮光滑的品種為‘八月紅’。
[0020]有益效果
[0021](I)本發(fā)明首次對決定‘八月紅’和‘碭山酥梨’果皮光滑度的數(shù)量性狀位點(diǎn)進(jìn)行了 QTL定位，定位的QTL位點(diǎn)對該數(shù)量性狀的存在顯著關(guān)聯(lián)關(guān)系(α = 0.001)，且貢獻(xiàn)率較高，位點(diǎn)的貢獻(xiàn)率為14.1%。這為實(shí)現(xiàn)分子輔助育種多基因控制性狀遺傳改良奠定了重要的基礎(chǔ)和必要的前提。
[0022](2)目前普遍認(rèn)為可應(yīng)用于分子輔助選擇的連鎖標(biāo)記與目標(biāo)性狀的距離需(5cM，本發(fā)明中果皮光滑度主效QTL定位直接定位到SNP標(biāo)記上，且Kruskal-Wallis測驗(yàn)值為15.118，在α =0.001顯著水平下顯著，區(qū)間作圖檢測到LOD值為2.72，連鎖性和可靠性高，這對于提高分子標(biāo)記輔助選擇的準(zhǔn)確性和效率具有重要意義。
[0023](3)本發(fā)明根據(jù)定位的梨果皮光滑度性狀主效QTL位點(diǎn)qSmooth開發(fā)檢測梨果皮光滑度的SNP標(biāo)記Pybd02_010引物，用于預(yù)測QTL位點(diǎn)qSmooth上多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度差異，為梨果皮光滑度的預(yù)先選擇提供了可靠的分子標(biāo)記來源。 [0024](4)利用開發(fā)的SNP標(biāo)記引物，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’ 36株雜交群體進(jìn)行QTL位點(diǎn)qSmooth上多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度差異基因型檢測，可將雜交群體分為兩組，與果實(shí)實(shí)際觀察的果皮光滑和果皮粗糙相符。群體試驗(yàn)表明，開發(fā)的SNP標(biāo)記特異引物可以對后代果皮光滑度進(jìn)行良好分型(圖2)，因此，具有良好的應(yīng)用價值，可實(shí)現(xiàn)對梨果皮光滑度性狀的預(yù)先選擇和輔助育種。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0025]圖1為梨果皮光滑度主效QTL區(qū)間及SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pybd02_010在第2連鎖群上的位置。LG2代表的是‘八月紅’和‘碭山酥梨’合并遺傳連鎖圖譜的第2連鎖群。SNP標(biāo)記名稱起始為‘Pyb’的代表來自‘八月紅’的SNP標(biāo)記，起始名稱為‘Pyd’的代表來自‘碭山酥梨’的SNP標(biāo)記，起始名稱為‘Pybd’的代表同時來自‘八月紅’和‘碭山酥梨’的SNP標(biāo)記。
[0026]連鎖群左側(cè)的數(shù)字是標(biāo)記之間的遺傳距離，單位為CM。連鎖群右側(cè)的實(shí)心長方形指示QTL作圖區(qū)間。右邊的曲線圖為QTL的LOD分布圖。果皮光滑度QTL位點(diǎn)對應(yīng)連鎖群上的Pybd02_010標(biāo)記，其位于第2連鎖群76.3cM處，LOD值為2.72。
[0027]圖2為依據(jù)Pybd02_010開發(fā)的HRM特異標(biāo)記引物，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’后代36個個體中檢測的溶解曲線，可良好分型。熔解曲線:線型I一紅色曲線，25株個體，其中22株果皮光滑；線型2—藍(lán)色曲線，11株個體，其中9株果皮粗糙。兩組的符合率分別為88%和 82%0
【具體實(shí)施方式】
[0028]實(shí)施例1:
[0029]梨果皮光滑度主效QTL連鎖的分子標(biāo)記，是通過以下方法獲得的:
[0030]a)利用‘八月紅’和‘碭山酥梨’(品種為公知公用，見文獻(xiàn):張瑞萍等，梨AFLP標(biāo)記遺傳圖譜構(gòu)建及果實(shí)相關(guān)性狀的QTL定位，園藝學(xué)報，2011，38 (10):1991 - 1998)雜交獲得其102株F1后代單株。
[0031]b)利用RADseq方法高通量測序，對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及后代進(jìn)行分析，并統(tǒng)計分析多態(tài)性位點(diǎn)在后代群體中的遺傳類型，利用X 2測驗(yàn)分析各標(biāo)記分離是否符合3:1或1:1的孟德爾遺傳分離比例。
[0032]c)用Joinmap4.0分析軟件構(gòu)建‘八月紅’和‘碭山酥梨’的分子遺傳連鎖圖譜。將第b)步驟中得到的多態(tài)性標(biāo)記位點(diǎn)按Joinmap4.0分析軟件中適于CP群體構(gòu)圖的格式導(dǎo)入Joinmap4.0，排除缺失數(shù)據(jù)過多的位點(diǎn)和顯著偏分離的位點(diǎn)，卡方檢測的P值為0.05，選擇Kosambi作圖函數(shù)構(gòu)建遺傳連鎖圖。
[0033]d)對‘八月紅’和‘碭山酥梨’及其F1群體單株的果皮光滑度進(jìn)行評價，按照《國家梨種質(zhì)資源描述規(guī)范和數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)》，評價方法是通過對果皮的觸摸手感進(jìn)行評分，3分及以下為粗糙，7分及以上為平滑。 [0034]e)將果皮光滑度的表型值和標(biāo)記信息的相關(guān)文件導(dǎo)入MapQTL5.0軟件,選擇區(qū)間作圖法，以LOD值> 3.0為標(biāo)準(zhǔn)，對梨的果皮光滑度進(jìn)行QTL分析和定位。結(jié)果表明，在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的第2連鎖群上檢測到果皮光滑度的主效QTL位點(diǎn)qSmooth(圖1)，對該性狀的貢獻(xiàn)率為14.1%，其對應(yīng)的SNP標(biāo)記Pybd02_010在連鎖群上的遺傳距離為76.3cM, LOD 值為 2.72。
[0035]f)利用SNP標(biāo)記位點(diǎn)Pybd02_010開發(fā)HRM特異引物。
[0036]通過梨全基因組數(shù)據(jù)庫(http://peargenome.njau.edu.cn/),從登錄號為AJSU00000000的梨基因組序列scaffold283.0中搜索出第2連鎖群上SNP標(biāo)記Pybd02_010的DNA序列，選取的該位點(diǎn)前后300bp的序列，依據(jù)引物設(shè)計原則，開發(fā)設(shè)計SNP標(biāo)記引物。正向引物序列 SMOOTH-F 為 ‘5-GTGGAGGAAGTGCTCGAACT-3’ ；反向引物 SMOOTH-R 為
5‘-ACACTGCAAGTAATCATAGCTCT-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小249bp，利用設(shè)計的SNP標(biāo)記引物在‘八月紅’和‘碭山酥梨’的基因組DNA上進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物均擴(kuò)增正常，PCR產(chǎn)物符合預(yù)測大小。因此，該引物可作為梨果皮光滑度性狀的檢測標(biāo)記。
[0037]g)利用HRM技術(shù)對梨果皮光滑度進(jìn)行分型。
[0038]HRM 反應(yīng)體系按照LightCycler* 480High Resolut1n Melting Master 試劑盒中的
說明書進(jìn)行，HRM分析是在LightCycler1 480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行。
[0039]10 μ L反應(yīng)體系:含有2ng.μ l-1梨基因組DNA模板，I XMaster Mix,
2.0mmol.L^1MgCl270.2mmol.L—1權(quán)利要求1所述的引物；擴(kuò)增程序采用降落式PCR(touchdown PCR):95 °C 預(yù)變性 lOmin，然后 95°C 變性 10s、60 ~55 °C (每循環(huán)下降
0.50C )退火15s、72°C延伸12s的程序進(jìn)行45個循環(huán)。[0040]PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，其程序?yàn)?95°C Imiη, 40°C lmin，65°C ls，再從65°C連續(xù)升溫至95°C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40°C。
[0041]最后，在LightCycler?480II 的 Gene Scanning 軟件中 1.5vers1n 自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線
[0042]利用g)步驟中得到的SNP標(biāo)記引物對‘八月紅’ X ‘碭山酥梨’的36個雜交后代群體進(jìn)行HRM分析(圖2)。
[0043]線型I一紅色曲線，25個體線型相似，其中22個體為果皮光滑；
[0044]線型2—藍(lán)色曲線，11個體線型相似，其中9個體為果皮粗糙。
[0045]統(tǒng)計分析表明，36個個體分型為兩種基因型，分離比例為25:11。根據(jù)QTL位點(diǎn)qSmooth上多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度差異基因分型結(jié)果將36個個體的果皮光滑度表型數(shù)據(jù)進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(P = 0.00004)，測驗(yàn)結(jié)果顯示果皮光滑度與基因型有關(guān)，且兩組的符合率分別為88%和82%。因此，通過對果皮光滑度性狀的表型測定結(jié)果與HRM分型結(jié)果的比較分析，證明該特異SNP標(biāo)記可檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異，對梨果皮光滑 度良好分型。
【權(quán)利要求】
1.一種與梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth緊密連鎖的SNP標(biāo)記Pybd02_010引物對，其特征在于:正向引物SMOOTH-F:SEQ ID N0.1，反向引物SMOOTH-R:SEQ ID N0.2。
2.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對在梨分子育種中的應(yīng)用，其特征在于利用所述的引物對基于高分辨率溶解曲線鑒定檢測登錄號為AJSU00000000的梨基因組序列scaffold283.0的第416246個堿基處是否存在一個與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth,同時檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異,預(yù)測梨果皮光滑度，以實(shí)現(xiàn)梨果皮光滑度性狀的早期鑒定和篩選。
3.權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。
4.權(quán)利要求1所述的引物用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:利用權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在LightCyclere 480II的Gene Scanning軟件中1.5vers1n自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮光滑的品種和表達(dá)果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)的果皮光滑度和對照相似。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其特征在于所述的已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮粗糙的品種為‘楊山酥梨’,已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮光滑的品 種為‘八月紅’。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的SNP標(biāo)記方法，其特征在于所述的HRM反應(yīng)的反應(yīng)體系按照LightCycler1 480High Resolut1n Melting Master 試劑盒中的說明書進(jìn)行，HRM 分析是在LightCycler8 480II熒光定量PCR儀上進(jìn)行；10 μ L反應(yīng)體系:含有2ng.μ L—1梨基因組DNA 模板、I XMaster Mix、2.0mmol.L^1MgCI2>0.2mmo1.I71 權(quán)利要求1 所述的引物對;擴(kuò)增程序采用降落式PCR:95°C預(yù)變性1min，然后95°C變性1s、60~55°C，每循環(huán)下降0.5°C，退火15s、72°C延伸12s的程序進(jìn)行45個循環(huán)； PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解的程序?yàn)?95°C lmin,40°C lmin，65°C ls，再從65°C連續(xù)升溫至95°C，每升高0.04°C，收集熒光I次，最后降溫至40°C。
7.一種與梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth緊密連鎖的SNP標(biāo)記Pybd02_010，其特征在于該分子標(biāo)記由引物對:正向引物SM00TH-F:SEQ ID N0.1和反向引物SM00TH-R =SEQID N0.2擴(kuò)增梨基因組DNA得到。
8.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記Pybd02_010在梨分子育種中的應(yīng)用，其特征在于該分子標(biāo)記位于梨的第2連鎖群的76.3cM處，Kruskal-Wallis統(tǒng)計測驗(yàn)值為15.118，在α =0.001顯著水平下顯著，利用區(qū)間作圖法的LOD值為2.72，解釋14.1%的遺傳變異。
9.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記在檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth及其SNP多態(tài)性中的應(yīng)用。
10.權(quán)利要求7所述的SNP標(biāo)記用于檢測梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth的SNP標(biāo)記方法，其特征在于:利用權(quán)利要求1所述的SNP標(biāo)記引物對梨基因組DNA進(jìn)行HRM反應(yīng)，如果擴(kuò)增產(chǎn)物序列大小在249bp，表明存在一個與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth ；PCR循環(huán)結(jié)束后進(jìn)行熔解，最后，在LightCyclers 480II的Gene Scanning軟件中1.5vers1n自動生成擴(kuò)增產(chǎn)物的不同顏色和線型的熔解曲線，分別以已知梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮光滑的品種和表達(dá)果皮粗糙的品種為對照，檢測QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)果皮光滑度的差異，如果未知品種得到的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線與對照的顏色相同、線型相似，則表示在梨果皮光滑度主效QTL位點(diǎn)qSmooth上的多態(tài)性表達(dá)的果皮光滑度和對照相似；其中 所述的已知具有與梨果皮光滑度相關(guān)的QTL位點(diǎn)qSmooth上表達(dá)果皮粗糙的品種為‘碭山酥梨’，表達(dá)果皮光滑的品種為‘八月紅’。
【文檔編號】C12N15/11GK104032018SQ201410272786
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月18日
【發(fā)明者】吳俊 , 張紹鈴, 李雷廷, 孫江妹, 張全軍, 劉倫, 齊開杰 申請人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)