一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應(yīng)用方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應(yīng)用方法。該耐高溫蛋白酶在20～80℃的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性；所述耐高溫蛋白酶是由畢赤酵母發(fā)酵產(chǎn)出。用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵，分類命名為巴斯德畢赤酵母MMpk-GS115。菌株選育方法包括：準備白色側(cè)齒霉菌、畢赤酵母表達載體構(gòu)建等步驟。耐高溫蛋白酶在酶解中的應(yīng)用方法是先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解。本發(fā)明的優(yōu)點是：該耐高溫蛋白酶菌株能夠產(chǎn)胞外蛋白酶，具有產(chǎn)酶活性高、發(fā)酵時間短，蛋白酶切割位點具有廣泛特異性；在大米粕、豆粕、白酒糟、構(gòu)樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物的酶解后，小肽含量達到10～50%，能改善植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物品質(zhì)，提高營養(yǎng)價值，更易于動物消化吸收。
【專利說明】一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應(yīng)用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應(yīng)用方法，具體是一種畢赤酵母所產(chǎn)的耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在植物蛋白及酵母培養(yǎng)物酶解中的應(yīng)用方法，特別適用于飼料及保健食品行業(yè)，屬于發(fā)酵工程【技術(shù)領(lǐng)域】。
【背景技術(shù)】
[0002]工業(yè)用酶制劑中75%是蛋白水解酶，而蛋白酶是工業(yè)用酶中占據(jù)比例最大的酶類，大約占全世界每年總銷售量的60%左右。蛋白酶在飼料、洗滌劑、食品、醫(yī)藥和皮革制造等行業(yè)中有著廣泛的用途。蛋白酶菌株的選育方法有物理、化學(xué)因子單獨或復(fù)合誘變、原生質(zhì)體技術(shù)、基因工程技術(shù)等。現(xiàn)有技術(shù)存在的缺點是:利用基因工程技術(shù)構(gòu)建產(chǎn)蛋白酶工程菌的過程中容易發(fā)生基因突變，而且基因工程菌可能無法正確翻譯外源蛋白酶基因等。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0003]本發(fā)明的一個目的是:提供一種耐高溫蛋白酶，該高溫蛋白酶是由畢赤酵母所產(chǎn)生，能聞效酶解大米柏、?柏、白酒糟、構(gòu)樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物，改善其品質(zhì)，提聞營養(yǎng)價值，改善溶解性、起泡性等功能特性，從而提高了動物對植物蛋白及酵母培養(yǎng)物飼料的利用效率。該耐高溫蛋白酶切割位點廣泛，應(yīng)用范圍甚廣，可應(yīng)用于大多數(shù)植物蛋白。
[0004]本發(fā)明的另一個目的是:提供耐高溫蛋白酶菌株的選育方法，該方法能夠利用甲醇作為唯一碳源高效表 達耐高溫蛋白酶并分泌到胞外，且分泌很少的自身蛋白，還可以對外源蛋白進行翻譯后修飾。
[0005]本發(fā)明的還有一個目的是:提供耐高溫蛋白酶在植物蛋白及酵母培養(yǎng)物酶解中的應(yīng)用方法，具體是對大米柏、豆柏、白酒糟、構(gòu)樹葉等植物蛋白及酵母培養(yǎng)物進行酶解的方法，獲得含有大量小肽或氨基酸的產(chǎn)品，改善植物蛋白品質(zhì)，提高營養(yǎng)價值及動物吸收利用率。培養(yǎng)物水解效率高，反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)生毒性物質(zhì)的可能性小，同時隨著酶反應(yīng)的進行，蛋白質(zhì)的相對分子質(zhì)量逐漸變小，并轉(zhuǎn)化為肽或者氨基酸，更易于消化吸收。
[0006]本發(fā)明一種耐高溫蛋白酶的技術(shù)方案是:該耐高溫蛋白酶在20~80°C的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65°C條件下，活性可保持3 h不變，在40~50°C的條件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，當pH7~9時24h內(nèi)酶活性保存率為100% ;所述耐高溫蛋白酶菌株由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。
[0007]—種用于發(fā)酵產(chǎn)出本發(fā)明所述耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其分類命名為巴斯德畢赤酵母 MMpk_GS115 iPichia pas tor is MMpk~GS115 )，保藏中心保藏編號為:CCTCC NO: M2014171，保藏日期為:2014年4月28日，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)；所述巴斯德畢赤酵母遍形態(tài)及生理生化特征包括:呈乳白色，菌體鏡檢呈橢圓形或園形，為甲醇營養(yǎng)型菌。
[0008]所述一種用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，通過甲醇補料發(fā)酵后，發(fā)酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于 5000U/mg。
[0009]一種耐高溫蛋白酶菌株選育方法，包括下述步驟:
A、準備白色側(cè)齒霉菌用作耐高溫蛋白酶基因序列來源；
B、利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得目的基因序列沙左，即采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來；
C、將目的基因插入表達載體:插入構(gòu)建的常規(guī)的畢赤酵母表達載體p9kNTS、p9kMFII:
D、將上述表達載體的重組和線性化；
E、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl15:經(jīng)重組和線性化后，電轉(zhuǎn)化；
F、初篩、復(fù)篩，最后獲得一株耐聞溫蛋白酶菌株。
[0010]所述的D步驟初篩、復(fù)篩是:搖瓶酶活測定篩選，以篩選到的酶活相對很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作為宿主菌，將重組質(zhì)粒p9kNTS_Fpk、p9kMF I1-Fpk線性化后進行二次電轉(zhuǎn)化，再進行較高濃度的G418梯度高拷貝篩選，酶活測定篩選，獲得一株耐高溫蛋白酶的菌株。
[0011]本發(fā)明一種耐高溫蛋白酶在酶解中的應(yīng)用方法，先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解，該酶解的步驟包括:
首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，干酶解基料與水的比為1:1~9，調(diào)整PH6~9，然后在溫度為55~65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為300~5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3~36 h，最后得到液態(tài)的酶解的蛋白質(zhì)，或經(jīng)干燥得到干的酶解的蛋白質(zhì)；
所述的酶解基料為發(fā)酵植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物；所述發(fā)酵植物蛋白包括大米柏、豆柏、白酒糟、構(gòu)樹葉。
[0012]一種本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解大米柏中的應(yīng)用方法，其酶解基料為大米柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1: 9，調(diào)整pH8，在60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。
[0013]一種本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解豆柏中的應(yīng)用方法，其酶解基料為豆柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整PH9，然后在溫度為65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為16h。
[0014]一種本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解白酒糟中的應(yīng)用方法，其酶解基料為白酒糟，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:5，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為12h。
[0015]一種本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解構(gòu)樹葉中的應(yīng)用方法，其酶解基料為構(gòu)樹葉，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整pH為自然狀態(tài)，然后在溫度為60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。[0016]一種本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解酵母培養(yǎng)物中的應(yīng)用方法，其酶解基料為酵母培養(yǎng)物，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:7，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為36h。
[0017]本發(fā)明具有以下優(yōu)點:
I)本發(fā)明構(gòu)建的菌株發(fā)酵產(chǎn)生耐高溫蛋白酶的粗酶活力可高達50000 U/ml。
[0018]2)所產(chǎn)耐高溫蛋白酶切割位點廣泛、耐熱性和耐堿性，在20~80°C，pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，在親水性有機溶劑如二甲基甲酰胺、二甲基亞砜、丙酮和乙醇中仍有較高的活性。耐高溫蛋白酶粗酶液保存時間長久。
[0019]3)本發(fā)明篩選到的耐高溫蛋白酶可以分泌到培養(yǎng)基中，方便純化，便于工業(yè)應(yīng)用。
[0020]4)本發(fā)明的耐高溫蛋白酶應(yīng)用廣泛，可降解多種植物蛋白，如豆柏、米柏、植物蛋白酵母培養(yǎng)物、構(gòu)樹葉、酒糟等。
[0021]5)本發(fā)明的耐高溫蛋白酶可以使植物蛋白及酵母培養(yǎng)物中蛋白質(zhì)降解率達到60%以上，產(chǎn)物小肽含量達10~50%。用該酶處理植物蛋白和酵母培養(yǎng)物可以改善蛋白品質(zhì)，提高營養(yǎng)價值，改善溶解性、起泡性等功能特性，更易于動物體消化吸收。
[0022]【具體實施方式】 :
結(jié)合實施例對本發(fā)明一種耐高溫蛋白酶及其菌株選育方法和在酶解中的應(yīng)用方法作進一步說明如下:
實施例1:是本發(fā)明一種耐高溫蛋白酶實施例。該耐高溫蛋白酶在20~80°C的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65°C條件下，活性可保持3 h不變，在40~50°C的條件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，當pH7~9時24h內(nèi)酶活性保存率為100% ;所述耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌株是由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。。
[0023]實施例2:是本發(fā)明一種用于發(fā)酵產(chǎn)出實施例1所述耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其分類命名為巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl 15 {Pichia pas tor is MMpk~GS115 )，保藏中心保藏編號為:CCTCC NO: M 2014171，保藏日期為:2014年4月28日，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)；所述巴斯德畢赤酵母
形態(tài)及生理生化特征包括:呈乳白色，菌體鏡檢呈橢圓形或園形，為甲醇營養(yǎng)型菌。
[0024]所述的用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，在通過甲醇補料發(fā)酵后，發(fā)酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg，小于等于 5000U/mg。
[0025]實施例3:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，步驟為:
A、準備白色側(cè)齒霉菌用作耐高溫蛋白酶基因序列來源；
B、利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得目的基因序列沙左，即采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來；
C、將目的基因插入表達載體:插入構(gòu)建的常規(guī)的畢赤酵母表達載體p9kNTS、p9kMFII:
D、將上述表達載體的重組和線性化；
E、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl15:經(jīng)重組和線性化后，電轉(zhuǎn)化；F、初篩、復(fù)篩，最后獲得一株耐聞溫蛋白酶菌株。
[0026]實施例4:是實旋例3的進一步實施例。所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，所述的D步驟初篩、復(fù)篩是:搖瓶酶活測定篩選，以篩選到的酶活相對很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作為宿主菌，將重組質(zhì)粒p9kNTS_Fpk、p9kMF I1-Fpk線性化后進行二次電轉(zhuǎn)化，再進行較高濃度的G418梯度高拷貝篩選，酶活測定篩選，獲得一株耐高溫蛋白酶的菌株。
[0027]實施例5:是本發(fā)明的耐高溫蛋白酶在酶解中的應(yīng)用方法的基本實施例。該應(yīng)用方法是先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解，該酶解的步驟包括:
首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，干酶解基料與水的比為1:1~9，調(diào)整PH6~9，然后在溫度為55~65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為300~5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3~36 h，最后得到液態(tài)的酶解的蛋白質(zhì)，或經(jīng)干燥得到干的酶解的蛋白質(zhì)。該蛋白質(zhì)小肽含量為10%~50%，占干的酶解的蛋白質(zhì)總蛋白的40%~75%/g。所述的酶解基料為發(fā)酵植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物；所述發(fā)酵植物蛋白包括大米柏、豆柏、白酒糟、構(gòu)樹葉。
[0028]所述耐高溫蛋白酶粗酶是在發(fā)酵罐中加入BSM無機鹽培養(yǎng)基，然后接種耐高溫蛋白酶菌株，并以甲醇誘導(dǎo)進行高密度發(fā)酵55~72h，優(yōu)先為60 h，得到耐高溫蛋白酶粗酶液，或再經(jīng)干燥得到干的耐高溫蛋白酶粗酶。所述發(fā)酵罐優(yōu)選為50 L，發(fā)酵時間優(yōu)選為60h。所述耐高溫蛋白酶粗酶液活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg,小于等于5000U/mg。
[0029]實施例6:是耐高溫蛋白酶發(fā)酵產(chǎn)生及特性分析方法步驟:
a.發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基配置:85%磷酸 26.7 mL/L，CaS04 (0.93 g/L)，K2S04 (18.2 g/L),MgS04.7Η20(14.9 g/L)，KOH (4.13 g/L)，甘油 40 g/L。
[0030]b.培養(yǎng)基滅菌:115°C，20min。
[0031]c.發(fā)酵控制:30°C, pH5.0,600 rpm，溶氧值DO控制在10%~30%之間。
[0032]d.誘導(dǎo)產(chǎn)酶:根據(jù)溶氧值進行補加甲醇作為誘導(dǎo)劑和碳源，氨水為氮源。
[0033]e.酶活力測定:福林酚比色法測定蛋白酶活力。
[0034]以干酪素作為底物，反應(yīng)產(chǎn)物含酚羥基的氨基酸與福林酚試劑在堿性條件下發(fā)生氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生顯示藍色，在660nm下測定吸光值。在65°C下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1μ g酪氨酸，定義為I個蛋白酶活力單位。
[0035]酶學(xué)性質(zhì)分析:1)最適作用溫度試驗；2)最適pH試驗；3)酶對溫度和pH穩(wěn)定性試驗；4)蛋白酶比活力分析。
[0036]實施例7:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解大米柏中的應(yīng)用方法，其酶解基料為大米柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1: 9，調(diào)整pH8，在60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。
[0037]實施例8:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解豆柏中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料為豆柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整pH9，然后在溫度為65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為?οοου/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為16h。
[0038]實施例9:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解白酒糟中的應(yīng)用方法，其酶解基料為白酒糟，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:5，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為12h。
[0039]實施例10:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解構(gòu)樹葉中的應(yīng)用方法，其酶解基料為構(gòu)樹葉，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整pH為自然狀態(tài)，然后在溫度為60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。
[0040]實施例11:是本發(fā)明所述的耐高溫蛋白酶在酶解酵母培養(yǎng)物中的應(yīng)用方法，其酶解基料為酵母培養(yǎng)物，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:7，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為36h。
[0041]本發(fā)明權(quán)利要 求保護范圍不限于上述實施例。
【權(quán)利要求】
1.一種耐高溫蛋白酶，其特征在于，該耐高溫蛋白酶在20~80°C的條件下具有活性和較高的熱穩(wěn)定性，在65°C條件下，活性可保持3 h不變，在40~50°C的條件下，24 h仍有60%以上的活性；在pH 6~11范圍內(nèi)均有活性，當pH7~9時24h內(nèi)酶活性保存率為100%;所述耐高溫蛋白酶產(chǎn)生菌株是由畢赤酵母通過基因工程手段改造而成。
2.一種用于發(fā)酵產(chǎn)出權(quán)利要求1所述耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其特征在于，分類命名為巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl 15 {Pi chi a pastor is MMpk-GSl 15 )，保藏中心保藏編號為:CCTCC NO: M 2014171，保藏日期為:2014年4月28日，保藏單位為:中國典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC)，地址:武漢市武昌珞珈山武漢大學(xué)；所述巴斯德畢赤酵母遍形態(tài)及生理生化特征包括:呈乳白色，菌體鏡檢呈橢圓形或園形，為甲醇營養(yǎng)型菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種用于發(fā)酵產(chǎn)出耐高溫蛋白酶的畢赤酵母，其特征在于，通過甲醇補料發(fā)酵后，發(fā)酵液蛋白酶活力大于等于50000U/mL，小于等于100000U/mL，比活力大于等于3000U/mg,小于等于5000U/mg。
4.一種權(quán)利要求1所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，其特征在于，包括下述步驟: A、準備白色側(cè)齒霉菌用作耐高溫蛋白酶基因序列來源； B、利用重疊延伸PCR技術(shù)獲得目的基因序列沙左，即采用具有互補末端的引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴增反應(yīng)中通過重疊鏈的延伸，將不同來源的擴增片段重疊拼接起來； C、將目的基因插入表達載體:插入構(gòu)建的常規(guī)的畢赤酵母表達載體p9kNTS、p9kMFII: D、將上述表達載體的重組和線性化； E、電轉(zhuǎn)化巴斯德畢赤酵母MMpk-GSl15:經(jīng)重組和線性化后，電轉(zhuǎn)化； F、初篩、復(fù)篩，最后獲得一株耐聞溫蛋白酶菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的耐高溫蛋白酶菌株選育方法，其特征在于，所述的D步驟初篩、復(fù)篩是:搖瓶酶活測定篩選，以篩選到的酶活相對很高的酵母工程p9kNTS-Fpk-GS115作為宿主菌，將重組質(zhì)粒p9kNTS-Fpk、p9kMF I1-Fpk線性化后進行二次電轉(zhuǎn)化，再進行較高濃度的G418梯度高拷貝篩選，酶活測定篩選，獲得一株耐高溫蛋白酶的菌株。
6.一種權(quán)利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解中的應(yīng)用方法，其特征在于，先將耐高溫蛋白酶制備成耐高溫蛋白酶粗酶，然后將酶解基料以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解，該酶解的步驟包括: 首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，干酶解基料與水的比為1:1~9，調(diào)整PH6~9，然后在溫度為55~65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為300~5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3~36 h，最后得到液態(tài)的酶解的蛋白質(zhì)，或經(jīng)干燥得到干的酶解的蛋白質(zhì)； 所述的酶解基料為發(fā)酵植物蛋白，或酵母培養(yǎng)物；所述發(fā)酵植物蛋白包括大米柏、豆柏、白酒糟、構(gòu)樹葉。
7.—種權(quán)利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解大米柏中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料為大米柏 ，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1: 9，調(diào)整pH8，在60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。
8.—種權(quán)利要求4或5的所述的耐高溫蛋白酶在酶解豆柏中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料為豆柏，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整PH9，然后在溫度為65°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為16h。
9.一種權(quán)利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解白酒糟中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料為白酒糟，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:5，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為5000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為12h。
10.一種權(quán)利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解構(gòu)樹葉中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料為構(gòu)樹葉，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:9，調(diào)整pH為自然狀態(tài)，然后在溫度為60°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為3h。
11.一種權(quán)利要求4或5所述的耐高溫蛋白酶在酶解酵母培養(yǎng)物中的應(yīng)用方法，其特征在于，酶解基料 為酵母培養(yǎng)物，以耐高溫蛋白酶粗酶進行酶解的步驟為:首先，將酶解基料加水拌均，加水量按重量計，基料與水的比為1:7，調(diào)整pH8，然后在溫度為55°C條件下加入耐高溫蛋白酶粗酶，加入量為1000U/g干酶解基料；再發(fā)酵酶解，時間為36h。
【文檔編號】C12N15/57GK103981164SQ201410237283
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年5月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月30日
【發(fā)明者】葛向陽, 彭楠, 方玉美, 趙述淼, 李俊, 遲晨, 潘超, 姜超, 梁運祥 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)