一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法
【專利摘要】本發(fā)明公開一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，方法包括：首先將發(fā)酵液先加熱升溫至60℃，殺滅發(fā)酵液中的鏈霉菌活菌體，通過濾布或陶瓷微濾膜除去新奧霉素發(fā)酵液中培養(yǎng)基固形物和菌體雜質(zhì)后，除去固形物的發(fā)酵液經(jīng)大孔吸附樹脂吸附處理，然后，用陽離子交換樹脂吸附富集大孔吸附樹脂流出液中的新奧霉素，最后，采用0.5-5.0％氨水進(jìn)行解析、濃縮，制成新奧霉素母液，或添加載體，烘干制成粉劑。本發(fā)明提供了一種新的低成本制備新型生物農(nóng)藥新奧霉素母藥或制劑的方法。
【專利說明】一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物農(nóng)藥制造【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及到一種放線菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法。
【背景技術(shù)】
[0002]微生物來源的活性化合物是高效低毒農(nóng)用抗生素的主要來源，以微生物代謝產(chǎn)物研制開發(fā)的抗生素是生物農(nóng)藥的重要組成部分，也是世界農(nóng)藥開發(fā)的主要研究方向。
[0003]我國農(nóng)用抗生素的研究起步較早，早期，我國成功研制了春雷霉素，慶豐霉素，井崗霉素，多抗霉素，公主霉素，多效霉素，農(nóng)抗120等。近十多年來，一些新的農(nóng)用抗生素如中生霉素，武夷霉素，寧南霉素、華光霉素、嘧肽霉素等獲得開發(fā)。目前，我國農(nóng)用殺菌劑產(chǎn)品除了井R霉素外，進(jìn)入實用化的還有春雷霉素、農(nóng)用鏈霉素、寧南霉素等有限的幾種，作為殺菌劑的抗生素類生物農(nóng)藥品種非常少，產(chǎn)業(yè)化水平較低，遠(yuǎn)不能滿足市場需求。
[0004]新型核苷二肽類農(nóng)用抗生素新奧霉素由一株諾爾斯鏈霉菌的發(fā)酵液中分離得到的。具有廣譜的抗植物病毒病和細(xì)菌病害的活性尤其對革蘭氏陽性菌、植物病毒的抑制活性很強(qiáng)。
[0005]在國內(nèi)多個省、地區(qū)進(jìn)行了小區(qū)和大田應(yīng)用示范等試驗，表明對煙草、辣椒、番茄花葉病毒病等具有很強(qiáng)的抗植物病毒病活性，還能夠防治水稻白葉枯病、青枯病、軟腐病等細(xì)菌病害，抗菌作用譜廣。新奧霉素制劑毒理學(xué)試驗結(jié)果表明屬于微毒。產(chǎn)新奧霉素的鏈霉菌經(jīng)多輪誘變選育，已獲得了一株有產(chǎn)業(yè)化價值的高產(chǎn)菌株，并且，新奧霉素發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)及放大發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)已比較成熟。相對鏈霉菌發(fā)酵產(chǎn)物來說，在發(fā)酵產(chǎn)物中活性物質(zhì)新奧霉素的量還是很低的，加之在發(fā)酵液中還存在與新奧霉素共存的其它大量雜質(zhì)和副產(chǎn)物，如微生物細(xì)胞、蛋白質(zhì)、色素、其它細(xì)胞代謝產(chǎn)物及末用完的培養(yǎng)基，因此，從發(fā)酵液中提取新奧霉素是一個比較復(fù)雜的過程。，
[0006]由于微生物發(fā)酵產(chǎn)生新奧霉素類的嘧啶核苷二肽的產(chǎn)量一直比較低，因此，近20年來，微生物學(xué)家研究的重點主要側(cè)重于與用微生物發(fā)酵生產(chǎn)嘧啶核苷二肽類抗生素的方法，有關(guān)從微生物發(fā)酵液中提取嘧啶核苷二肽類抗生素的工作開展得不多。發(fā)明專利ZL200910060121.4公開了涉及微量新奧霉素樣品(mg級)的制備技術(shù)，包括新奧霉素發(fā)酵結(jié)束后，通過添加2-4倍發(fā)酵液體積的甲醇或乙醇，從上述發(fā)酵培養(yǎng)液中收集新奧霉素，再通過正相硅膠層析和反相硅膠層析分離，得到的新奧霉素樣品，用高效液相色譜進(jìn)一步分離純化，制備得到微量的新奧霉素。該提取技術(shù)方法步驟繁瑣，耗用大量的有機(jī)溶劑，提取周期長，活性損失大，不適合大量新奧霉素的制備。發(fā)明專利ZL201110261822.1公開了的硅膠層析三元洗脫體系改變?yōu)槎疵擉w系的提取技術(shù)方法，并去掉了反相硅膠層析分離和高效液相色譜純化步驟，具有耗用有機(jī)溶劑少等優(yōu)點，但硅膠柱的再生和使用次數(shù)使放大生產(chǎn)受到了一定的限制。目前，非常缺乏從發(fā)酵液中提取新奧霉素的發(fā)酵工程下游技術(shù)。
[0007]為了解決現(xiàn) 有新奧霉素提取技術(shù)的不足，在充分進(jìn)行了新奧霉素發(fā)酵產(chǎn)物理化性質(zhì)研究的基礎(chǔ)上，本發(fā)明提出了一種新的從鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物中提取新奧霉素的技術(shù)方案。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0008]本發(fā)明的目的是提供一種鏈霉菌發(fā)酵液中新奧霉素的富集及分離提取方法，建立一種新奧霉素發(fā)酵工程下游提取技術(shù)，并且容易放大生產(chǎn)，而且分離效果好，產(chǎn)品收率高。
[0009]為達(dá)到上述目的，本發(fā)明的具體技術(shù)方案是:提供一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，該方法包括以下步驟:
[0010](I)將能發(fā)酵產(chǎn)生新奧霉素的一株諾爾斯鏈霉菌(Streptomyces noursei)的遺傳改良菌株“諾爾斯鏈霉菌XiAo-3”接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體深層培養(yǎng)得到含有新奧霉素的發(fā)酵液，首先將發(fā)酵液先加熱升溫至60°C -80°C進(jìn)行殺菌處理，再用濾布過濾或采用陶瓷微濾膜除去上述發(fā)酵液中的培養(yǎng)基固形物和菌體雜質(zhì)，得到預(yù)處理發(fā)酵液；
[0011](2)用大孔吸附樹脂處理步驟(1)中得到的預(yù)處理發(fā)酵液得到吸附樹脂處理液；
[0012](3)使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧霉素:將步驟(2)得到的吸附樹脂處理液均速流過裝有大孔陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與大孔陽離子樹脂的接觸時間為90min-180min，當(dāng)交換后流出液中新奧霉素的生物活性單位達(dá)到原始發(fā)酵液活性單位的5-10%時停止繼續(xù)進(jìn)吸附樹脂處理液，得到吸附達(dá)到飽和的樹脂；
[0013](4)解析:將步驟⑶吸附飽和的樹脂用洗脫劑進(jìn)行解析得到解析液；
[0014](5)用硫酸或鹽 酸將步驟(4)得到的解析液的pH值調(diào)至7后，再濃縮到新奧霉素含量大于12%以上，配制成濃度為8% -12%的新奧霉素農(nóng)藥母液；或再添加載體烘干制成粉劑。
[0015]關(guān)于步驟(1)中的菌株諾爾斯鏈霉菌XiAo-3 (Streptomyces noursei XiAo-3)的保藏信息是:保藏號為CGMCC N0.2898 ;分類命名為:諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei);于2009年2月9日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，地址是:北京市朝陽區(qū)大屯路中國科學(xué)院微生物研究所。
[0016]具體地或優(yōu)選地，本發(fā)明上述一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法中:
[0017]步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂包括非極性、弱極性和強(qiáng)極性吸附樹脂；優(yōu)選型號如 S-8、D-101、D-101-1、DA-201、HPD-100、X_5、AB-8、DM130、DM-301 中的一種或幾種的混合物；更優(yōu)選D-101或D-101和DM130混合物。其作用是吸附除去預(yù)處理發(fā)酵液中的一些蛋白質(zhì)、色素和其它一些會影響下一步交換富集新奧霉素的脂溶性雜質(zhì)。
[0018]步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂包括但不限于是001X7、002X 7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113中的一種，優(yōu)選7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
[0019]步驟⑷洗脫劑包括但不限于是質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% HCl溶液、I % NaCl溶液或
0.5-5.0%氨水中的一種，優(yōu)選3%氨水。洗脫劑的流速控制在每小時1-4倍交換柱的體積。
[0020]步驟(5)中的載體為本領(lǐng)域常規(guī)使用的載體，包括但不限于高嶺土、蛭石、白炭黑
坐寸ο
[0021]本發(fā)明有益效果:[0022]本發(fā)明首先針對諾爾斯鏈霉菌XiAo-3發(fā)酵新奧霉素的發(fā)酵液含有大量的蛋白質(zhì)，發(fā)現(xiàn)并篩選了用可以重復(fù)使用的大孔吸附樹脂提取工藝代替了現(xiàn)有技術(shù)中存在的添加2-4倍發(fā)酵液體積的甲醇或乙醇方法，不能重復(fù)使用的硅膠層析提取技術(shù)方法，不僅成本高，而且不易于放大生產(chǎn)。避免了在提取過程中大量有幾溶劑的使用，減少了對環(huán)境的影響；以及在進(jìn)一步富集發(fā)酵液中新奧霉素的工藝中，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了發(fā)酵液經(jīng)除去了大量蛋白質(zhì)之后，陽離子交換樹脂可以很好的對新奧霉素進(jìn)行富集，洗脫，而且，陽離子交換樹脂工藝很容易進(jìn)行規(guī)?；a(chǎn)。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明所述的一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法的提取流程圖。
【具體實施方式】
[0024]以下所給出的實施例是為進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)特征，并非對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行限制。對本發(fā)明中的技術(shù)方案進(jìn)行的任何修改或局部替換，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍的情況下，均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍中。
[0025]實施例1
[0026]將諾爾斯鏈 霉菌XiAo-3的發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸銨0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，氯化鈉
0.5% ,氯化鈣0.5%)于121°C滅菌30分，冷卻后接種諾爾斯鏈霉菌XiAo-3種子液，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵4天。發(fā)酵結(jié)束后。首先將發(fā)酵液先加熱升溫至60°C，保持30分鐘，殺滅發(fā)酵液中的鏈霉菌活菌體，然后將發(fā)酵液溫度降至30°C以下，加入2.0%硅藻土助濾劑到滅菌后的發(fā)酵液中，攪拌均勻，放置20分鐘，用600目濾布過濾，收集濾液。
[0027]用大孔吸附樹脂吸附處理濾布過濾液。使用的大孔吸附樹脂是D-101非極性大孔吸附樹脂，吸附除去濾布過濾液中的一些蛋白質(zhì)、色素和其它一些會影響下一步交換富集新奧霉素的脂溶性雜質(zhì)，得到吸附樹脂處理液；
[0028]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧霉素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0029]吸附飽和后的樹脂用3%氨水進(jìn)行解析，洗脫劑的流速控制在每小時2倍樹脂交換柱的體積。
[0030]用鹽酸將上面得到的解析液的pH值調(diào)至7后，根據(jù)解析液的新奧霉素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數(shù)使新奧霉素的濃度達(dá)到12%以上，配制成12%新奧霉素農(nóng)藥母液。
[0031]實施例2
[0032]將諾爾斯鏈霉菌XiAo-3的發(fā)酵培養(yǎng)基(甘油1.0%，蔗糖7.0%，硫酸銨0.1%,葡萄糖8.0%，蛋白胨2.0%，酵母粉1.0%，硫酸鎂0.5%，磷酸二氫鉀1.0%，氯化鈉
0.5% ,氯化鈣0.5%)于121°C滅菌30分，冷卻后接種諾爾斯鏈霉菌XiAo-3種子液，在28°C-30°C溫度下，通氣攪拌發(fā)酵4天。發(fā)酵結(jié)束后。首先將發(fā)酵液先加熱升溫至60°C，保持30分鐘，殺滅發(fā)酵液中的諾爾斯鏈霉菌活菌體，然后將發(fā)酵液溫度降至30°C以下，將以上發(fā)酵液用陶瓷微濾膜過濾，除去發(fā)酵液中的培養(yǎng)基固形物和菌體雜質(zhì)，分離孔徑為
0.2 μ m，其過濾壓力為0.1MPa,收集過濾液。
[0033]用大孔吸附樹脂吸附處理微濾膜過濾液。使用的大孔吸附樹脂是DM-301中極性大孔吸附樹脂，吸附除去過濾液中的一些蛋白質(zhì)、色素和其它一些脂溶性雜質(zhì)，得到吸附樹脂處理液；
[0034]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧霉素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0035]吸附飽和后的樹脂用3%氨水進(jìn)行解析，洗脫劑的流速控制在每小時2倍樹脂交換柱的體積。
[0036]用硫酸或鹽酸將上面得到的解析液的pH值調(diào)至7后，根據(jù)解析液的新奧霉素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數(shù)使新奧霉素的濃度達(dá)到12%以上，添加白炭黑載體，烘干制成粉劑。
[0037]實施例3
[0038]除去發(fā)酵液中的培養(yǎng)基固形物和菌體雜質(zhì)的方法同實施例2。處理濾液用大孔吸附樹脂處理。使用的大 孔吸附樹脂是D-101非極性和DM-301中極性大孔吸附樹脂的混合物，得到吸附樹脂處理液；
[0039]使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧霉素。陽離子交換過程中使用的是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。將吸附樹脂處理液均速流過裝有7320陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與樹脂的接觸時間為150min。
[0040]吸附飽和后的樹脂用2%氨水進(jìn)行解析，洗脫劑的流速控制在每小時I倍樹脂交換柱的體積。
[0041]用鹽酸將上面得到的解析液的pH值調(diào)至7后，根據(jù)解析液的新奧霉素濃度大小，濃縮解析液到一定倍數(shù)使新奧霉素的濃度達(dá)到12%以上，添加高嶺土載體，烘干制成粉劑。
【權(quán)利要求】
1.一種鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟: (1)將能發(fā)酵產(chǎn)生新奧霉素的一株諾爾斯鏈霉菌(Streptomycesnoursei)的遺傳改良菌株“諾爾斯鏈霉菌XiAo-3”接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行液體深層培養(yǎng)得到含有新奧霉素的發(fā)酵液，首先將發(fā)酵液先加熱升溫至60°C -80°C進(jìn)行殺菌處理，再用濾布過濾或采用陶瓷微濾膜除去上述發(fā)酵液中的培養(yǎng)基固形物和菌體雜質(zhì)，得到預(yù)處理發(fā)酵液； (2)用大孔吸附樹脂處理步驟(1)中得到的預(yù)處理發(fā)酵液得到吸附樹脂處理液； (3)使用陽離子樹脂富集分離吸附樹脂處理液中的新奧霉素:將步驟(2)得到的吸附樹脂處理液均速流過裝有大孔陽離子樹脂的離子交換柱，控制吸附樹脂處理液的流速使吸附樹脂處理液與大孔陽離子樹脂的接觸時間為90min-180min，當(dāng)交換后流出液中新奧霉素的生物活性單位達(dá)到原始發(fā)酵液活性單位的5-10%時停止繼續(xù)進(jìn)吸附樹脂處理液，得到吸附達(dá)到飽和的樹脂； (4)解析:將步驟 (3)吸附飽和的樹脂用洗脫劑進(jìn)行解析得到解析液； (5)用硫酸或鹽酸將步驟(4)得到的解析液的pH值調(diào)至7后，再濃縮到新奧霉素含量大于12%以上，配制成濃度為8% -12%的新奧霉素農(nóng)藥母液；或再添加載體烘干制成粉劑。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂包括非極性、弱極性和強(qiáng)極性吸附樹脂。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，所述的大孔吸附樹脂優(yōu)選型號為S-8、D-1OU D-101-1、DA-201、HPD-100, X_5、AB-8、DM130、DM-301中的一種或幾種的混合物。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(2)中所述的大孔吸附樹脂優(yōu)選為D-101或D-101和DM130混合物。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂包括001X7、002X7、7320、NKC-9、D72、D001、D151、D113 中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求5中所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(3)中所述的陽離子交換過程中使用的陽離子樹脂優(yōu)選是7320磺酸基聚苯乙烯系凝膠型強(qiáng)酸性陽離子交換樹脂。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(4)中洗脫劑包括質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2% HCl溶液、I % NaCl溶液或0.5-5.0%氨水中的一種。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟⑷中洗脫劑優(yōu)選為3%氨水。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟⑷中洗脫劑的流速控制在每小時1-4倍交換柱的體積。
10.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一項所述的鏈霉菌發(fā)酵代謝產(chǎn)物新奧霉素的分離提取方法，其特征在于，步驟(5)中的載體為本領(lǐng)域常規(guī)使用的載體，包括但不限于高嶺土、蛭石、白炭黑。
【文檔編號】C12R1/57GK103965275SQ201410225218
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月27日
【發(fā)明者】周金燕, 楊杰, 鐘娟, 譚紅 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所