人源抗h7n9禽流感病毒中和性抗體m5、其制備方法及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種利用噬菌體表面展示技術(shù)篩選獲得的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5，其輕鏈和重鏈可變區(qū)的氨基酸序列分別如SEQ?ID?No.1和SEQ?ID?No.2所示。該抗體能夠特異性識(shí)別H7N9病毒顆?？乖?，可與H7N9病毒發(fā)生顯著的酶聯(lián)免疫反應(yīng)且具有抗H7N9病毒感染的中和活性功能。此外，可將本發(fā)明的抗體制成預(yù)防和治療H7N9禽流感病毒的特異性抗體藥物，從而在臨床中用于預(yù)防和治療由H7N9病毒引起的急性呼吸道傳染病。
【專利說(shuō)明】人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5、其制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程及噬菌體表面展示技術(shù)，具體地說(shuō)，涉及人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5、其制備方法及應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]H7N9禽流感是由H7N9禽流感病毒引起的急性呼吸道傳染病。自2013年2月以來(lái)，上海市、安徽省、江蘇省先后發(fā)生不明原因重癥肺炎病例?；颊咭话惚憩F(xiàn)為流感樣癥狀，如發(fā)熱，咳嗽，少痰，可伴有頭痛、肌肉酸痛和全身不適。重癥患者病情發(fā)展迅速，表現(xiàn)為重癥肺炎，體溫大多持續(xù)在39°C以上，出現(xiàn)呼吸困難，可伴有咯血痰；可快速發(fā)展出現(xiàn)急性呼吸窘迫綜合征、縱隔氣腫、膿毒癥、休克、意識(shí)障礙及急性腎損傷等，死亡率較高。
[0003]由H7N9病毒引起的急性呼吸道傳染病目前沒(méi)有相應(yīng)的疫苗和特異性藥物，因此制備高效、價(jià)廉、副反應(yīng)小的被動(dòng)免疫制劑成為研究的熱點(diǎn)。利用含有特異性抗體的人源或動(dòng)物血清免疫球蛋白來(lái)預(yù)防和治療傳染病由來(lái)已久。單克隆抗體的體外抗病毒中和活性和體內(nèi)保護(hù)機(jī)體抵抗病毒攻擊已獲得許多實(shí)驗(yàn)證明，如漢坦病毒、麻疹病毒、RSV病毒、狂犬病毒等中和性單克隆抗體可以在體內(nèi)100%保護(hù)動(dòng)物免受病毒攻擊。
[0004]免疫球蛋白(Immunoglobulin, Ig)作為抗體成分主要來(lái)自捐獻(xiàn)者(恢復(fù)期病人)免疫血清，從獲得陽(yáng)性血清到通過(guò)安全性檢測(cè)耗時(shí)較長(zhǎng)，且需投入大量的人力和財(cái)力，這就使其大量制備受到限制，同時(shí)由于抗體主要來(lái)源于血清，因此容易發(fā)生血源性傳播疾病的感染。而使用人源基因工程產(chǎn)品替代血制品則可克服這些缺陷，隨著人源基因工程抗體研究的不斷深入，給這一領(lǐng)域的生物制品發(fā)展帶來(lái)了新的希望和廣闊前景。
[0005]90年代初興起的噬菌體抗體基因庫(kù)技術(shù)(Barbas, C.F.等，1991)和整個(gè)基因工程抗體技術(shù)研究領(lǐng)域的發(fā)展，極大促進(jìn)了人源或基因工程抗體的開(kāi)發(fā)研究，并已由基礎(chǔ)研究階段步入實(shí)質(zhì)性應(yīng)用研究和開(kāi)發(fā)階段。人源抗病毒基因工程抗體，尤其是人源全抗體的研究成功，給各種病毒性傳染病的特異性預(yù)防和治療開(kāi)辟了新思路，并在抗病毒感染生物醫(yī)藥領(lǐng)域中逐漸開(kāi)發(fā)出一類新的抗病毒藥物。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5、其制備方法及應(yīng)用。
[0007]為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明的一種人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5或其活性片段，其輕鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3以及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如表1所示:
[0008]表1輕鏈和重鏈高變區(qū)的氨基酸序列
[0009]CDRlCDR2CDR3
重鏈 VHSYAMS￥IYSA(3SSTYYADSVK(3 SYGLDYYGSGSYYNYFDY
輕撻 VL RASQYIDSSHLAGASGRATQQFERSSVT
[0010]前述的中和性抗體M5，i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；ii)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
[0011]本發(fā)明中所述的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5的活性片段是指能夠與抗原結(jié)合的人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5的Fab段。
[0012]本發(fā)明還提供編碼所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5的基因。其中，編碼輕鏈可變區(qū)和編碼重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
[0013]本發(fā)明還提供含有編碼所述人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5的基因的載體及宿主細(xì)胞。
[0014]本發(fā)明還提供一種制備人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體方法，利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集多個(gè)H7N9禽流感病人恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建了人源抗H7N9禽流感病毒 基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異性抗H7N9禽流感病毒的基因工程抗體Fab段。
[0015]該抗體是由存在于抗體輕鏈和重鏈基因可變區(qū)中的高變區(qū)(CDRs)特異性基因序列決定的，并能夠在原核細(xì)胞中獲得有效表達(dá)的特異性結(jié)合H7N9禽流感病毒的功能性抗體。它特異性識(shí)別H7N9禽流感病毒顆?？乖?，與H7N9禽流感病毒具有明顯的酶聯(lián)免疫(ELISA)反應(yīng)和抗H7N9禽流感病毒感染的中和活性功能。
[0016]H7N9禽流感M5特異性的輕鏈和重鏈可變區(qū)基因來(lái)源于對(duì)人源抗H7N9禽流感病毒抗體基因庫(kù)的特異性富積篩選，該抗體庫(kù)的建立來(lái)源于中國(guó)H7N9禽流感病毒病人外周血淋巴細(xì)胞基因。其輕鏈和重鏈可變區(qū)相應(yīng)的三個(gè)CDR區(qū)序列組合及其CDR區(qū)之間的框架區(qū)序列構(gòu)成了該抗體可變區(qū)序列特征，H7N9禽流感M5屬于抗體輕鏈家族VK3。抗體蛋白功能由存在于抗體基因輕鏈和重鏈可變區(qū)的決定族互補(bǔ)區(qū)CDR1、CDR2和CDR3中特異性核苷酸序列及其互補(bǔ)序列所決定，6個(gè)相應(yīng)的CDR區(qū)氨基酸序列構(gòu)成了抗體的特異性抗原結(jié)合區(qū)域，決定了本發(fā)明抗體的抗原結(jié)合特征和抗H7N9禽流感病毒功能特征。
[0017]此外，考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性，例如可在其編碼區(qū)，在不改變氨基酸序列的條件下，對(duì)編碼上述Fab段抗體的基因序列進(jìn)行改造，獲得編碼具有相同功能的抗體的基因。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)表達(dá)抗體宿主的密碼子偏愛(ài)性，人工合成改造基因，以提高抗體的表達(dá)效率。
[0018]進(jìn)一步地，本發(fā)明將上述Fab抗體的輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)進(jìn)行重組，獲得分子量更小的單鏈抗體(ScFv)，該抗體同樣能夠特異性識(shí)別H7N9禽流感病毒表面抗原，具有細(xì)胞內(nèi)免疫的作用。單鏈抗體穿透力強(qiáng)，易于進(jìn)入局部組織發(fā)揮作用。參照朱進(jìn)，王辛，焦永軍，馮振卿，曹伯良，管曉虹.高親和力抗Met人源基因工程抗體scFv的篩選與特性分析[J].中國(guó)腫瘤生物治療雜志，2006，6:417-422。[0019]可將上述編碼Fab抗體的基因、ScFv基因克隆到表達(dá)載體中，進(jìn)而轉(zhuǎn)化宿主，通過(guò)誘導(dǎo)表達(dá)獲得Fab抗體以及單鏈抗體。
[0020]此外，可將上述Fab抗體的輕鏈編碼基因和重Fd段基因克隆到全抗表達(dá)載體中，并導(dǎo)入宿主細(xì)胞中，獲得表達(dá)抗H7N9禽流感病毒的全抗免疫球蛋白。參照 Christoph Rader, MikhaiI Popkov, John A.Neves,and Carlos F.Barbas II1.1ntegrinαVβ 3-targeted therapy for Kapos1.s sarcoma with an in vitro-evolvedantibody.The FASEB Journal.(0ctoberl8, 2002) 10.1096/fj.02_0281fje。
[0021]利用ELISA、SDS-PAGE、中和實(shí)驗(yàn)等方法對(duì)獲得的Fab抗體(即中和性抗體M5)進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明人源Fab抗體M5針對(duì)H7N9病毒A/Anhui/1/2013株病毒顆粒均有特異性結(jié)合，利用中和實(shí)驗(yàn)對(duì)Fab抗體進(jìn)行功能鑒定，結(jié)果表明人源Fab抗體M5具有較好的中和活性。
[0022]本發(fā)明還提供所述中和性抗體M5或其活性片段在制備預(yù)防或治療由H7N9禽流感病毒引起的疾病，特別是呼吸道疾病的藥物中的應(yīng)用。
[0023]本發(fā)明進(jìn)一步含有所述中和性抗體M5或其活性片段的藥物或檢測(cè)試劑。
[0024]本發(fā)明利用噬菌體表面展示技術(shù)，成功篩選獲得了特異性針對(duì)H7N9禽流感病毒的人源中和性抗體M5 ;利用上述獲得的人源中和性抗H7N9禽流感病毒基因工程抗體可變區(qū)基因、Fab抗體基因以及基于該抗體基因的全抗體基因，可以在原核細(xì)胞、真核細(xì)胞(包括酵母細(xì)胞)及任何重組系統(tǒng)中表達(dá)和生產(chǎn)該抗體或以此為基礎(chǔ)的改造后的含有該抗體基因的任何其他基因，獲得具有中和H7N9禽流感病毒感染的抗體產(chǎn)物，制成臨床上用于預(yù)防和治療由H7N9禽流感病毒引起的疾病，如急性呼吸道傳染病的特異性抗體藥物。
【專利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0025]圖1為本發(fā)明實(shí)施例1中純化后H7N9禽流感M5抗體的SDS-PAGE電泳圖；其中，I為純化抗體H7N9禽流感M5，M為蛋白Marker。
[0026]圖2為本發(fā)明實(shí)施例1中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感M5抗體的ELISA檢測(cè)(A/Anhui/1/2013株)結(jié)果；其中，陽(yáng)性對(duì)照為商業(yè)鼠抗，陰性對(duì)照為EV71抗體。
[0027]圖3為本發(fā)明實(shí)施例1中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感M5抗體的中和實(shí)
驗(yàn)結(jié)果。
[0028]圖4為本發(fā)明實(shí)施例3中H7N9禽流感M5抗體構(gòu)建全抗體IgG后的SDS-PAGE電泳圖；其中，I為H7N9禽流感M5全抗體IgG，M為蛋白Marker。
[0029]圖5為本發(fā)明實(shí)施例3中抗H7N9禽流感病毒人源H7N9禽流感M5全抗體IgG的中和實(shí)驗(yàn)結(jié)果，陰性對(duì)照為EV71抗體。
【具體實(shí)施方式】
[0030]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段，所用原料均為市售商品。
[0031]實(shí)施例1
[0032]I材料和方法
[0033]1.1病毒、細(xì)胞及載體來(lái)源:H7N9病毒A/Anhui/1/2013株已在文獻(xiàn)(Gao R, CaoB, Hu Y, Feng Z, Wang D, Hu ff, Chen J, Jie Z, Qiu H, Xu K, Xu X，Lu H, Zhu ff, Gao Z, Xiang N, ShenY, He Z, Gu Y, Zhang Z, Yang Y, Zhao X, Zhou L, Li X, Zou S, Zhang Y, Li X, Yang L, Guo J, DongJ, Li Q, Dong L, Zhu Y, Bai T, Wang S, Hao P, Yang ff, Zhang Y, Han J, Yu H, Li D, Gao GF, WuG, Wang Y, Yuan Z, Shu Y.2013.Human infect1n with a novel avian-origin influenzaA(H7N9) virus.NEngl J.Med.368:1888 - 1897)中公開(kāi)，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所提供。用于H7N9禽流感病毒體外中和實(shí)驗(yàn)的細(xì)胞為MDCK細(xì)胞，購(gòu)自ATCC。構(gòu)建噬菌體抗體庫(kù)所使用的菌株為XLl-Blue (Stratagene,美國(guó))，載體pComb3H(由美國(guó)Scripps研究所提供)。
[0034]1.2抗原制備
[0035]H7N9病毒純化:收獲H7N9病毒A/Anhui/1/2013株感染MDCK細(xì)胞后培養(yǎng)上清，經(jīng)甲醛滅活和安全檢查后，用30% -60%蔗糖密度梯度35000g，4°C離心3h純化病毒顆粒(Beckman SW28)。
[0036]1.3噬菌體抗體庫(kù)的構(gòu)建
[0037]用淋巴細(xì)胞分離液(Sigma，美國(guó))從H7N9禽流感病人恢復(fù)期抗凝血液中分離淋巴細(xì)胞，用RNeasy Mini Kit (QIAGEN，德國(guó))提取細(xì)胞總RNA,以O(shè)ligo-dT為引物，提取的RNA為模板，采用Invitrogen公司的第一鏈合成試劑盒(SuperScriptTM III First-StrandSynthesis System for RT-PCR.Cat N0.18080-051)逆轉(zhuǎn)錄生成 cDNA。用一組擴(kuò)增人源抗體IgGl重鏈Fd及輕鏈Kappa ( K鏈)和Lambda (λ鏈)的引物,使用的引物序列如下: [0038](一)重鏈Fd區(qū)引物
[0039]5，端
[0040]VHla 5，-CAG GTG CAG CTC GAG CAG TCT GGG-3’
[0041]VHlf 5，-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’
[0042]VH2f 5，-CAG GTG CAG CTA CTC GAG TCG GG-3’
[0043]VH3a 5' -GAG GTG CAG CTC GAG GAG TCT GGG-3'
[0044]VH3f 5’-GAG GTG CAG CTG CTC GAG TCT GGG-3’
[0045]VH4f 5’-CAG GTG CAG CTG CTC GAG TCG GG-3’
[0046]VH6f 5’-CAG GTG CAG CTA CTA GAG TGG GG-3’
[0047]VH6a 5’-CAG GTA CAG CTC GAG CAG TCA GG-3’
[0048]3，端
[0049]CGlZ 5’ -GCA TGT ACT AGT TTT GTC ACA AGA TTT GGG-3'
[0050](二)輕鏈引物
[0051]κ鏈可變區(qū)5’端
[0052]VKla 5’-GAC ATC GAG CTC ACC CAG TCT CCA-3’
[0053]VK2a 5’-GAT ATT GAG CTC ACT CAG TCT CCA-3’
[0054]VK3a 5’-GAA ATT GAG CTC ACG CAG TCT CCA-3’
[0055]K鏈可變區(qū)3’端
[0056]CKld 5’ -GCG CCG TCT AGA ATT MC ACT CTC CCC TGT TGA AGCTCT TTG TGA CGG GCG AACTCA-3’
[0057]λ鏈可變區(qū)5’端[0058]VLl 5’-AAT TTT GAG CTC ACT CAG CCC CAC-3’
[0059]VL2 5’ -TCT GCC GAG CTC CAG CCT GCC TCC GTG-3’
[0060]VL3 5’ -TCT GTG GAG CTC CAG CCG CCC TCA GTG-3'
[0061 ] VL4 5’ -TCT GAA GAG CTC CAG GAC CCT GTT GTG TCT GTG-3'
[0062]VL5 5，-CAG TCT GAG CTC ACG CAG CCG CCC-3，
[0063]VL6 5’-CAG ACT GAG CTC ACT CAG GAG CCC-3’
[0064]λ鏈可變區(qū)3’端 [0065]CL2 5’ -CGC CGT CTA GAA TTA TGA ACA TTC TGT AGG-3’
[0066]對(duì)人源輕鏈和重鏈Fab基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR條件為:94°C lmin，54°C lmin,72°C 2min,共 35 個(gè)循環(huán)。建庫(kù)方法基本按文獻(xiàn)(Barbas, C.FII1., Kang, A.S., and larner, R.A.Assembly of combinatorial antibody libraries on phage surface: the gene III site.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.1991 ；88(18):7978-7982)進(jìn)行。具體如下:
[0067]首先將所有不同的重鏈和輕鏈PCR產(chǎn)物分別按各自組群混合。取經(jīng)XbaI和SacI酶切消化，并經(jīng)電泳純化后的pComb3H載體DNA1.5-2 μ g與輕鏈混合物500_700ng，加入2μ I高濃度連接酶(ΝΕΒ2000υ/μ 1)，加入連接緩沖液，16°C過(guò)夜連接。次日加入100 μ I純化水，加入3Μ NaAc 16 μ 1，加2.5-3倍無(wú)水乙醇沉淀DNA，離心沉淀，用20 μ I純水重懸沉淀后加入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌XLl-Blue中，電壓2.5kv，電擊I分鐘。電轉(zhuǎn)后立即加入2mL SOC培養(yǎng)液，然后立即轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，37°C振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。將菌液全部涂于含氨芐青霉素的LB平皿上，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日向平皿中加入10-15mL培養(yǎng)液，刮取菌斑，分裝于離心管，12000rpm離心后棄上清，全部用QIAGEN大提質(zhì)粒試劑盒提取質(zhì)粒pComb3H-L，混合后凍存于-20°C待用。將克隆入L鏈的pComb3H-L和Fd鏈純化PCR產(chǎn)物，分別用XhoI和SpeI進(jìn)行雙酶切反應(yīng)，37°C 3-4h。電泳回收相應(yīng)的條帶，將質(zhì)粒和Fd酶切后回收產(chǎn)物定量。取酶切消化后回收純化的載體DNA 2 μ g，重鏈PCR產(chǎn)物600ng左右，加入2μ I高濃度連接酶，加入相應(yīng)的連接緩沖液，16°C連接過(guò)夜。次日加100μ I純化水，加3MNaAcl6y 1，加2.5-3倍無(wú)水乙醇沉淀DNA，離心沉淀，用20 μ I純水重懸沉淀并加入到電轉(zhuǎn)感受態(tài)菌XLl-Blue中，電壓2.5kv,電擊I分鐘。電轉(zhuǎn)后立即加入2mL SOC培養(yǎng)液，然后立即轉(zhuǎn)入細(xì)菌培養(yǎng)箱中，370C 200rpm振蕩培養(yǎng)lh。將菌液轉(zhuǎn)入一個(gè)三角瓶中，加入含20 μ g/ml氨芐青霉素的1mLSB培養(yǎng)基，37°C 200rpm振蕩培養(yǎng)I小時(shí)。加入10ml SB培養(yǎng)液(含100 μ g/mL的Amp和20 μ g/mL的Tet)，震蕩培養(yǎng)I小時(shí)。加入1012pfu輔助噬菌體VCSM13，37°C靜止感染20min，然后37°C培養(yǎng)2h加入終濃度為70 μ g/ml的Kan，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。待OD6tltl約為I時(shí)，將菌液4°C 4000rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至無(wú)菌三角瓶中，加入4% (w/v)PEG8000和3% (w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以沉淀噬菌體。4°C 9000rpm離心20_30min，棄上清將沉淀用2mL PBS重懸，瞬時(shí)離心，上清即為Fab噬菌體抗體庫(kù)。
[0068]1.4噬菌體抗體庫(kù)的富集篩選及Fab段抗體的誘導(dǎo)表達(dá)
[0069]以超速離心純化的滅活病毒顆粒A/Anhui/1/2013株為篩選抗原。使用時(shí)用0.1MNaHCO3 (pH8.6)溶液稀釋，包被免疫管，用含4%脫脂奶的PBS液，于37°C封閉2h后，加入上述噬菌體抗體庫(kù)，每管lmL，37°C孵育2h，用含5% Tween-20的TBS液反復(fù)洗20遍，最后每管用ImL pH2.2的甘氨酸-鹽酸洗脫液洗脫，并用pH9.6的Tris液中和。洗脫后的噬菌體繼續(xù)感染2mL新鮮的0D_約為I的XLl-Blu菌，經(jīng)輔助噬菌體VCSM13 (Stratagene，美國(guó))感染后進(jìn)行下一輪篩選。如此反復(fù)篩選3~4次。具體富集篩選方法及Fab段的誘導(dǎo)表達(dá)基本按文獻(xiàn)(Barbas, C.F II1., Kang, A.S., and larner, R.A.Assembly of combinatorialantibody libraries on phage surface: the gene III site.Proc.Natl.Acad.Sc1.USA.1991 ；88(18):7978-7982)進(jìn)行。
[0070]噬菌體抗體庫(kù)的富集:用0.1M NaHCO3 (pH8.6)的溶液將純化的A/Anhui/1/2013株按1:100稀釋分別包被96孔板，4°C過(guò)夜。次日用PBS-T (20mM PBS加入0.05 %吐溫-20)洗去未吸附的抗原，用3%的脫脂奶37°C封閉lh。棄封閉液，每孔加入60 μ I噬菌體抗體庫(kù)，37°C孵育2h。棄去孔中未結(jié)合的噬菌體，用TBS-T(50mM Tris-HCl, 150mM NaCl,0.5%吐溫-20，pH7.5)洗液沖洗各孔，沖洗時(shí)用移液器反復(fù)吹打，共洗20次，以充分洗去未吸附的噬菌體。最后用ddH20洗兩遍，吸凈孔中剩余液體。每孔加入50 μ I甘氨酸-HCl (ρΗ2.2)的洗脫液，室溫孵育lOmin，在此過(guò)程中，用移液器吸頭反復(fù)吹打(注意勿吹出氣泡)。將洗脫液集中于一個(gè)離心管，按照每孔3 μ I的比例加入2Μ Tris,使溶液pH值約為7，以中和洗脫下的噬菌體。將洗脫的噬菌體立即加入2mL新鮮的XLl-Blue菌液中(OD6tltl = I)，室溫孵育20min。轉(zhuǎn)入一個(gè)250mL三角瓶中，加入1mL SB (含氨節(jié)青霉素20 μ g/ml和四環(huán)素20 μ g/mL)，立即取10 μ I涂于氨芐平皿，用于滴定噬菌體。其余液體37°C振蕩培養(yǎng)lh。加入10mL SB (含氨芐青霉素100 μ g/ml和四環(huán)素20 μ g/mL)，37°C振蕩培養(yǎng)2h。之后，加入輔助噬菌體VCSM13 (9 X 1012pfu/mL) ImL, 37°C靜止20min，37°C振蕩培養(yǎng)2h。加入卡那霉素(終濃度70 μ g/mL)，37°C振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。待細(xì)菌長(zhǎng)到OD6tltl約為I時(shí)，將菌液4°C 6500rpm離心15min，轉(zhuǎn)移上清至無(wú)菌三角瓶，加入4% (W/v)PEG8000和3% (w/v)NaCl，完全溶解后冰浴30min以上以充分沉淀噬菌體。4°C 9000rpm離心20_30min，棄上清。將沉淀用2mL PBS重懸，瞬時(shí)離心，上清即為第一輪富集篩選Fab噬菌體抗體庫(kù)。
[0071]Fab陽(yáng)性克隆的表達(dá):隨機(jī)挑選1600個(gè)經(jīng)3次富集篩選后的單菌落于96深孔板中，每孔800 μ I培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過(guò)夜。次日以1:20的比例轉(zhuǎn)接至含有800 μ I SB培養(yǎng)基(含Amp 100 μ g/mL)的96孔板中，37°C培養(yǎng)至OD6tltl = 0.2_0.3時(shí)，加入終濃度為ImM的IPTG, 30°C誘導(dǎo)表達(dá)8-10h。4°C 4000rpm離心15min,上清用于檢測(cè)。
[0072]1.5人源抗H7N9病毒Fab抗體的ELISA檢測(cè)
[0073](I)檢測(cè)Fab的表達(dá)
[0074]用0.1M NaHCO3 (pH9.6)溶液將抗人Fab抗體(1:2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))包被于酶標(biāo)板上，4°C過(guò)夜；4%脫脂奶封閉，37°C lh，加入表達(dá)的Fab抗體，37°C Ih ;加入酶標(biāo)抗人Fab 二抗(1:2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))，37°C Ih ;顯色液顯色，2M H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度A值。
[0075](2)間接酶聯(lián)免疫法檢測(cè)Fab與H7N9病毒結(jié)合活性
[0076]用純化的滅活H7N9病毒顆粒作為包被抗原，其余步驟同上。
[0077]1.6人源Fab抗體可變區(qū)基因的核酸序列分析[0078]用QiagenMiniprep Kit (QIAGEN,德國(guó))制備質(zhì)粒DNA進(jìn)行核酸序列分析。輕重鏈的測(cè)序引物分別為5 ' -AAACTAGCTAGTCGCCAAGGA-3 ’和5 ; -CCGCGGTGGCGGCCGCAAAT-3 ;。將測(cè)序結(jié)果與 Internet V-Base 基因庫(kù)中 IgG 基因序列進(jìn)行比較。
[0079]1.7人源抗H7N9病毒Fab抗體的純化[0080]用抗人Fab的抗體(Sigma,美國(guó))制備2mL親和層析柱,將濾過(guò)的含F(xiàn)ab抗體的菌液加于親和層析柱中，反復(fù)循環(huán)30min至lh。加入pH值6.8的PBS預(yù)洗緩沖液，洗去非特異性吸附蛋白。加入pH值2.7的甘氨酸鹽酸緩沖液洗脫結(jié)合的Fab抗體蛋白，加入pH值9.0的Tris-HCl緩沖液中和洗脫下來(lái)的溶液，然后用濃縮柱離心濃縮。取純化濃縮后的Fab片段蛋白10-20 μ g進(jìn)行SDS-PAGE電泳。
[0081]1.8人源抗H7N9病毒Fab抗體的中和實(shí)驗(yàn)檢測(cè)
[0082](I)實(shí)驗(yàn)步驟
[0083]將100TCID50H7N9禽流感A/Anhui/1/2013株病毒50 μ I和倍比稀釋的抗體50 μ I于37°C共同孵育2小時(shí)，然后加入濃度為2X 15個(gè)MDCK細(xì)胞/mL的細(xì)胞培養(yǎng)液100 μ I。觀察4天，記錄細(xì)胞病變結(jié)果。
[0084](2)結(jié)果判定
[0085]以可以保護(hù)50%細(xì)胞不發(fā)生病變的最高稀釋度的倒數(shù)作為中和抗體的滴度。
[0086]2 結(jié)果
[0087]2.1人源抗Η7Ν9病毒抗體庫(kù)的篩選
[0088]用純化的Η7Ν9病毒顆粒A/Anhui/1/2013株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)進(jìn)行富集篩選，3輪篩選后隨機(jī)挑取1600個(gè)克隆。用抗人Fab抗體(1:2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))和H7N9禽流感病毒顆粒A/Anhui/1/2013株抗原包被96孔板，加入待測(cè)樣品上清，用酶標(biāo)抗人Fab二抗(1:2000稀釋后使用，Sigma，美國(guó))檢測(cè)。結(jié)果顯示共獲得1146個(gè)人源Fab表達(dá)陽(yáng)性克隆，其中，935個(gè)克隆能夠特異性結(jié)合H7N9禽流感病毒顆粒A/Anhui/1/2013株(表2)。
[0089]表2 A/Anhui/1/2013株對(duì)噬菌體抗體庫(kù)富集篩選結(jié)果
[0090]
【權(quán)利要求】
1.人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體M5或其活性片段，其特征在于，其輕鏈及重鏈高變區(qū)⑶R1、⑶R2和⑶R3的氨基酸序列如下表所示:
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的中和性抗體M5，其特征在于， i)其輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.1所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列；以及 ?)其重鏈可變區(qū)的氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示，或該序列經(jīng)替換、缺失或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。
3.編碼權(quán)利要求2所述中和性抗體M5的基因。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于，編碼輕鏈可變區(qū)和重鏈可變區(qū)的核苷酸序列分別如SEQ ID N0.3和SEQ ID N0.4所示。
5.含有權(quán)利要求3或4所述基因的載體。
6.含有權(quán)利要求3或4所述基因的宿主細(xì)胞。
7.權(quán)利要求1所述中和性抗體M5或其活性片段經(jīng)改造得到的單鏈抗體ScFv或全抗體免疫球蛋白IgG。
8.一種制備人源抗H7N9禽流感病毒中和性抗體方法，其特征在于，利用噬菌體表面展示技術(shù)，采集H7N9禽流感病人恢復(fù)期外周血淋巴細(xì)胞，通過(guò)基因工程方法構(gòu)建了人源抗H7N9禽流感病毒基因工程抗體文庫(kù)，并篩選獲得特異性抗H7N9禽流感病毒的基因工程抗體Fab段。
9.權(quán)利要求1或2所述中和性抗體M5或其活性片段在制備預(yù)防或治療由H7N9禽流感病毒引起的疾病的藥物中的應(yīng)用。
10.含有權(quán)利要求1或2所述中和性抗體M5或其活性片段的藥物或檢測(cè)試劑。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104031146SQ201410272734
【公開(kāi)日】2014年9月10日 申請(qǐng)日期:2014年6月18日 優(yōu)先權(quán)日:2013年8月2日
【發(fā)明者】陳哲, 金奇 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院病原生物學(xué)研究所