夏枯草多糖鋅螯合物及其制備方法與在抗癌藥物中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了夏枯草多糖鋅螯合物及其制備方法與在抗癌藥物中的應(yīng)用。該方法包括將夏枯草果穗粉碎，乙醇脫色，加入蒸餾水，回流提取，提取液脫蛋白，超濾，截留液冷凍干燥得多糖；配制10～40mg/mL多糖溶液，加熱至40～60℃，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH，將鋅鹽溶液緩慢加入到多糖溶液中，反應(yīng)6～24h，同時用高剪切均質(zhì)機進行不連續(xù)均質(zhì)處理，用鹽酸調(diào)節(jié)pH，離心得上清液，置于透析袋進行透析，收集透析袋內(nèi)的溶液，冷凍干燥得夏枯草多糖鋅螯合物。本發(fā)明產(chǎn)品制備方法簡單易行，對人體癌細胞有顯著的抗增殖作用，且對人體正常細胞基本無細胞毒性，是一種理想的抗癌癥藥物或保健品；而且具有補鋅功效。
【專利說明】夏枯草多糖鋅螯合物及其制備方法與在抗癌藥物中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及夏枯草多糖，生物制藥工程和保健食品領(lǐng)域，具體涉及一種夏枯草多糖鋅螯合物及其制備方法與在制備抗癌藥物中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]夏枯草(Prunella vulgaris L.),歐洲地區(qū)稱“self -heal”,俗名羊腸菜、燈籠頭、鐵色草、棒柱頭花、大頭花等，為唇形科夏枯草屬植物夏枯草的干燥果穗。夏枯草屬植物是一種多年生植物，廣泛分布于歐洲和中國，中國主要分布于江蘇、浙江、安徽及湖北等地，產(chǎn)4種及3變種，其中I種為引種栽培。其性寒，辛、苦、入肝、膽經(jīng)，具有清肝火、消腫止痛、清熱解毒等功效。夏枯草是一種藥食同源的草本，在中國民間，夏枯草作為食療滋補品被廣泛用于治療咽喉痛、減少發(fā)熱和促進傷口的愈合等；作為中藥用于治療黃疸、肝炎、糖尿病及肺結(jié)核等疾病；在華南地區(qū)作為涼茶配方和營養(yǎng)靚湯的成分之一。研究表明夏枯草富含許多重要的生物活性物質(zhì)，主要包括多糖、三萜及其苷類、留醇及其苷類、黃酮類、香豆素、有機酸及揮發(fā)油等，其主要藥理作用表現(xiàn)在降血壓、降血脂、抗病毒、抗菌、抗氧化、免疫刺激作用和抗腫瘤等方面。天然植物多糖作為一類具有生物活性的大分子物質(zhì)，近年來得到廣泛的研究，研究證實多糖具有抗氧化、抗病毒、抗輻射、抗衰老、免疫調(diào)節(jié)及抗腫瘤等多種生物活性。
[0003]鋅是一種與 生命攸關(guān)的微量元素之一，在人體所含有的金屬微量元素中含量僅次于鐵，在生命活動過程中起著轉(zhuǎn)換物質(zhì)和交流能量的“生命齒輪”作用。鋅是參與酶的重要成分，迄今為止，與人體有關(guān)的含鋅酶大約100余種，研究表明許多種類含鋅的調(diào)節(jié)蛋白對DNA合成、基因表達、誘導(dǎo)細胞凋亡及細胞分化與繁殖等生命過程方面起著非常重要的作用。
[0004]同時，由于中國居民的膳食結(jié)構(gòu)以素食為主，我國居民的鋅攝入量普遍偏低。目前市場上常見的補鋅產(chǎn)品多為無機金屬鹽，其鋅源吸收形式為離子鋅，鋅離子在人體消化道內(nèi)往往容易與其它陰離子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生沉淀，水溶性差，生物利用率低，副作用大等缺點。而糖金屬螯合物具有無毒，具有較好的生物兼容性，易于人體吸收。目前國內(nèi)外未有關(guān)于夏枯草多糖鋅螯合物的制備及抗癌藥物中應(yīng)用的報道。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]針對上述情況，本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種具有抗癌作用的夏枯草多糖鋅螯合物及其制備方法。
[0006]本發(fā)明的目的通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0007]1、夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟:
[0008](I)原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過篩，加入乙醇加熱回流，夏枯草粉與乙醇的質(zhì)量比為1:3~1:6，溫度60~90°C，回流時間為2~6h，離心分離得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作2~4次，在45~55°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥24~36h，即得夏枯草粉；[0009](2)多糖提取:夏枯草粉加入蒸餾水水進行熱水浸提，夏枯草粉與蒸餾水的質(zhì)量比為1:20~1:40，提取溫度為65~100°C，時間為2~6h，離心分離得提取液，回流提取2~5次，合并提取液，在50~60°C下減壓濃縮到原體積的1/4~1/10，得多糖濃縮液；在所述多糖濃縮液中加入Sevag試劑,多糖濃縮液與Sevag試劑的體積比為3:1~6:1,振蕩20~60min，離心處理分離除去蛋白質(zhì)，重復(fù)脫蛋白10~20次；然后加入3~5倍多糖濃縮液體積的蒸餾水進行稀釋，進行超濾，截留分子量大小5~lOKDa，回收截留液，冷凍干燥得夏枯草多糖；
[0010](3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為10~40mg/mL多糖溶液；
[0011](4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至40~60°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7~10，持續(xù)攪拌下，逐滴加入鋅鹽溶液，其多糖溶液中固形物質(zhì)量和鋅鹽的質(zhì)量比為1:1~1:4,繼續(xù)在40~60°C下攪拌6~24h，反應(yīng)期間每隔I~2小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速8000~20000r/min,每次均質(zhì)I~2min,得夏枯草多糖鋅螯合物混合液；所述鋅鹽為氯化鋅、高氯酸鋅和醋酸鋅中的一種；
[0012](5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物混合液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4~5，離心取上清液，置于透析袋中進行透析，將透析袋中的溶液凍干，即得夏枯草多糖鋅螯合物。
[0013]為進一步實現(xiàn)本發(fā)明目的，優(yōu)選地，所述乙醇的體積百分比為95% ;所述過篩為過30~60目篩。
[0014]所述的Sevag試劑為氯仿與正丁醇的混合溶液，其體積比3:1~6:1。
[0015]所述步驟(1)和( 2)離心分離的離心力為4000~lOOOOg，離心時間為10~15min ;步驟(5)中離心力為4000~lOOOOg，離心時間為2~5min。
[0016]所述冷凍干燥是在-60±5°C，0.08~0.1MPa真空度下干燥干燥36~48h，干燥后的樣品中水分的質(zhì)量百分含量低于4%。
[0017]所述鋅鹽溶液的濃度為30~100mg/mL，將鋅鹽加入蒸餾水中，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)鋅鹽溶液PH值為2~3制成。
[0018]所述氫氧化鈉和鹽酸溶液的質(zhì)量濃度均為3~5%。
[0019]所述透析的時間為2~4d，透析袋截留的分子量為I~5KDa。
[0020]一種夏枯草多糖鋅螯合物，其由上述述制備方法制得。
[0021 ] 所述夏枯草多糖鋅螯合物在制備抗癌藥物和保健品中的應(yīng)用。
[0022]本發(fā)明的夏枯草多糖鋅螯合物主要以口服形式使用，可制成口服溶液、顆粒劑、片劑、丸劑等藥物和保健品。
[0023]以上操作步驟如無特別說明，均按本領(lǐng)域常規(guī)操作。
[0024]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點和技術(shù)效果:
[0025](I)本發(fā)明采用截留分子量5~1KDa超濾膜對提取液進行超濾，得到具有良好與鋅螯合的多糖，分子量在10~2000KDa范圍內(nèi)，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)，夏枯草多糖鋅螯合物中鋅含量可超過10mg/g。
[0026](2)采用高剪切均質(zhì)機對反應(yīng)體系進行不連續(xù)均質(zhì)處理，提高了反應(yīng)效率，產(chǎn)品鋅含量提高15~25%。
[0027](3)本發(fā)明首次合成了夏枯草多糖鋅螯合物，并且發(fā)現(xiàn)具有顯著的抗癌效果，而且對人體正常細胞基本無毒性，是一種理想的具有抗癌作用的藥物或保健品，可用于惡性腫瘤的輔助治療，同時具有補鋅作用。
[0028](4)本發(fā)明的夏枯草多糖鋅螯合物作為有機鋅鹽，溶解性好，在pH4~10范圍內(nèi)具有較高的穩(wěn)定性，也就是人體腸胃具有較高的穩(wěn)定性，適合用作人體補鋅制劑；
[0029](5)本發(fā)明制備方法簡單，生產(chǎn)效率高，產(chǎn)品質(zhì)量好的特點。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0030]圖1為實施例1夏枯草多糖的紅外光譜圖。
[0031]圖2為實施例1夏枯草多糖鋅螯合物的紅外光譜圖。
[0032]圖3為實施例5夏枯草多糖鋅螯合物對癌細胞抑制作用效果圖；其中圖3A為空白對照，圖3B為細胞抑制率50%的細胞形態(tài)，圖3C為細胞抑制率達90%以上的細胞形態(tài)。
【具體實施方式】
[0033]結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步說明，本發(fā)明的實施方式及形式不限于此。
[0034]實施例1
[0035](I)夏枯草原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過30目篩，加入95% (v/v)的乙醇，夏枯草粉與95%乙醇的質(zhì)量比為1:3，溫度601:，回流時間為2h，離心分離得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作2次，在45°C下干燥24h，即得夏枯草樣品；
[0036](2)多糖提取:加入蒸餾水水進行熱水浸提，夏枯草樣品與蒸餾水水的質(zhì)量比為1:20，溫度為65°C，時間為2h，離心分離提取液，回流提取2次，合并提取液，在50°C下減壓濃縮到原體積的1/4，得多糖濃縮液；在上述濃縮液中加入Sevag試劑，濃縮液與Sevag試劑(氯仿:正丁醇=3:1)的體積比為3:1，振蕩20min，離心除去變性的蛋白質(zhì)，重復(fù)脫蛋白10次；加入3倍體積的蒸餾水水進行稀釋，采用截留量5KDa的膜片進行超濾，截留液冷凍干燥36h，得夏枯草多糖；
[0037](3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為10mg/mL多糖溶液；
[0038](4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至40°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8，在攪拌下，緩慢逐滴加入氯化鋅溶液(氯化鋅濃度30mg/mL，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)氯化鋅溶液pH值為2制成)，其多糖和氯化鋅的質(zhì)量比為1: 1，繼續(xù)在40°C下攪拌6h，反應(yīng)期間每隔I小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速8000r/min,每次均質(zhì)Imin,得多糖鋅螯合物溶液；
[0039](5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4，離心得上清液，置于截留分子量IKDa的透析袋中透析2d，把透析袋中的溶液冷凍干燥36h，得夏枯草多糖鋅螯合物。
[0040]夏枯草鋅螯合物的鑒定及理化性質(zhì):(1)稱取樣品于錐形瓶中，加入混合酸1mL (硝酸:高氯酸=4:1)，加蓋消化過夜，在電熱板上消解，再加混合酸直至冒白煙，消化液呈無色透明，將消化液無損失地轉(zhuǎn)移到25mL的容量瓶中，用蒸餾水定容，使用Z - 5000系列原子吸收分光光度計(AAS)，采用鋅標準溶液繪制標準曲線，測得樣品中的鋅含量為10.7mg/g。
[0041](2)樣品的紅外圖譜用Nicolet510紅外光譜儀獲得，取夏枯草多糖和樣品各3mg，分別與干燥KBr混勻，置于紅外干燥箱中充分干燥，研磨后壓片，光譜在400 - 4000cm.1范圍內(nèi)掃描，掃描分辯率為2CHT1，其紅外吸收圖譜如附圖1、2，圖1是夏枯草多糖的紅外光譜圖，圖2是本發(fā)明制備的樣品的紅外光譜圖。通過對比，夏枯草多糖與多糖鋅螯合物的紅外譜圖很相似，表明它們具有相同的基本骨架。夏枯草多糖在3412CHT1和2935CHT1處吸收峰為O - H和C - H的伸縮振動吸收峰，在1147CHT1和1046cnT1處特征吸收峰為C - O伸縮振動吸收峰，1634CHT1處吸收峰峰是δ (OH)彎曲振動吸收峰。但是，與夏枯草多糖相比，多糖鋅螯合物的某些吸收峰有所減弱，在3421CHT1處吸收寬峰減弱變窄，說明O - H鍵減少，同時該吸收峰向高波段移動，說明O - H基團與鋅發(fā)生了配位反應(yīng)，而在1047cm_1處C - O伸縮振動吸收峰也顯著減弱，因此可推斷夏枯草多糖與鋅螯合為C - O - Zn。
[0042](3)理化性質(zhì):稱取3mg樣品溶解在蒸餾水中，不斷調(diào)節(jié)溶液的pH值從4到10，觀察樣品的溶解性和穩(wěn)定性變化，并干燥后測量其鋅含量的變化。結(jié)果表明溶液PH值在4到10范圍內(nèi)，溶液無沉淀發(fā)生，干燥后測得樣品的鋅含量基本不變，因此本發(fā)明的夏枯草多糖鋅螯合物具有較好的溶解性和穩(wěn)定性。
[0043]實施例2
[0044](I)夏枯草原料預(yù)處理:夏枯草原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過60目篩，加入95% (v/v)的乙醇，夏枯草粉與95%乙醇的質(zhì)量比為1:4，溫度90°C，回流時間為6h，離心分離得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作4次，在60°C下干燥36h，即得夏枯草樣品；
[0045](2)多糖提取:加入蒸餾水水熱水浸提，夏枯草樣品與蒸餾水水的質(zhì)量比為1:40，溫度為100°c，時間為6h，離心分離提取液，回流提取5次，合并提取液，在60°C減壓下濃縮到原體積的1/6,得多糖濃縮液；在上述濃縮液中加入Sevag試劑,濃縮液與Sevag試劑(氯仿:正丁醇=6:1)的體積比為5:1，振蕩40min，離心除去變性的蛋白質(zhì)，重復(fù)脫蛋白15次；加入5倍體積的蒸餾水水進行稀釋，采用截留量1KDa的膜片進行超濾，截留液冷凍干燥48h,得夏枯草多 糖； [0046](3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為40mg/mL多糖溶液；
[0047](4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至60°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9，在攪拌下，緩慢逐滴加入高氯酸鋅溶液(高氯酸鋅溶液濃度100mg/mL，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)高氯酸鋅溶液PH值為3制成)，其多糖和氯化鋅的質(zhì)量比為1: 4，繼續(xù)在60°C內(nèi)攪拌24h，反應(yīng)期間每隔2小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速20000r/min，每次均質(zhì)2min，得多糖鋅螯合物溶液；
[0048](5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至5，離心取上清液，置于截留分子量5KDa的透析袋中透析4d，把透析袋中的溶液冷凍干燥48h，得夏枯草多糖鋅螯合物，經(jīng)測定鋅含量為14.5mg/g，其它檢測步驟和結(jié)果基本同實施例1。
[0049]實施例3
[0050](I)夏枯草原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過50目篩，加入95% (v/v)的乙醇，夏枯草粉與95 %乙醇的質(zhì)量比為1:5，溫度75°C，回流時間為6h，離心得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作4次，在50°C下干燥30h，即得夏枯草樣品；
[0051](2)多糖提取:加入蒸餾水水進行熱水浸提，夏枯草樣品與蒸餾水水的質(zhì)量比為1:30，溫度為85°C，時間為4h，離心分離提取液，回流提取3次，合并提取液，在60°C減壓下濃縮到原體積的1/8，得多糖濃縮液；在上述濃縮液中加入Sevag試劑，濃縮液與Sevag試劑(氯仿:正丁醇=4:1)的體積比為6:1，振蕩60min，離心除去變性的蛋白質(zhì)，重復(fù)脫蛋白12次；加入4倍體積的蒸餾水水進行稀釋，采用截留量SKDa的膜片進行超濾，截留液冷凍干燥48h，得夏枯草多糖；
[0052](3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為25mg/mL多糖溶液；
[0053](4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至50°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，在攪拌下，緩慢逐滴加入氯化鋅溶液(醋酸鋅溶液濃度60mg/mL，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)醋酸鋅溶液pH值為2.5制成)，其多糖和氯化鋅的質(zhì)量比為1:3，繼續(xù)在50下內(nèi)攪拌18h，反應(yīng)期間每隔I小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速10000r/min,每次均質(zhì)Imin,得多糖鋅螯合物溶液；
[0054](5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4.5，離心得上清液，置于截留分子量3.5KDa的透析袋中透析3d，把透析袋中的溶液冷凍干燥48h，得夏枯草多糖鋅螯合物，經(jīng)測定鋅含量為13.2mg/g，其它檢測步驟和結(jié)果基本同實施例1。
[0055]實施例4
[0056](I)夏枯草原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過30目篩，加入95% (v/v)的乙醇，夏枯草粉與95%乙醇的質(zhì)量比為1:10，溫度75°C，回流時間為5h，離心分離得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作3次，在45°C下干燥24h，即得夏枯草樣品；
[0057](2)多糖提取:加入蒸餾水水進行熱水浸提，夏枯草樣品與蒸餾水水的質(zhì)量比為1:25，溫度為95°C，時間為3h，離心分離提取液，回流提取5次，合并提取液，在50°C減壓下濃縮到原體積的1/4，得多糖濃縮液；在上述濃縮液中加入Sevag試劑，濃縮液與Sevag試劑(氯仿:正丁醇=5:1)的體積比 為4:1,振蕩45min,離心除去變性的蛋白質(zhì),重復(fù)脫蛋白14次；加入4倍體積的蒸餾水水進行稀釋，采用截留量1KDa的膜片進行超濾，截留液冷凍干燥36h，得夏枯草多糖；
[0058](3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為35mg/mL多糖溶液；
[0059](4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至55°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至9.5，在攪拌下，緩慢逐滴加入氯化鋅溶液(氯化鋅濃度80mg/mL，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)氯化鋅溶液pH值為2制成)，其多糖和氯化鋅的質(zhì)量比為1:2，繼續(xù)在551:下攪拌10h，反應(yīng)期間每隔I小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速15000r/min,每次均質(zhì)1.5min,得多糖鋅螯合物溶液；
[0060](5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物溶液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.0，離心得上清液，置于截留分子量IKDa的透析袋中透析4d，把透析袋中的溶液冷凍干燥48h，得夏枯草多糖鋅螯合物，經(jīng)測定鋅含量為11.5mg/g，其它檢測步驟和結(jié)果基本同實施例1。
[0061]實施例5
[0062]實施例1夏枯草多糖鋅螯合物的抗癌活性實驗
[0063]實驗細胞:人肝癌細胞H印G2，人乳腺癌細胞MCF - 7，人肺癌細胞A549。
[0064]細胞培養(yǎng):將實驗的癌細胞株分散于新鮮培養(yǎng)基中，并接種于培養(yǎng)瓶，置于37°C，5% CO2濃度的培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。新鮮培養(yǎng)基為含有10% (以質(zhì)量百分比計)胎牛血清，100 μ g/mL鏈霉素，100單位/mL青霉素的DMEM培養(yǎng)基。
[0065](I)取對數(shù)生長期的人肝癌細胞H印G2，人乳腺癌細胞MCF - 7，人肺癌細胞A549，吹打制備成單細胞懸液，用血球計數(shù)板計數(shù)后，將細胞濃度調(diào)整約5 X 14個/mL，接種于96孔細胞培養(yǎng)板(10yL/孔)，置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實驗設(shè)調(diào)零組、實驗組和對照組。調(diào)零組為不含100 μ L細胞懸液的空白孔；實驗組為含有100 μ L細胞懸液的孔，實驗時添加含不同樣品濃度的培養(yǎng)基；空白對照組為含100 μ L細胞懸液的孔，實驗時只添加新鮮培養(yǎng)基。平板最外層邊緣加入無菌的PBS溶液，每孔200 μ L0
[0066](2) 24h后，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，往調(diào)零組和對照組加入100 μ L上述新鮮培養(yǎng)液；實驗組分別加入100 μ L不同濃度的樣品(夏枯草多糖和夏枯草多糖鋅螯合物)，所有樣品均由上述新鮮培養(yǎng)基配制；調(diào)零組和空白對照組分別加10yL新鮮培養(yǎng)基，每個不同組分樣品設(shè)平行的5個孔。其中夏枯草多糖為實施例1中步驟(2)中的未與鋅螯合的夏枯草多糖。
[0067](3)繼續(xù)置于37°C、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，每孔均加入10 μ L的MTT溶液(5mg/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后棄去培養(yǎng)基，每孔加100 μ L的DMS0，振蕩器上振蕩lOmin，在酶標儀0D570nm處測量吸光值A(chǔ)，并計算細胞存活率，計算公式如下:
[0068]細胞存活率%=(As - Ao)/(Ac - Ao) X 100
[0069]其中As為實驗組的吸光值，Ac是空白對照組的吸光值，Ao是調(diào)零組的吸光值。
[0070]實驗結(jié)果如表1，與夏枯草多糖相比，夏枯草多糖鋅螯合物對人肝癌細胞IfepG2、人乳腺癌細胞MCF-7和人肺癌細胞A549具有顯著的抑制作用，并且呈劑量依賴型，當夏枯草多糖鋅螯合物濃度為250 μ g/mL時，人肝癌細胞H印G2、人乳腺癌細胞MCF -7和人肺癌細胞A549的存活率分別為1.55 %，1.69 %，42.35 %，而夏枯草多糖作用的癌細胞的存活率分別為73.32%,93.48%,92.35%，通過附圖3也可以進一步看出夏枯草多糖鋅螯合物對癌細胞增殖的抑制效果，流式細胞術(shù)和熒光等方法研究表明夏枯草多糖鋅螯合物能夠誘導(dǎo)細胞凋亡，通過阻滯細胞周期和DNA的復(fù)制，誘導(dǎo) 細胞線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，跨膜電位失調(diào)，弓丨發(fā)了細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)，從而實現(xiàn)抑制腫瘤細胞的增殖。其它實施例中的產(chǎn)品的抗癌作用與實施例1樣品相似。夏枯草多糖指實施例1中的制備的夏枯草多糖；夏枯草多糖鋅螯合物指夏枯草多糖與鋅螯合反應(yīng)后的產(chǎn)物。細胞存活率的計算公式如上，調(diào)零組和空白對照組是存活率計算的基數(shù)，分別為公式中的Ac和Ao，所以只有實驗組的結(jié)果。
[0071]表1
[0072]
【權(quán)利要求】
1.夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于包括以下步驟: (1)原料預(yù)處理:將夏枯草果穗干燥后，粉碎，過篩，加入乙醇加熱回流，夏枯草粉與乙醇的質(zhì)量比為1:3~1:6，溫度60~90°C，回流時間2~6h，離心分離得殘留物，殘留物重復(fù)上述操作2~4次，在45~55°C的鼓風(fēng)干燥箱中干燥24~36h，即得夏枯草粉； (2)多糖提取:夏枯草粉加入蒸餾水水進行熱水浸提，夏枯草粉與蒸餾水的質(zhì)量比為1:20~1:40，提取溫度65~100°C，時間2~6h，離心分離得提取液，回流提取2~5次，合并提取液，在50~60°C下減壓濃縮到原體積的1/4~1/10，得多糖濃縮液；在所述多糖濃縮液中加入Sevag試劑,多糖濃縮液與Sevag試劑的體積比為3:1~6:1,振蕩20~60min,離心處理分離除去蛋白質(zhì)，重復(fù)脫蛋白10~20次；然后加入3~5倍多糖濃縮液體積的蒸餾水進行稀釋，進行超濾，截留分子量大小5~lOKDa，回收截留液，冷凍干燥得夏枯草多糖； (3)將夏枯草多糖溶于蒸餾水水中，配制濃度為10~40mg/mL多糖溶液； (4)將步驟(3)所得多糖溶液加熱至40~60°C，用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至7~10，持續(xù)攪拌下，逐滴加入鋅鹽溶液，其多糖溶液中固形物質(zhì)量和鋅鹽的質(zhì)量比為1:1~1:4，繼續(xù)在40~60°C下攪拌6~24h， 反應(yīng)期間每隔I~2小時用高剪切均質(zhì)機進行處理一次，均質(zhì)轉(zhuǎn)速8000~20000r/min,每次均質(zhì)I~2min,得夏枯草多糖鋅螯合物混合液；所述鋅鹽為氯化鋅、高氯酸鋅和醋酸鋅中的一種； (5)把步驟(4)制得的夏枯草多糖鋅螯合物混合液，用鹽酸調(diào)節(jié)pH至4~5，離心取上清液，置于透析袋中進行透析，將透析袋中的溶液凍干，即得夏枯草多糖鋅螯合物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述乙醇的體積百分比為95% ;所述過篩為過30~60目篩。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述的Sevag試劑為氯仿與正丁醇的混合溶液，其體積比3:1~6:1。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)和(2)離心分離的離心力為4000~lOOOOg，離心時間為10~15min ;步驟(5)中離心力為4000~lOOOOg，離心時間為2~5min。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述冷凍干燥是在-60±5°C，0.08~0.1MPa真空度下干燥干燥36~48h，干燥后的樣品中水分的質(zhì)量百分含量低于4%。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述鋅鹽溶液的濃度為30~100mg/mL，將鋅鹽加入蒸餾水中，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)鋅鹽溶液pH值為2~3制成。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述氫氧化鈉和鹽酸溶液的質(zhì)量濃度均為3~5%。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的夏枯草多糖鋅螯合物的制備方法，其特征在于，所述透析的時間為2~4d，透析袋截留的分子量為I~5KDa。
9.一種夏枯草多糖鋅螯合物，其特征在于其由權(quán)利要求1~8任一項所述制備方法制得。
10.權(quán)利要求9所述夏枯草多糖鋅螯合物在制備抗癌藥物和保健品中的應(yīng)用。
【文檔編號】A23L1/09GK104031156SQ201410220342
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年5月22日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月22日
【發(fā)明者】扶雄, 李超, 趙振綱, 黃強, 游麗君, 劉瑞海 申請人:華南理工大學(xué), 廣州粵糖食品科技有限公司