一種耐油具柄菌及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種耐油具柄菌，即一種能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感應淬滅菌株，該耐油具柄菌(Muricauda?olearia)LMM001菌株保藏號為CGMCC?No.8972。本發(fā)明還提供供從LMM001菌株中分離的AHL降解酶MomL蛋白，其氨基酸序列為SEQ?ID?NO：1。本發(fā)明的耐油具柄菌LMM001菌株，可通過小分子QS阻抑物、AHL內酯酶MomL和AHL?；D移酶等多種方式阻斷致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMM001對斑馬魚沒有毒副作用；菌株LMM001能提高斑馬魚對嗜水氣單胞菌侵染的抵抗力；AHL內酯酶能大大降低銅綠假單胞菌胞外蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色桿菌紫色桿菌素的合成。
【專利說明】一種耐油具柄菌及其應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于有益菌篩選【技術領域】，具體涉及一種耐油具柄菌及其應用。
【背景技術】
[0002]目前，抗生素是公認的治療細菌性疾病的有效方法，傳統(tǒng)的抗生素主要通過抑制細胞壁的合成、DNA的復制、RNA的轉錄以及蛋白質的合成等一些微生物所必需物質的合成或代謝途徑，殺死細菌或抑制細菌的繁殖，從而實現(xiàn)對細菌性疾病的治療目的。這種“生”或“死“的選擇性壓力，使隨機突變產生的抗生素抗性基因得以保留，從而導致抗生素抗性突變的細菌迅速成為微生物群落中的優(yōu)勢種群，進而導致細菌抗藥性的產生。而抗生素的濫用進一步加快了細菌抗藥性的出現(xiàn)。與此同時新型抗生素的研發(fā)速度已經大大降低，往往新型抗生素推廣到市場后的幾年內就會有相應的抗性細菌出現(xiàn)。這樣的現(xiàn)狀促使人們開發(fā)一種不同于傳統(tǒng)抗生素作用機制的新型細菌性疾病治療手段。其中一種具開發(fā)前景的方法被稱為抗毒力治療(antivirulence therapy),該方法是以細菌的毒力因子本身(毒力因子的表達、功能及運輸以及細菌的粘附作用等)為靶位，而不是上述微生物所必需的物質合成或代謝途徑，因此從理論上來說能夠大大降低其使用過程中對細菌產生的選擇性壓力從而有效降低產生細菌抗藥性的幾率。
[0003]密度感應(quorum sensing, QS)在1994被首次提出，用來描述夏威夷魷魚發(fā)光器官中的費氏弧菌(Vibrio fischeri)通過分泌和識別化學信號分子(autoinducers, AIs)來檢測種群密度，從而在群體水平上協(xié)調其熒光素酶基因(luxABCDE)表達的現(xiàn)象。目前已經報道的信號分 子主要有革蘭氏陰性菌的N-?；呓z氨酸內酯分子(N-acylhomoserine lactone, AHL)、革蘭氏陽性菌的寡妝分子(autoinducing peptide, AIP)以及在革蘭氏陰性和陽性菌中普遍存在的A1-2分子。研究發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、胡蘿卜軟腐歐文氏菌(Erwinia carotovora)、弧菌屬(Vibrio)和伯克氏菌屬(Burkholderia)等多種致病菌中致病因子的分泌和AHL類QS密切相關。另外，生物被膜(biofilm)在致病菌的宿主防御機制以及抗生素的抗藥性中起關鍵作用，它的形成也受QS的調控作用。由于QS系統(tǒng)不是微生物生存所必需的，因此淬滅密度感應(quorumquenching, QQ)可以在不殺死細菌的情況下大大地降低其毒力的表達，同時大大降低環(huán)境中的選擇壓力以及出現(xiàn)細菌抗藥性的幾率，因此密度感應淬滅技術是極具開發(fā)前景的一種抗毒力治療手段。
[0004]目前發(fā)現(xiàn)的AHL類的QS系統(tǒng)的密度感應淬滅活性物質主要有信號分子降解酶和QS阻抑小分子物質。小分子阻抑物主要有呋喃酮、肉桂醛及其衍生物和信號分子類似物。動物模型侵染實驗表明呋喃酮和肉桂醛等小分子阻抑物能夠大大降低哈維氏弧菌和銅綠假單胞菌等致病菌的致病性。目前在很多種細菌中發(fā)現(xiàn)了信號分子降解酶，根據降解機制的不同可分為三類=AHL內酯酶(內酯環(huán)水解作用)，AHL?；D移酶(氨基水解作用)以及AHL氧化還原酶(氧化還原作用)。AHL降解酶尤其是AHL內酯酶對不同長度?；湹男盘柗肿?C4-C12)均具有高效的降解活性。動物實驗表明，在畢赤酵母表達系統(tǒng)中過量表達的AHL內酯酶(AiiA)和嗜水氣單胞菌混合注射鯉魚能大大降低鯉魚的致死率。AHL降解菌株的富集培養(yǎng)液能提高鹵蟲和大菱鲆的成活率以及增強羅氏沼蝦對哈維氏弧菌的抵抗力。因此在防治海水養(yǎng)殖病害方面，密度感應淬滅菌株具有很廣闊的發(fā)展前景。
[0005]目前發(fā)現(xiàn)的密度感應淬滅菌大多是來源于陸地，而已發(fā)現(xiàn)的25個種海洋細菌中只有邊山假交替單胞菌(Pseudoalteromonas byunsanensis) 1A01261的QQ酶獲得了鑒定。陸地來源的菌株可能會因為不適應海水環(huán)境而不宜作為海水養(yǎng)殖的有益菌，因此從海洋或水產養(yǎng)殖動物環(huán)境中分離的土著QQ菌株，對密度感應淬滅技術在水產養(yǎng)殖上的應用尤為重要。不僅如此，許多哺乳動物及人類致病菌的毒力也受到QS調控，因此新型高活性的QQ酶具有廣闊的藥物開發(fā)前景。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種耐油具柄菌及其應用，即一種能抑制致病菌毒力因子分泌的密度感應淬滅菌株，從而彌補現(xiàn)有技術的不足。
[0007]本發(fā)明的耐油具柄菌(Muricauda olearia)LMMOOl菌株，已于2014年3月28日保藏在位于北京朝陽區(qū)北辰西路I號院3號中國科學院微生物研究所的中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏號為CGMCC N0.8972。
[0008]耐油具柄菌LMMOOl的培養(yǎng)溫度為范圍是15_40°C，最佳培養(yǎng)溫度為25_30°C;生長pH值范圍為5.2-9.4，最 適生長pH為6.8-7.7。
[0009]本發(fā)明的菌株可用于制成用于淬滅水產養(yǎng)殖病原菌的密度感應系統(tǒng)，降低其毒力因子的分泌的菌制劑。
[0010]上述菌制劑中包含有耐油具柄菌LMMOOl菌株的活菌。
[0011 ] 上述的菌制劑為飼料添加劑或養(yǎng)殖水體添加劑。
[0012]本發(fā)明還提供從LMM001菌株中分離的AHL降解酶MomL蛋白，其中MomL降解酶包括有:
[0013]I)氨基酸序列為SEQ ID NO:1的MomL蛋白；
[0014]2)將I)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有I)中蛋白的AHL降解活性的，由I)所衍生的蛋白。
[0015]本發(fā)明還提供用于編碼MomL蛋白的核苷酸；其中編碼MomL的一種核苷酸序列為SEQ ID NO:2o
[0016]所述的AHL降解酶MomL蛋白用作水產飼料添加劑或水產養(yǎng)殖水體添加劑。
[0017]本發(fā)明的耐油具柄菌LMMOOl菌株，可通過小分子QS阻抑物、AHL內酯酶MomL和AHL?；D移酶等多種方式阻斷致病菌的QS通路，降低致病菌毒力因子的分泌；菌株LMMOOl對斑馬魚沒有毒副作用；菌株LMMOOl能提高斑馬魚對嗜水氣單胞菌侵染的抵抗力；AHL內酯酶能大大降低銅綠假單胞菌胞外蛋白酶和綠膿菌素等毒力因子的分泌，能降低紫色色桿菌紫色桿菌素的合成。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1:MomL的C6-HSL降解活性圖?！揪唧w實施方式】
[0019]下面結合實施例對本發(fā)明的菌株進行詳細的描述。
[0020] 一、耐油具柄菌LMM001菌株的分離
[0021]2011年3月份將取自養(yǎng)殖場的健康牙鲆的體表粘液涂布海洋細菌培養(yǎng)基2216E平板上，28°C培養(yǎng)2d之后發(fā)現(xiàn)黃色菌落細菌，挑取單菌落進行繼代培養(yǎng)，直至得到純化的菌株，并通過對AHL降解活性效率的篩選得到目的菌株，命名為LMM001。
[0022]通過16s rRNA基因比對分析確定本發(fā)明菌株LMM001為耐油具柄菌(Muricaudaolearia)。
[0023]二、耐油具柄菌LMM001菌株的AHL降解活性的檢測
[0024]先接種LMM001于海水2216E培養(yǎng)基中，于搖床170rpm、28°C培養(yǎng)24h。在培養(yǎng)獲得的菌液中加入不同碳鏈長度的AHL分子(C6-C14-HSL)后在28°C反應24h。離心取上清用AHL報告菌報告菌根癌農桿菌A136 (pCF218) (pCF372)、紫色色桿菌CV026和VIR24檢測剩余的AHL分子，發(fā)現(xiàn)菌株LMM001能在Ih內將加入的終濃度為10 μ M的所有碳鏈長度的AHL分子降解。
[0025]三、耐油具柄菌LMM001對斑馬魚的保護作用
[0026]將菌株LMM001按注射量3.60 X IO7Cfu/尾腹腔注射斑馬魚，每個實驗組設置三個平行，每個平行實驗組10尾斑馬魚，20天后沒有發(fā)現(xiàn)斑馬魚死亡，說明其對斑馬魚無毒副作用。另外設置三個平行實驗組，每個平行實驗組10尾，在水體中加入菌株LMM001至終濃度約為IXlO6Cfu πιl-1，每天按換水量補加菌株Th20的菌懸液，一個星期后，加入嗜水氣單胞菌AHKl至終濃度為I X IO7Cfu πιL-1，每天按換水量補加菌株LMM001菌懸液和AHKl菌懸液，對照組不加LMM001菌懸液，觀察記錄斑馬魚的死亡情況。發(fā)現(xiàn)對照組在嗜水氣單胞菌的侵染下只有大約20%的成活率，而加入菌株LMM001的實驗組的斑馬魚成活率為60%，說明菌株LMM001能提高斑馬魚抗嗜水氣單胞菌侵染的能力。
[0027]三、本發(fā)明AHL降解酶MomL的鑒定
[0028]采用Illumina高通量測序技術對LMM001的全基因組進行了測序及分析,經RAST服務器進行基因注釋后也測到可能具有AHL降解活性的蛋白。采用大腸桿菌表達系統(tǒng)構建BL21 (DE3) -pTWINl-MomL表達菌株，發(fā)現(xiàn)重組MomL蛋白能降解C4-C14-HSL分子，這說明這MomL是AHL降解酶。用AHL報告菌CV026檢測MomL的C6-HSL降解活性(見圖1)，0.078U的MomL能形成明顯的抑制圈(報告菌CV026檢測到C6-HSL時顯紫色)。
[0029]四、MomL的AHL降解機制
[0030]AHL內酯酶的作用機制是水解AHL分子的內酯環(huán)，開環(huán)的AHL在酸性條件下(pH2)能夠重新閉環(huán)恢復AHL分子活性，而AHL酰基轉移酶的對AHL的降解機制不同，因此可以用酸化實驗初步檢測AHL降解活性是否為內酯酶活性。
[0031]AHL內酯酶活性的初步檢測采用酸化法:向表達出來的MomL中加入終濃度為10 μ M的C6-HSL，28V反應24h后，反應液經4°C，13000g離心10min收集上清液，收集的上清沸水浴處理5min，加入適量的過濾除菌的鹽酸1M)至pH2左右，于28°C孵育24h，用AHL報告菌CV026和VIR24檢測AHL恢復情況。
[0032]酸化試驗發(fā)現(xiàn)被MomL降解的C6-HSL能獲得恢復，說明MomL是AHL內酯酶。為了進一步驗證MomL對AHL的降解機制，利用HPLC-MS檢測確定其對C6-HSL以及C12-HSL的降解產物。MomL的C6-HSL降解產物分子量主要是為218。C6-HSL的分子式為CltlH17NO3，理論分子量為199.25，被AHL內酯酶水解后的產物是C6-HS，分子式為CltlH19NO4，理論分子量為217.25，這與結果中分子量為218的化合物相近，因此MomL降解C6-HSL的產物是C6-HS，因此MomL是AHL內酯酶。
[0033]五、MomL的酶學性質
[0034]AHL分子被內酯酶水解后會產生一個質子(H+，水解后的羧基電解產生)，而累計產生的質子可使PH發(fā)生變化，當在具有弱緩沖能力的反應體系中加入pH指示劑時就可以通過檢測吸光度的變化來反應AHL內酯酶活性，該方法叫做pH指示的連續(xù)分光光度分析法。該方法關鍵在于選擇合適的pH指示劑和緩沖溶液組成一個緩沖體系，其中pH指示劑的PKa值與緩沖液的pKa值越接近越好。目前對AHL內酯酶的酶學動力學參數(shù)主要采用苯酚紅和HEPES系統(tǒng)(pKa ^ 7.9)或甲酚紫和N，N- 二羥乙基甘氨酸系統(tǒng)(pKa ^ 8.4)，但是由于系統(tǒng)自身的PKa值設定過高，可能會促進AHL的化學水解。本論文采用溴麝香草酚藍(Bromothymol Blue,簡稱 BTB, pKa = 7.1)和 M0PS(pKa = 7.2)系統(tǒng)，兩者的 pKa 相差不大并且接近中性，該系統(tǒng)已經被廣泛地用于其他水解酶的酶學動力學參數(shù)的檢測。
[0035]具體方法為:配制2XM0PS儲存液(5mM，pH7.1) ;10XBTB儲存液(ImM)。在100 μ I的反應體系中加入50 μ I MOPS儲存液，10 μ I BTB儲存液，加入0.156_5mM的AHL，DMS0的終濃度為1%，加入適量的待測重組MomL，加入三蒸水至100 μ 1，溫度25°C，酶標儀630nm處連續(xù)檢測50次(每30s檢測一次)。計算每個濃度AHL的反應初速度，按照標準曲線換算。每個實驗組設置三個平行。
[0036]利用上述方法檢測MomL的酶學性質，發(fā)現(xiàn):
[0037]1、重組 MomL 對信號分子 C4_、C6_、30C6、C8、30C8 和 30C10 的 kd/Kjs^T1)值分別為 1.6Χ105、2.9Χ105、3.I X ΙΟ5』.6X ΙΟ5、..5X IO5 和 5.1XlO50
[0038]2、MomL的最適反應溫度為40°C。
[0039]3、MomL的溫度穩(wěn)定性:60度處理30min后保持32%的C6-HSL降解活性。
[0040]4、最適反應pH為8。
[0041]5、不同金屬離子MomL活性的影響:金屬離子Cu2+，F(xiàn)e2+能抑制MomL的活性，而Mg2+和Co2+能夠促進MomL的活性。MomL對Mg2+的親和性很高，對Co2+的親和性非常低，但是MomL結合上Zn2+或Mg2+后對其活性僅有部分提高，而推測Be2+能促進MomL的活性的重要性可能更大。
[0042]6、重組MomL對致病菌毒力因子分泌的影響
[0043]重組MomL的酶活IU表示在Imin內降解I μ mo I的C6-HSL所需的酶量。
[0044](I)檢測不同濃度的重組蛋白(5，0.5，0.05U πι-1)對銅綠假單胞菌PAOl胞外蛋白酶的活性的影響。蛋白酶活性的測定參照Hentzer的方法。各個樣品于28°C靜置培養(yǎng)24h后，0D590測細菌生長情況。13000g4°C離心10min，取上清各100 μ I與底物偶氮酪蛋白(5mg ι?-1，溶于50mM的Tris-HCl中，pH為8.0)混合后37°C孵育2h。加入200 μ I濃度為10%的三氯乙酸溶液終止反應，靜置l-2min后13000g離心5min，取出上清100 μ I并加入100 μ I濃度為525mM的氫氧化鈉溶液。混勻后取出200 μ I置于96孔板中，測量0D415，按公式0D415/(0D590*100y I)計算各樣品的蛋白酶活性。各組陰性對照為不加入重組MomL的各菌株的胞外蛋白酶活性。按各組陰性對照組的活性為100%計算相對胞外蛋白酶活性。每個實驗組設置三個平行。發(fā)現(xiàn)加入三種濃度的重組MomL蛋白能使銅綠假單胞菌的胞外蛋白酶下降36% -57%。
[0045](2)檢測不同濃度的重組MomL對紫色色桿菌的紫色桿菌素合成的影響。具體方法參照Blosser的方法。各樣品于28°C靜置培養(yǎng)24h后，0D660測量細菌生長情況。取出200 μ I的培養(yǎng)液，加入200 μ I的10%的SDSdi^m 5s，靜置5min，加入500 μ I的正丁醇，渦旋5s萃取紫色桿菌素，13000離心2min。取上層正丁醇溶液，測量0D590，以公式0D590/(0D660*200ul)計算各樣品的紫色桿菌素的量。陰性對照為不加入重組MomL的所表達紫色桿菌素的量。以陰性對照組為100%計算各組相對紫色桿菌素的量。每個實驗組設置三個平行。發(fā)現(xiàn)入5U πι 1的MomL能使紫色色桿菌的紫色桿菌素降低85%。
[0046](3)檢測不同濃度的重組MomL對銅綠假單胞菌PAOl的綠膿菌素的合成抑制效果。具體方法參照Essar的方法。用PB (Pseudoomonas Broth)培養(yǎng)基培養(yǎng)菌株PAOl (20g蛋白胨，1.4g MgCl2, IOg K2S04, IOml甘油，IL的蒸餾水)。各實驗組培養(yǎng)基總體積為5ml，加入不同濃度的MomL，搖床170rpm，28°C培養(yǎng)24h后，取出Iml的培養(yǎng)液加入800 μ I氯仿進行萃取，13000g離心2min后,從下層氯仿層取出500 μ I加入1.5ml的200mM的鹽酸混勻，離心取出上層溶液稀釋2倍，測0D520。以陰性對照為100%計算相對綠膿菌素的產量。每個實驗組設置三個平行。發(fā)現(xiàn)加入5、0.5和0.05U ml—1的MomL能使銅綠假單胞菌的綠膿菌素分別下降88%、72%和62%左右。
[0047]上述結果說明MomL能有效降低部分致病菌毒力因子的分泌。
[0048]六、MomL是 一種新型的海洋AHL內酯酶
[0049]M om L具有 信號肽序列，是目前金屬-β -內酰胺酶家族中唯--個分泌到胞外的
AHL內酯酶。在已鑒定的AHL內酯酶中，MomL與AiiA的氨基酸序列相似度最高(一致性為28.85% )，而對 C6-HSL 的降解效率是 AiiA(BaciIIus sp.240B1)的 10 倍左右。AiiA 蛋白結合的金屬離子為Zn2+,這與MomL不同。從上述結果可知MomL —種新型的海洋AHL內酯酶，其高效的AHL降解活性表明其具有進一步應用開發(fā)的價值。
【權利要求】
1.一種耐油具柄菌，其特征在于，所述的耐油具柄菌的保藏編號為CGMCCN0.8972。
2.如權利要求1所述的耐油具柄菌，其特征在于所述的耐油具柄菌的培養(yǎng)溫度為范圍是15-40°C，最佳培養(yǎng)溫度為25-30°C ;生長pH值范圍為5.2 - 9.4，最適生長pH為6.8-7.7。
3.權利要求1所述的耐油具柄菌在制備用于淬滅水產養(yǎng)殖病原菌的菌制劑中的應用。
4.一種菌制劑，其特征在于，所述的菌制劑中包含有權利要求1所述的耐油具柄菌的活菌。
5.如權利要求4所述的菌制劑，其特征在于，所述的菌制劑為飼料添加劑或養(yǎng)殖水體添加劑。
6.一種MomL蛋白，其特征在于，所述的蛋白包括有: 1)氨基酸序列為SEQID NO:1的蛋白； 2)將I)中的氨基酸序列經過取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸，且具有I)中蛋白活性的，由I)所衍生的蛋白。
7.一種核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸編碼權利要求6所述的MomL蛋白。
8.如權利要求7所述的核苷酸，其特征在于，所述的核苷酸序列為SEQID N0:2。
9.權利要求6所述的MomL蛋白在制備水產飼料添加劑或水產養(yǎng)殖水體添加劑中的應用。
【文檔編號】C12R1/01GK103981140SQ201410252837
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年6月9日 優(yōu)先權日:2014年6月9日
【發(fā)明者】張曉華, 湯開浩, 史曉翀, 蘇穎, 張?zhí)N慧 申請人:中國海洋大學