TaNAC2蛋白及其編碼基因的應(yīng)用的制作方法【專利摘要】本發(fā)明公開了一種TaNAC2蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，TaNAC2基因可以促進(jìn)植物對(duì)氮的吸收利用。本發(fā)明公開的一種提高植物氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步驟：將SEQ?ID?No.4所示的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率提高。本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn)：1、TaNAC2基因作為硝態(tài)氮響應(yīng)的調(diào)控因子調(diào)控小麥氮素吸收利用途徑上的一系列基因的表達(dá)，這對(duì)闡明植物氮素代謝利用的機(jī)理研究將有極大的推動(dòng)作用。2、通過基因工程技術(shù)提高TaNAC2的表達(dá)量能夠提高氮素同化效率，從而達(dá)到少施肥多產(chǎn)出的目的等?！緦＠f明】TaNAC2蛋白及其編碼基因的應(yīng)用【
技術(shù)領(lǐng)域：
】[0001]本發(fā)明涉及一種轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子及其編碼基因的應(yīng)用；特別涉及TaNAC2蛋白及其編碼基因在調(diào)控植物氮素吸收利用中的應(yīng)用，屬于生物【
技術(shù)領(lǐng)域：
】?！?br>背景技術(shù)：
】[0002]小麥?zhǔn)俏覈?guó)重要的糧食作物。無(wú)論是栽培面積還是總產(chǎn)量，我國(guó)都是世界上最大的小麥生產(chǎn)國(guó)。在新中國(guó)建立初期，中國(guó)的小麥單產(chǎn)很低，1952年只有0.73噸/公頃(48.8公斤/畝)，到2006年達(dá)到4.55噸/公頃(303.3公斤/畝)，增加了5.2倍，其中一個(gè)重要原因就是化肥用量的增加。據(jù)統(tǒng)計(jì)，化肥對(duì)農(nóng)業(yè)增產(chǎn)的貢獻(xiàn)占32%，占農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本的25%,占全部農(nóng)業(yè)生產(chǎn)物質(zhì)費(fèi)用的50%。目前我國(guó)年氮肥用量超過24Mt(純氮)，占全世界年氮肥消耗量的30%以上(Juetal.，2004)。然而在我國(guó)氮肥利用率較低，只有30-35%(發(fā)達(dá)國(guó)家45%)，有多達(dá)45-50%的氮肥未被農(nóng)作物吸收利用而損失進(jìn)入環(huán)境，導(dǎo)致資源浪費(fèi)和環(huán)境污染(ZhuandChen，2002)。在我國(guó)耕地面積持續(xù)減少的情況下，仍需依靠增施化肥來促進(jìn)小麥等農(nóng)作物增產(chǎn)以滿足日益增長(zhǎng)糧食需求。因此，利用生物學(xué)手段提高小麥吸收利用氮素的效率對(duì)保證我國(guó)糧食安全和農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有十分重大的戰(zhàn)略意義。[0003]植物對(duì)氮的吸收利用包括兩個(gè)過程:氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和氮素的同化，這其中涉及到的基因在模式植物擬南芥中研究的最清楚。植物對(duì)硝酸根的吸收靠?jī)商紫跛岣D(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng):高親和性硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白和低親和性硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。硝酸根濃度較低時(shí)高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用，AtNRT2.1和AtNRT2是最早克隆到的高親和性硝酸根轉(zhuǎn)運(yùn)基因(FilleurandDaniel-Vedele,1999；Zhuoetal.，1999),根據(jù)同源搜索,又發(fā)現(xiàn)了這個(gè)家族的另外五個(gè)基因(Initiative.，2000)。硝酸根濃度較高時(shí)低親和性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白起作用，AtNRTl.1(CHLl)是在抗氯酸鹽(硝酸鹽類似物)的突變體中克隆出來的(Tsayetal.，1993)。硝酸根進(jìn)入植物體后要經(jīng)過硝酸根還原酶(NR)和亞硝酸根還原酶(NiR)的作用還原為銨態(tài)氮(NH4+)，在谷氨酰胺合成酶GS、谷氨酸脫氫酶GDH的作用下，進(jìn)入氨基酸代謝途徑。研究表明超量表達(dá)GS、G0GAT和⑶H，可以明顯提高農(nóng)作物氮素同化效率和產(chǎn)量(Amezianeetal.2000；Habashetal.2001；MifIinandHabash2002)。[0004]以上研究只是停留在單個(gè)功能基因?qū)用?，氮、磷吸收同化的調(diào)控是交叉網(wǎng)絡(luò)式的，涉及光合作用、能量代謝等過程，單憑通路中某個(gè)基因的超量表達(dá)往往難以提高植物的養(yǎng)分利用效率。Dof是一類植物特有的轉(zhuǎn)錄因子，最近的研究表明:將擬南芥中的Dofl基因超量表達(dá)，可以顯著提高(~30%)擬南芥中的氮凈含量和耐受缺氮的能力(Yanagisawaetal.，2004)。其原理是Dofl可以調(diào)控碳素同化過程中的關(guān)鍵基因磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸激酶(PK)等高表達(dá)，提高碳代謝途徑，積累合成氨基酸所需要的碳骨架，因此增加了蛋白質(zhì)的含量。因此，尋找新的調(diào)控植物氮磷響應(yīng)的調(diào)控因子，不僅可以進(jìn)一步理解植物適應(yīng)氮磷脅迫的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而且還可為養(yǎng)分高效農(nóng)作物新品種培育提供新的基因資源。[0005]NAC轉(zhuǎn)錄因子是植物特有的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。自1996年從矮牽牛(Petuniahybrida)中克隆得到植物中第一個(gè)NAC轉(zhuǎn)錄因子以來，目前已在擬南芥(Arabidopsisthaliana)、水稻、小麥、大豆(Glycinemax)等物種中相繼發(fā)現(xiàn)。擬南芥中至少包含107個(gè)NAC基因(Riechmannetal.，2000)，水稻中含有140個(gè)(Fangetal.，2008)。在NAC轉(zhuǎn)錄因子中，最主要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是各成員的N端含有高度保守的NAC結(jié)構(gòu)域。NAC結(jié)構(gòu)域大約由160個(gè)氨基酸殘基組成，可分為1、I1、II1、IV和V共5個(gè)亞結(jié)構(gòu)域(Ookaetal.,2003),可能負(fù)責(zé)與DNA和其它蛋白結(jié)合(Ernstetal.，2004)。NAC蛋白的C端保守性較低，具有轉(zhuǎn)錄激活功能(Renetal.，2000；Xieetal.，2000；Duvaletal.，2002)。研究表明，NAC類蛋白參與了種子的萌發(fā)(Kimetal.，2008)、細(xì)胞次生壁的合成(Kuboetal.，2005；Koetal.，2007)、器官邊界和分生組織的形成(Aidaetal.,1997；Takadaetal.,2001；Vroemenetal.,2003；Maoetal.,2007)、開花(Kimetal.,2007)、衰老(GuoandGan,2006；Yoonetal.,2008；Uauyetal.,2006)等多個(gè)植物生長(zhǎng)發(fā)育過程。NAC類蛋白還在植物的生物脅迫如病害過程中發(fā)揮著重要作用(CollingeandBoiler,2001；Jensenetal.,2007；Buetal.,2008)。目前已發(fā)現(xiàn)多個(gè)NAC蛋白參與植物對(duì)逆境的響應(yīng)。來自水稻的SNAC1/2(stress-responsiveNAC2)基因受到干旱、高鹽、低溫、傷以及ABA的誘導(dǎo)表達(dá)，其過表達(dá)植株耐冷、抗鹽并能抵御干旱等(Huetal.，2008)，將小麥中的TaNAC2超表達(dá)在擬南芥中也能夠提高擬南芥對(duì)非生物脅迫的耐受力(Maoetal.，2012)。NAC蛋白中中國(guó)春小麥的TaNAC2基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示，TaNAC2蛋白的氨基酸序列如SEQIDN0.4所示。綜上，NAC類蛋白作為一類重要的轉(zhuǎn)錄因子，在調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育過程和多種植物逆境防御反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用，然而關(guān)于NAC類蛋白在提高植物養(yǎng)分吸收尤其是調(diào)控硝酸根吸收速率方面的研究卻鮮有報(bào)道?！?br/>發(fā)明內(nèi)容】[0006]本發(fā)明的目的是提供一種TaNAC2蛋白及其編碼基因的應(yīng)用，TaNAC2蛋白及其編碼基因可以促進(jìn)植物對(duì)氮的吸收利用。[0007]本發(fā)明提供一種提高植物氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步驟JfSEQIDN0.4所示的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率提高。[0008]上述方法中，所述編碼基因是通過重組載體導(dǎo)入的，所述重組載體是將所述編碼基因替換改造后的PACH25的⑶S基因序列得到的，具體是將SEQIDN0.3所示的DNA分子插入改造后的PACH25的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間，替換改造后的pACH25的⑶S基因序列得到的；[0009]所述改造后的pACH25是將Ubiquitin啟動(dòng)子插入pACH25載體的PstI酶切位點(diǎn)間得到；[0010]所述將SEQIDN0.4所示的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物的方法為基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法；[0011]所述編碼基因的核苷酸序列具體如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。[0012]上述任一所述的方法中，所述植物為小麥。[0013]如下任一所述的物質(zhì)在提高植物氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0014](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0015](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0016](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0017]如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和/或產(chǎn)籽中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0018](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0019](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0020](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0021]如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物根生長(zhǎng)中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0022](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0023](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0024](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0025]如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物主根長(zhǎng)增長(zhǎng)和/或側(cè)根數(shù)增加中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0026](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0027](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0028](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0029]如下任一所述的物質(zhì)在提高植物硝酸根吸收速率中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0030](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0031](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0032](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0033]如下任一所述的物質(zhì)在提高植物分蘗數(shù)或地上部分干重，或提高植物單株籽粒產(chǎn)量，或提高植物植株中氮含量，或提高植物籽粒中氮濃度中的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍:[0034](I)SEQIDN0.4所示的蛋白；[0035](2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；[0036](3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。[0037]上述任一所述的應(yīng)用中，所述植物為小麥；[0038]所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。[0039]本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):[0040]1、雖然目前已經(jīng)克隆到了一些氮素吸收、同化、轉(zhuǎn)運(yùn)等過程的關(guān)鍵基因，但植物氮素吸收利用的調(diào)控是交叉網(wǎng)絡(luò)式的，單個(gè)功能基因不足以闡明其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，而本發(fā)明克隆的TaNAC2基因作為硝態(tài)氮響應(yīng)的調(diào)控因子調(diào)控小麥氮素吸收利用途徑上的一系列基因的表達(dá)，這對(duì)闡明植物氮素代謝利用的機(jī)理研究將有極大的推動(dòng)作用。[0041]2、TaNAC2基因可以促進(jìn)小麥提高硝酸根吸收速率、單株籽粒產(chǎn)量、植株總氮含量、籽粒氮濃度以及氮素收獲指數(shù)，說明通過基因工程技術(shù)提高TaNAC2的表達(dá)量能夠提高氮素同化效率，從而達(dá)到少施肥多產(chǎn)出的目的。[0042]3、TaNAC2基因不僅影響氮素吸收利用，超表達(dá)該基因還增加了小麥的側(cè)根數(shù)目和最長(zhǎng)根長(zhǎng)，該基因的功能研究對(duì)于植物水肥高效利用的研究意義深遠(yuǎn)?！緦＠綀D】【附圖說明】[0043]圖1為pACH25/TaNAC2載體示意圖。[0044]圖2為轉(zhuǎn)基因植株的DNA水平鑒定。[0045]圖3為轉(zhuǎn)基因植株的RNA水平鑒定。[0046]圖4為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下根系表型。[0047]圖5為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下根的硝酸根吸收速率。[0048]圖6為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下分蘗數(shù)。[0049]圖7為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下苗期的地上部干重。[0050]圖8為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下單株籽粒產(chǎn)量。[0051]圖9為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下苗期總氮含量測(cè)定。[0052]圖10為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下籽粒氮濃度。[0053]圖11為轉(zhuǎn)基因植株與野生型植株在高、低氮培養(yǎng)條件下氮素收獲指數(shù)?！揪唧w實(shí)施方式】[0054]下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說明，均為常規(guī)方法。[0055]下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。[0056]中國(guó)春小麥(TriticumaestivumL.,“ChineseSpring”)在文獻(xiàn)“BrenchleyR,SpannaglM,PfeiferM,etal.AnalysisofthebreadwheatgenomeusingwhoIe-genomeshotgunsequencing[J].Nature,2012,491(7426):705-710.”中公開過，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。[0057]KODplusDNA聚合酶購(gòu)自Τ0Υ0Β0公司。[0058]10XPCRbufferforKODplus購(gòu)自TOYOBO公司。[0059]pACH25載體在文獻(xiàn)“ChristensenAH,QuailPH,1996,Ubiquitinpromoter-basedvectorsforhigh-levelexpressionofselectableand/orscreenablemarkergenesinmonocotyledonousplants.TransgenicRes5:213-218,”中公開過，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得，改造后的PACH25載體是將Ubiquitin啟動(dòng)子插入pACH25載體的PstI酶切位點(diǎn)間得到。[0060]小麥隴春23在文獻(xiàn)“袁俊秀,楊文雄,豐產(chǎn)廣適優(yōu)質(zhì)春小麥新品種-隴春23號(hào),麥類作物學(xué)報(bào)，2009,29(4):740”中公開過，公眾可從中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所獲得。[0061]實(shí)施例中氮素濃度分別為2mM和0.2mM的高氮營(yíng)養(yǎng)液和低氮營(yíng)養(yǎng)液的配方如表1所示。[0062]表1高氮營(yíng)養(yǎng)液和低氮營(yíng)養(yǎng)液的配方【權(quán)利要求】1.一種提高植物氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率的方法，包括如下步驟^fSEQIDN0.4所示的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物中，得到轉(zhuǎn)基因植物；與出發(fā)植物相比，轉(zhuǎn)基因植物的氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率提高。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于:所述編碼基因是通過重組載體導(dǎo)入的，所述重組載體是將所述編碼基因替換改造后的PACH25的GUS基因序列得到的，具體是將SEQIDN0.3所示的DNA分子插入改造后的pACH25的BamHI和KpnI酶切位點(diǎn)間，替換改造后的pACH25的⑶S基因序列得到的；所述改造后的PACH25是將Ubiquitin啟動(dòng)子插入pACH25載體的PstI酶切位點(diǎn)間得到；所述將SEQIDN0.4所示的蛋白的編碼基因?qū)氤霭l(fā)植物的方法為基因槍介導(dǎo)轉(zhuǎn)化的方法；所述編碼基因的核苷酸序列具體如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于:所述植物為小麥。4.如下任一所述的物質(zhì)在提高植物氮素的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)和/或氮素的同化效率中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。5.如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物生長(zhǎng)、發(fā)育和/或產(chǎn)籽中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。6.如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物根生長(zhǎng)中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。7.如下任一所述的物質(zhì)在促進(jìn)植物主根長(zhǎng)增長(zhǎng)和/或側(cè)根數(shù)增加中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。8.如下任一所述的物質(zhì)在提高植物硝酸根吸收速率中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。9.如下任一所述的物質(zhì)在提高植物分蘗數(shù)或地上部分干重，或提高植物單株籽粒產(chǎn)量，或提高植物植株中氮含量，或提高植物籽粒中氮濃度中的應(yīng)用:(1)SEQIDN0.4所示的蛋白；(2)SEQIDN0.4所示蛋白的編碼基因；(3)含有(2)所述編碼基因的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。10.根據(jù)權(quán)利要求4-9任一所述的應(yīng)用，其特征在于:所述植物為小麥；所述編碼基因的核苷酸序列如SEQIDN0.3中自5’末端起第7位至第993位核苷酸所示?！疚臋n編號(hào)】C12N15/29GK104004769SQ201410224957【公開日】2014年8月27日申請(qǐng)日期:2014年5月26日優(yōu)先權(quán)日:2014年5月26日【發(fā)明者】童依平,何雪,趙學(xué)強(qiáng),曲寶原,馬文英,李文靜,洪霞,史計(jì),李濱,李振聲申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所