一種羊口瘡病毒蛋白o(hù)rfv086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2g8d10及其單克隆抗體的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種羊口瘡病毒蛋白ORFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株’[2G8D10及其單克隆抗體。該雜交瘤細(xì)胞株2G8D10的保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201471。而該單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC?NO：C201471的雜交瘤細(xì)胞株2G8D10分泌產(chǎn)生。該單克隆抗體能夠與羊口瘡病毒蛋白ORFV086發(fā)生高靈敏度的特異性抗原-抗體反應(yīng)，能夠有效用于對(duì)羊口瘡病毒蛋白ORFV086進(jìn)行包括ELISA、western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)在內(nèi)的生物診斷。
【專利說明】-種羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株 2G8D10及其單克隆抗體
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及細(xì)胞工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤 細(xì)胞株2G8D10及其單克隆抗體。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊傳染性膿皰病（Orf)又稱羊傳染性膿皰性炎，俗稱羊口瘡，是由口瘡病毒 (ORFV)引起的山羊和綿羊的一種急性、接觸性傳染病。其病變特征是患羊口唇等處皮膚和 黏膜形成紅斑、丘疹、膿瘡、潰瘍和疣狀結(jié)痂。羔羊極易感，多群發(fā)。本病在世界各地均有發(fā) 生，我國(guó)主要養(yǎng)羊區(qū)也較常見，是危害羊群的主要疾病之一。該病毒抵抗力強(qiáng)，羊群一旦被 感染則不易清除，可持續(xù)危害羊群多年，給畜牧業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。
[0003] 0RFV病毒屬痘病毒科，副痘病毒屬。病毒粒子呈磚形或橢圓形，其表面呈繩索樣縱 橫交錯(cuò)排列結(jié)構(gòu)。該病毒可在牛、綿羊、山羊的腎細(xì)胞以及犢牛和羔羊的睪丸細(xì)胞上生長(zhǎng)， 并產(chǎn)生細(xì)胞病變。0RFV引發(fā)病灶的病理組織學(xué)特征包括角化細(xì)胞的空泡變化、腫脹，細(xì)胞 間質(zhì)玻璃樣變性，表皮增生顯著，表皮內(nèi)微腫脹，皮下組織中性粒細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞（DCs)、 T細(xì)胞和B細(xì)胞聚集。
[0004] 羊口瘡分布廣泛，傳染性強(qiáng)，一旦爆發(fā)會(huì)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。病毒在病變部位持 續(xù)存在，患病動(dòng)物易重復(fù)感染，目前無有效疫苗，防控困難。因此，羊口瘡病毒的早期、準(zhǔn)確 檢出對(duì)于疾病的控制和預(yù)防具有重要的意義。獸醫(yī)臨床上羊口瘡病的診斷主要根據(jù)其典型 癥狀進(jìn)行診斷，但無法與口蹄疫（foot-and-mouth disease, FMD)和羊痘（Capripox)區(qū)分。 目前所采用的實(shí)驗(yàn)室診斷方法分為，（1)免疫學(xué)方法（ELIS, Western blotting) ; (2)病理組 織學(xué)；（3)PCR和限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP)分析等。其中以免疫學(xué)診斷方法最為重要， 因其具有靈敏、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，而特異性的抗體尤其是單克隆抗體是免疫學(xué)診斷中最重 要的工具。近年，在我國(guó)吉林省和甘肅省的羊群中爆了發(fā)羊口瘡疫情，由于特異性抗體的缺 乏，疾病控制和進(jìn)一步研究工作無法有效開展。
[0005] 0RFV基因組全長(zhǎng)約138kb，G+C含量豐富（63% -64% )，含132個(gè)基因。通過對(duì)羊 口瘡病毒不同株（系）的基因組分析表明，0RFV086基因編碼的是一個(gè)病毒體核心蛋白，該 蛋白大約100. 05KD。該蛋白定位于成熟病毒粒子內(nèi)，是重要的結(jié)構(gòu)蛋白，與牛痘病毒前體 蛋白P4a其他同源痘病毒蛋白結(jié)構(gòu)相似。從牛痘病毒的研究當(dāng)中，充分水解含量最豐富的 主要結(jié)構(gòu)蛋白p4a可以得到的62, 23和9kDa三個(gè)片段是成熟感染性的VV子代病毒必不可 少的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。因此，主要核心蛋白p4a和牛痘病毒39-kDa蛋白（VVA4L基因編碼）形成 一個(gè)穩(wěn)定的復(fù)合物，VV A4L基因和0RFV080基因同源性比較高.因此制備針對(duì)核心結(jié)構(gòu)蛋 白抗原的單克隆抗體具有重大意義，可以用來研究0RFV086蛋白水解，病毒整合，羊傳染性 膿皰?。ī杛f)致病機(jī)制和研究如何控制疾病的擴(kuò)散。
[0006] 目前國(guó)內(nèi)外尚未有商品化0RFV086的抗體，且其單抗亞型為IgG2b型，能用于 ELISA、western-blot、免疫突光以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)，從而為該蛋白作為臨床祀標(biāo)驗(yàn)證 及其功能的研究奠定了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007] 本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于克服上述現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種羊口瘡病毒蛋 白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2G8D10及其單克隆抗體，能夠用于對(duì)羊口瘡病毒蛋 白0RFV086進(jìn)行包括ELISA、western-blot、免疫熒光以及免疫組織化學(xué)檢測(cè)在內(nèi)的生物診 斷。
[0008] 本發(fā)明提供了羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2G8D10,該細(xì)胞 株于2014年4月23日在中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心（地址：中國(guó)，武漢，武漢大學(xué)）保藏，保 藏編號(hào)為CCTCC NO :C201471。另外，本發(fā)明提供了羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體， 該單克隆抗體由保藏編號(hào)為CCTCC NO :C201471的雜交瘤細(xì)胞株2G8D10分泌產(chǎn)生。本發(fā)明 的羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體是用原核重組表達(dá)的0RFV086蛋白作為抗原免疫 BALB/C小鼠獲得，并用細(xì)胞融合技術(shù)獲得產(chǎn)生這種抗體的雜交瘤細(xì)胞株2G8D10,雜交瘤細(xì) 胞分泌的抗體為IgG2b，輕鏈均為κ型。
[0009] 本發(fā)明是通過如下方法獲得上述羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì) 胞株2G8D10及其單克隆抗體：
[0010] 1)重組0RFV086抗原制備
[0011] 本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白0RFV086的氨基酸序列為AFX81702. 1，如SEQ IDN0 :1所 示。本發(fā)明中羊口瘡病毒蛋白0RFV086的基因序列為JQ729675. 1，如SEQ IDN0 :2所示。本 發(fā)明中0RFV086的全長(zhǎng)基因是由羊口瘡病毒基因組為模板，由PCR擴(kuò)增獲得。擴(kuò)增0RFV086 基因的引物序列為：上游引物：5' -TAGGATCCGATGACGGCCCCAAACGTGCA-3'（SEQ ID NO :3)，下 游引物：5' -GCAAGCTTCTCACTGTCAAAAGAAAACGGC-3'（SEQ ID NO :4)。上游引入 BamH I 內(nèi)切 酶位點(diǎn)，下游引入Hind III內(nèi)切酶位點(diǎn)。原核表達(dá)載體選擇pET-33b (+)。
[0012] 以羊口瘡病毒基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)0RFV086基因，構(gòu)建原核重組 表達(dá)載體PET33b(+)/0RFV086在大腸桿菌Escherichia coli BL21中表達(dá)，利用尿素打開包 涵體，電泳跑膠后進(jìn)行割膠純化，獲得純度達(dá)90%以上的重組0RFV086蛋白。
[0013] 2)免疫小鼠
[0014] 以純化的重組抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。
[0015] 第一次免疫：取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0016] 第二次免疫：隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0017] 第三次免疫：再隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾靜脈取血，以重組抗 原包被，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，取效價(jià)大于1:10 5的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合。其 中，Bentonite佐劑使用商品化產(chǎn)品，由市面購買取得。
[0018] 3)免疫血清效價(jià)測(cè)定
[0019] 采用間接ELISA法測(cè)定免疫血清效價(jià)。取50yg重組0RFV086蛋白溶解于 10ml0. 05M pH9. 6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100 μ 1/孔，4°C過夜。使用 PBS (含有 0· 05 % (V/V) Tween-20)洗板三次，用 lOmM PBS 含 1 % BSA 封閉液 100 μ 1/ 孔， 37 °C封閉2h，使用PBS (含有0.05 % (V/V) Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后10 天小鼠尾靜脈采血，鼠免疫血清用含1% BSAlOmM PBS以10_2?10_8倍稀釋，加入96孔板， 100以1/孔371：111，？85(含有0.05%(￥/￥)了￥6611-20)洗板三次后，加入 1:10000 倍稀釋 辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG(Sigma，INC.)，100 μ 1/孔37°C 30min，同上洗板后，TMB 顯色，100 μ 1/孔，室溫避光lOmin，加50 μ 1/孔2M H2S02終止反應(yīng)，測(cè)450nm吸收值，以免疫 前小鼠血清作為陰性對(duì)照，以測(cè)定值與對(duì)照值得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價(jià)。
[0020] 4)雜交瘤的制備
[0021] 取血清效價(jià)大于1:1〇5的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻后， 以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。無菌取小鼠脾臟， 制成脾細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0按1 :1的比例混合，lOOOXg室 溫離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉淀松散，離心管置于37°C水浴中，將在 37°C水浴保溫的50%聚乙二醇（PEG，MW4000, Sigma)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊 搖動(dòng)離心管，lmin內(nèi)滴完，滴完后靜置2min,每隔1分鐘加入37°C預(yù)熱的無血清1640培 養(yǎng)基lml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml來終止聚乙二醇的作用，細(xì)胞混合物lOOOXg室溫離 心5min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)液（次黃嘌呤（H)、氨基喋呤（A)和胸腺嘧啶核苷（T) (HAT， Sigma))輕輕重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分至96孔板中，每孔200μ1。培養(yǎng)三天后，觀察細(xì)胞融合情 況，更換一半HAT培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，融合后七天更換ΗΤ培養(yǎng)液（次黃嘌 呤⑶和胸腺嘧啶核苷（T) (HT，Sigma))培養(yǎng)。
[0022] 5)篩選分泌抗0RFV086單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
[0023] 間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇效價(jià)較高的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克 隆化，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，直至到100%細(xì)胞陽性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗 0RFV086單克隆抗體細(xì)胞株，標(biāo)記為2G8D10。將克隆化后陽性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后 液氮凍存。
[0024] 6)腹水的制備和純化
[0025] 將2G8D10雜交瘤細(xì)胞株以1X106/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的 BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10-14天后小鼠腹部膨大時(shí)抽取腹水。采用親和色譜法 Protein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE測(cè)定單克隆抗體的純度，純 度達(dá)到90%以上。
[0026] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明特色如下：
[0027] 本發(fā)明以重組0RFV086蛋白包被ELISA板，通過ELISA法檢測(cè)純化抗體的陽性，并 用此純化抗體對(duì)純化的羊口瘡病毒蛋白進(jìn)行Western-blot證明該抗體可以識(shí)別0RFV086 蛋白。
[0028] 本發(fā)明將此純化抗體用于進(jìn)行羊口瘡病毒的免疫熒光染色以及羊口瘡組織的免 疫組化染色證明其能識(shí)別天然的0RFV086蛋白。此株雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆抗體為進(jìn)一 步研究的0RFV086功能和開發(fā)0RFV086的診斷試劑奠定了基礎(chǔ)，為其作為羊口瘡臨床診斷 和治療祀標(biāo)的驗(yàn)證提供有力的工具。
[0029] 本發(fā)明的單克隆抗體其免疫原是原核重組表達(dá)0RFV086全長(zhǎng)蛋白，其氨基酸序列 為AFX81702. 1，全長(zhǎng)905個(gè)氨基酸。本發(fā)明的單克隆抗體除了能應(yīng)用于ELISA和Western 檢測(cè)變性0RFV086蛋白以外還可以應(yīng)用于細(xì)胞免疫熒光和臨床羊口瘡組織標(biāo)本免疫組化 研究檢測(cè)未變性的天然0RFV086蛋白，同時(shí)降低了應(yīng)用成本。目前國(guó)內(nèi)外尚無針對(duì)羊口瘡 病毒特異性抗體，而本發(fā)明的抗體不僅能與變性蛋白結(jié)合，還能與具有高級(jí)結(jié)構(gòu)的天然蛋 白結(jié)合，從而能應(yīng)用于免疫熒光和免疫組化實(shí)驗(yàn)。本發(fā)明針對(duì)0RFV086全長(zhǎng)蛋白制備出的 單克隆抗體對(duì)檢測(cè)該蛋白具有較高的特異性和靈敏度，該抗體的應(yīng)用將為0RFV086功能研 究和其作為羊口瘡標(biāo)志物的臨床標(biāo)本驗(yàn)證工作提供支持。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030] 圖1是本發(fā)明0RFV086蛋白重組表達(dá)鑒定結(jié)果。
[0031] 圖2是本發(fā)明單抗2G8D10對(duì)羊口瘡病毒免疫印跡的結(jié)果，其結(jié)合條帶的分子量 約為lOOkDa，并且對(duì)水解的各個(gè)片段都能檢測(cè)。
[0032] 圖3是本發(fā)明單抗2G8D10對(duì)羊口瘡病毒免疫熒光染色的結(jié)果；
[0033] 圖4是本發(fā)明單抗2G8D10對(duì)羊口瘡免疫組織化學(xué)染色的結(jié)果以及陰性對(duì)照結(jié)果 (顯微鏡放大倍數(shù)100倍）。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這 些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
[0035] 實(shí)施例1本發(fā)明單克隆抗體的制備和鑒定
[0036] 1、單抗2G8D10的制備
[0037] 1)重組0RFV086抗原制備
[0038] 以羊口瘡病毒基因組為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得全長(zhǎng)0RFV086基因，構(gòu)建原核重組 表達(dá)載體PET33b(+)/0RFV086在大腸桿菌Escherichia coli BL21中表達(dá)，利用尿素打開包 涵體，電泳跑膠后進(jìn)行割膠純化，獲得純度達(dá)90%以上的重組0RFV086蛋白。
[0039] 2)免疫小鼠
[0040] 以純化的重組抗原免疫6-8周齡雌性BALB/c小鼠。
[0041] 第一次免疫：取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0042] 第二次免疫：隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔內(nèi)注射BALB/c小鼠；
[0043] 第三次免疫：再隔2周后，取重組抗原與等體積的Bentonite佐劑混勻后，以每只 50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c小鼠；第三次免疫10天后小鼠尾靜脈取血，以重組抗 原包被，ELISA檢測(cè)血清效價(jià)，取效價(jià)大于1:10 5的小鼠脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合；
[0044] Bentonite佐劑使用商品化產(chǎn)品。
[0045] 3)免疫血清效價(jià)測(cè)定
[0046] 采用間接ELISA法測(cè)定免疫血清效價(jià)。取50 μ g重組0RFV086蛋白溶解于10ml 0.05MpH9.6碳酸鹽緩沖液，包被聚苯乙烯微96孔板，100μ 1/孔，4°C過夜。使用PBS (含 有 0.05% (V/V)Tween-20)洗板三次，用 lOmMPBS 含 1% BSA 封閉液 100μ 1/孔，37°C封閉 2h，使用PBS (含有0. 05 % (V/V) Tween-20)洗板三次，小鼠于第三次免疫后10天小鼠尾靜 脈采血，鼠免疫血清用含1 % BSAlOmM PBS以10_2?10_8倍稀釋，加入96孔板，100 μ 1/孔 37°C lh，PBS(含有0.05% (V/V)Tween-20)洗板三次后，加入1 :10000倍稀釋辣根過氧化物 酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG(Sigma，INC.)，100μ 1/孔37°C 30min，同上洗板后，TMB顯色，100μ 1/ 孔，室溫避光l〇min，加50 μ 1/孔2Μ H2S02終止反應(yīng)，測(cè)450nm吸收值，以免疫前小鼠血清作 為陰性對(duì)照，以測(cè)定值與對(duì)照值得比> 2. 1為陽性來判斷免疫血清的效價(jià)。
[0047] 4)雜交瘤的制備
[0048] 取血清效價(jià)大于1:105的小鼠，融合前3天，取重組抗原與等體積的PBS混勻后， 以每只50 μ g/500 μ L的量腹腔注射BALB/c待融合小鼠進(jìn)行加強(qiáng)免疫。無菌取小鼠脾臟， 制成脾細(xì)胞懸液與對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的小鼠骨髓瘤細(xì)胞株SP2/0按1 :1的比例混合，1000Xg室 溫離心5min，棄上清，用手指輕彈離心管底部，使沉淀松散，離心管置于37°C水浴中，將在 37°C水浴保溫的50%聚乙二醇（PEG，MW4000, Sigma)用滴管一滴滴加入離心管中，邊滴邊 搖動(dòng)離心管，lmin內(nèi)滴完，滴完后靜置2min,每隔1分鐘加入37°C預(yù)熱的無血清1640培 養(yǎng)基lml、2ml、3ml、4ml、5ml和10ml來終止聚乙二醇的作用，細(xì)胞混合物1000Xg室溫離 心5min，棄上清，加入HAT培養(yǎng)液（次黃嘌呤（H)、氨基喋呤（A)和胸腺嘧啶核苷（T) (HAT， Sigma))輕輕重懸細(xì)胞，將細(xì)胞分至96孔板中，每孔200μ1。培養(yǎng)三天后，觀察細(xì)胞融合情 況，更換一半HAT培養(yǎng)液，連續(xù)數(shù)日，直至有克隆形成，融合后七天更換ΗΤ培養(yǎng)液（次黃嘌 呤（H)和胸腺嘧啶核苷（T) (HT，Sigma))培養(yǎng)。
[0049] 5)篩選分泌抗0RFV086單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞
[0050] 間接ELISA法篩選細(xì)胞培養(yǎng)上清，選擇效價(jià)較高的陽性克隆雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行亞克 隆化，并用有限稀釋法連續(xù)克隆化2-3次，直至到100%細(xì)胞陽性率，最后獲得穩(wěn)定分泌抗 0RFV086單克隆抗體細(xì)胞株，標(biāo)記為2G8D10。將克隆化后陽性率達(dá)100%的細(xì)胞擴(kuò)增培養(yǎng)后 液氮凍存。
[0051] 6)腹水的制備和純化
[0052] 將2G8D10雜交瘤細(xì)胞株以1X106/只的量注入液體石蠟預(yù)處理的8-10周齡的 BALB/c雌性小鼠腹腔，飼養(yǎng)觀察10-14天后小鼠腹部膨大時(shí)抽取腹水。采用親和色譜法 Protein G Sepharose Fast Flow純化單克隆抗體，以SDS-PAGE測(cè)定單克隆抗體的純度，純 度達(dá)到90%以上。
[0053] 實(shí)施例2、單克隆抗體的特性鑒定
[0054] 1)抗體濃度的測(cè)定：經(jīng)雜交瘤細(xì)胞CCTCC NO :C201471制備的腹水經(jīng)純化后獲得 0RFV086單克隆抗體2G8D10,分別使用BI0-RAD公司生產(chǎn)的Smart Spec plus核酸蛋白測(cè)定 儀測(cè)定，其濃度分別為〇. 51mg/ml。
[0055] 2)抗體亞型鑒定：采用Roche公司的鼠單抗亞型鑒定試劑盒鑒定雜交瘤細(xì)胞株的 亞型，2G8D10分泌抗體的亞型均為IgG2b型，輕鏈均為κ鏈，如圖1所示。
[0056] 3)純化抗體的效價(jià)鑒定：50 μ g重組0RFV086抗原溶于10ml ρΗ9· 6的0· 05M碳酸 鹽包被緩沖液中，加入96孔板每孔100 μ L，4°C過夜。PBS (含有0.05 % (V/V) Tween-20) 洗板三次，用10mM PBS含1 % BSA封閉液150 μ 1/孔，37°C封閉2h，使用PBS (含有0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入100μ 1純化抗體，37°C孵育lh，PBS (含有0. 05% (V/ V) Tween-20)洗板三次，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠 IgG多克隆抗體為二抗，37°C孵 育 30min，PBS (含有 0. 05% (V/V)Tween-20)洗板三次，每孔加入 100μ 1 TMB 顯色，37°C孵 育15min后，加入2M H2S04溶液終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀在吸光度值450nm處檢測(cè)。
[0057] 4)抗體的Western blot鑒定：純化的羊口瘡病毒蛋白用2XSDS裂解緩沖液裂解 后上樣，經(jīng)12% SDS-PAGE后用Bio-Rad電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%脫脂奶 粉封閉lh，pH7. 4的Tris-HCl緩沖液（含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min， 1:1000加入經(jīng)純化的雜交瘤細(xì)胞CCTCCNO :C201471制備的抗0RFV086單克隆抗體2G8D10， 4°C孵育過夜，pH7. 4的Tris-HCl緩沖液（含有0. 1% (V/V)Tween-20)洗膜3次，每次5min， 加入1:10000稀釋的羊抗鼠 IgG多克隆抗體（Sigma)為二抗，室溫孵育2h，TBST洗膜3 次，用濾紙吸去多余的溶液，平鋪于干凈的保鮮紙上，加入1. 4ml Pierce-Thermo Scientific ECL系列Western化學(xué)發(fā)光底物反應(yīng)液（A:B = 1:1)，使膜完全浸潤(rùn)于反應(yīng)液中，迅速取出， 用濾紙吸去多余液體，鋪于另一張保鮮紙上，用保鮮紙把膜包好，放入X射線攝影暗盒，在 暗房中顯影。雜交瘤細(xì)胞CCTCC NO :C201471制備的抗0RFV086單克隆抗體2G8D10均出現(xiàn) 針對(duì)0RFV086各片段的特異性條帶，表達(dá)0RFV086基因的載體4A-086做瞬時(shí)表達(dá)，用單克 隆抗體2G8D10做western-blotting驗(yàn)證，結(jié)果表明該單抗可識(shí)別真核表達(dá)的0RFV086全 長(zhǎng)以及GGS-905,結(jié)果如圖2所示。
[0058] 5)抗體的免疫熒光鑒定：收集原代綿羊胎兒鼻甲骨（OFTu)細(xì)胞鋪于玻璃片上生 長(zhǎng)過夜，羊口瘡病毒（0RFV)感染（Μ0Ι = 5)24h，PBS洗滌細(xì)胞，使用預(yù)冷的多聚甲醛固定細(xì) 胞，分別加入雜交瘤細(xì)胞CCTCC NO :C201471制備的抗0RFV086單克隆抗體2G8D10 (1:1000 稀釋），室溫孵育lh，以PBS為陰性對(duì)照。PBS洗片后1:1000加入熒光標(biāo)記羊抗鼠二抗 (Sigma)，室溫孵育lh，DAPI染色10min，PBS洗片后，熒光顯微鏡下觀察，經(jīng)抗0RFV086單 克隆抗體2G8D10染色的細(xì)胞均觀察到紅色熒光，如圖3所示。結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞CCTCC NO :C201471制備的抗0RFV086單克隆抗體2G8D10可識(shí)別天然的0RFV086蛋白。
[0059] 6)抗體的免疫組化鑒定：收集患羊病變組織，利用純化后的雜交瘤細(xì)胞CCTCC N0 : C201471制備的抗0RFV086單克隆抗體2G8D10 (1:1000稀釋）進(jìn)行免疫組化染色，使用福 建邁新公司的免疫組化試劑盒，染色方法參照邁新試劑盒說明書，DAB顯色，陰性對(duì)照組以 PBS代替一抗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)經(jīng)抗0RFV086單克隆抗體2G8D10染色的組織標(biāo)本上在細(xì)胞質(zhì)中均 發(fā)現(xiàn)顆粒，如圖4所示，用ORFV-Jilin病毒（(M0I2. 5)分別感染培養(yǎng)在蓋玻片上的OFTu細(xì) 胞0, 3, 5, 8, 10, 12和24小時(shí)（post-infection (p. i.)，并在不同時(shí)間點(diǎn)用4%的多聚甲醒 固定，隨后用〇. 25% Triton X-100室溫孵育10分鐘，再用含有1% BSA的PBS固定之后， 用單克隆抗體2G8D10室溫孵育一個(gè)小時(shí)，洗掉多余的沒有結(jié)合的抗體之后用抗小鼠的IgG Alexa Fluor488 (Green)室溫孵育一個(gè)小時(shí)，最后用 4'，6'-diamidino_2-phenylindole (D API)孵育10分鐘。從B部分我們可以看出，病毒感染8小時(shí)后基因開始表達(dá)，24小時(shí)后蛋 白開始表達(dá)。病變組織的免疫組化染色結(jié)果證明雜交瘤細(xì)胞CCTCC NO :C201471制備的抗 0RFV086單克隆抗體2G8D10可識(shí)別天然的0RFV086蛋白。
[0060] 最后所應(yīng)當(dāng)說明的是，以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非對(duì)本發(fā)明保 護(hù)范圍的限制，盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作了詳細(xì)說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的實(shí)質(zhì) 和范圍。
[0001] 序列表 <110〉廣州洪祥生物醫(yī)藥科技有限公司 <120〉一種羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2G8D10及其單克隆抗體 <160> <210> 1 <211> 905 <212> PRT <213〉U!瘡病毒 <400> 1 MTAPNVHMALHHVEGAEYMFQLVSTVLPTLCSDFKPSYDVNRTY VHPLDALFLEDAEKLASDEETEVAVKQFGINFLLDSAANSHLIPVLLGPNFAELKPAN LKLTDTANPVICTQSFKDVPPFTRNLLKTRVTSFEAHARICGGYVRYPTGLPAKSPIS FPSLSFDNTYLLNLIYPNIAGPAEIGFRARLVDGTMLARDLLMLLNVRALLTDASRAR MDAMYDTPDAAAKHGTVIJQTPQVDTRU'TMPI.KYUTFFQYFDSVFSI.RQI-TFNGQN LRMARGSVASLAVSIFYQSQLARLAQLnPSVTLMDSLEVLTTSGATLRVASPGMQFVD VSANIRYYVTLLSMLMRADRTSPLIAPGKSLFWDGIAYAEFKSMSTADSLFMSSVCYT FALFDHDNVTyCSLLSDALAAGKEPLRVCFYPRVMGQKTVGALYMETLSGINAMTPRE FPRRSTQPNHHIGLSQRAFMQFFQMLRLVCNSDPETAMKEVLMAYAGLRMEDKGAPHY INKESYLDFVKLLFGAMVYRVSVSAYTLGSRRHTAVTVSPSVSKTNIARSLGKVCCSK EEVEKIE4SAHDLLQFMVTATNVRDAQGYRGPSAQCRFPSFSFPASWRFPRIIYGGAK DMETADQSVVLCSQDMGMLDRINVRGIFSASTVDELMSVDGFMPENTAFKRNLQSMI DEGCLSSEGILMSMPCNLLDRLVTVGGSPDITISGLLDEVSGSSDDSSVSSNEIADAI NMLKTRYVRDTSNVVNSTLSIASARSEKQLDAVKRATCCISALFKQLTQSVYTTERI FGVPIADEVK.NSILERYNLFVQLSKSLYMDMIALENLKALLLIVRRSGRYVGDAEIGV AEMQKAYELVREKISRLTAYYSSIGEMYWNNMKRNLNLRSDGAVSFDSE
[0002] <210〉 2 <211〉 2718 <212> DNA <213〉口瘡病毒 <400> 2 ATGACGGCCCCAAACGTGCACATGGCCTTGCACCATGTGGAGGGCGCGGAATACATGTTCCAGCTCGTT TCCACCGTGCTCCCCACGCTGTGTTCGGACTTTAAGCCCAGCTACGACGTCAACCGAACGTACGTGCAC CCGCTGGACGCGCTCTTCCTCGAGGACGCGGAGAAGCTCGCCAGCGACGAGGAAACCGAGGTCGCCGTG AAGCAGTTCGGCATCAACTTCCTGCTCGACAGCGCCGCCAACTCGCACCTCATCCCCGTGCTGCTGGGC CCCAACTTCGCGGAGCTCMGCCCGCCAACCTCAAGCTGACCGACACCGCCAACCCCGTGATCTGCACG CAGTCCTTCAAGGACGTGCCTCCCTTCACCCGCAACCTGCTGAAGACTCGCGTGACCAGCTTTGAGGCG CACGCGCGCATCTGCGGCGGCTACGTGCGCTACCCCACCGGCCTCCCGGCGAAGTCGCCCATCTCCTTC CCCTCACTGAGCTTCGACAACACGTACCTGCTGAACCTGATCTACCCCAACATCGCCGGCCCCGCCGAG ATCGGCTTTCGCGCCCGGCTGGTCGACGGGACCATGCTCGCGCGGGACCTGCTCATGCTGCTCAACGTG CGCGCGCTGCTCACCGACGCCTCCCGCGCCAGAATGGACGCCATGTACGACATCCCCGACGCCGCGGCC AAGCACGGAATCGTTCTCACACAGACGCCGCAGGTGGATACCGAGCTGACGACCATGCCGCTCAAGTAC CTGCTCACCTTCTTCCAGTACTTTGACTCCGTGTTCTCGCTGCGCCAGCTCACCTTCAACGGGCAAAAC CTGCGCATGGCGCGCGGCAGCGTGGCCAGCCTCGCCGTGTCCATCTTCTACCAGAGCCAGCTGGCGCGC CTTGCGCAGCTGCACCCCAGCGTGACGCTCATGGACAGCCTGGAGGTGCTCACTACCTCGGGCGCGACC CTGCGCGTGGCTTCGCCCGGCATGCAGTTCGTAGACGTTTCCGCCAACATCCGTTACTACGTGACGCTG CTCTCCATGCTGATGCGCGCCGACCGCACGTCCCCGCTGATCGCGCCCGGAAAGAGCCTGTTCTGGGAC GGAATCGCGTACGCGGAGTTCAAGTCCATGAGCACCGCCGACTCGCTCTTCATGAGCTCCGTCTGCTAC ACCTTCGCGCTCTTCGACCACGACAACGTCACGTACTGCTCGCTGCTTTCGGACGCGCTCGCGGCCGGC AAGGAGCCCCTCCGCGTGTGCTTTTACCCGCGCGTCATGGGCCAGAAGACCGTGGGCGCGCTCGTGATG (lAGACGCTCTCGGGAATCAACrXCATGACGCCCAGdGAGTTCCCGCGCCGCTCGACACAGCCCAACCAC CACATCGGGCTCTCGCAGCGCGCCTTCATGCAGTTTTTCCAGATGCTGCGGCTGGTGTGCAACTCGGAC CCCGAGACGGCGATGAAGGAAGTGCTCATGGCCTACGCCGGGCTGAGGATGGAAGACAAGGGCGCGCCG CACTACATCAATAAGGAGAGCTACCTGGACTTCGTGAAGCTGCTCTTCGGCGCCATGGTGTACCGCGTT AGCGTGAGCGCGTACACGCTCGGCAGCCGCCGGCACACCGCCGTCACAGTCTCGCCCTCGGTAAGCAAA ACGAACATCGCGCGCAGCCTGGGCAAGGTCTGCTGCAGCAAGGAGGAGGTGGAGAAGATCATGGCGTCC GCGCACGACCTGCTGCAGTTCATGGTCACGGCCACCAACGTGCGCGACGCGCAGGGCTACCGAGGCCCG AGCGCGCAGTGCCGGTTTCCCTCCTTCTCCTTTCCGGCGAGCTGGCGGTTTCCGCGCATCATCTACGGC GGCGCCAAGGACGCCGCCGAGACGGCCGACCAGTCGGTGGTGCTGTGCTCGCAGGACATGGGCATGCTG GACCGCATCAACGTGAGGGGCATCTTTTCCGCGAGCACGGTCGACGAGCTCATGAGCGTGGACGGGTTC ATGCCCGAAAACACGGCCTTCAAGCGCAACCTGCAGAGCATGATCGACGAGGGCTGCCTCTCGAGCGAG GGCATCCTCATGTCCATGCCCTGCAACCTGCTCGACCGTCTGGTGACCGTCGGCGGCTCGCCCGATATC ACGATCTCGGGGCTCCTGGACGAAGTCTCGGGCAGCTCGGACGACTCGAGCGTGAGCAGCAACGAGATC GCGGATGCCATCAACGCCGCGCTGAAGACGCGCTACGTGCGCGACACGAGCAACGTCGTGAACAGCACG CTGAGCATCGCGAGCGCGCGCTCCGAGAAGCAGCTCGACGCCGTCAAGCGCGCGACCTGCTGCATCTCC GCGCTCTTCAAGCAGCTCACGCAGTCCGTGTACACCACGGAGCGCATCTTCGGAGTCCCAATCGCGGAC GAGGTGAAGAACAGCATCCTGGAGCGGTACAACCTCTTCGTGCAGCTCTCGAAGTCGCTGTACATGGAC ATGATCGCGCTGGAGAACCTGAAGGCGCTGCTGCTGATCGTGCGCCGCAGCGGCCGGTACGTGGGCGAC GCGGAGATCGGCGTTGCGGAGATGCAGAAGGCCTACGAGCTGGTGCGAGAAAAAATATCGCGGCTGACG
[0003] GCGTACTACTCGAGCATCGGCGAGATGTACTGGAACAACATGAAGCGCAACCTCAACCTCCGGTCGGAT GGCGCCGTTTCTTTTGACAGTGAGTM <210> 3 <211> 29 <212> DNA <213〉人工序列 <400> 3 TAGGATCCGATGACGGCCCCAAACGTGCA <210〉 4 <211>30 <212〉 DNA <213〉人工序列 <400> 4 GCAAGCTTCTCACTGTCAAAAGAAAACGGC
【權(quán)利要求】
1. 一種羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞株2G8D10,其保藏編號(hào)為 CCTCCNO :C201471。
2. -種羊口瘡病毒蛋白0RFV086單克隆抗體，其特征在在于：該單克隆抗體由保藏編 號(hào)為CCTCC NO :C201471的雜交瘤細(xì)胞株2G8D10分泌產(chǎn)生。
【文檔編號(hào)】C12R1/91GK104046594SQ201410268347
【公開日】2014年9月17日 申請(qǐng)日期:2014年6月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年6月16日
【發(fā)明者】成敏, 王勇 申請(qǐng)人:廣州洪祥生物醫(yī)藥科技有限公司