一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，公開了一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法。本發(fā)明所述方法將保存在固體培養(yǎng)基上的葡糖醋桿菌用液體培養(yǎng)基依次進(jìn)行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉(zhuǎn)接到新鮮的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)纖維素培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)容器內(nèi)設(shè)置篩網(wǎng)。本發(fā)明針對葡糖醋桿菌在培養(yǎng)時易出現(xiàn)負(fù)變異菌株的問題，通過安裝篩網(wǎng)這種簡便的方式，讓菌體產(chǎn)生纖維素時，可附著于篩網(wǎng)上，既避免了負(fù)變異菌株的出現(xiàn)，同時又提高了纖維素產(chǎn)量，能夠廣泛應(yīng)用于葡糖醋桿菌的培養(yǎng)中。
【專利說明】一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本 發(fā)明涉及微生物培養(yǎng)【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]葡糖醋桿菌屬(Gluconacetobacter),原是醋桿菌屬下(Acetobacter)的葡糖醋桿菌亞屬，該亞屬于1997年被Yamada等人在16S rRNA序列分析和泛醌類型研究基礎(chǔ)上，提升為葡糖醋桿菌屬。該屬下目前有16個種，其中7個種能產(chǎn)生纖維素，分別 為 Ga.europaeus, Ga.1ntermedius, Ga.hansenii, Ga.xylinus, Ga.swingsii, Ga.rhaeticus, Ga.nataicola, Ga.kombuchae。在以前的文獻(xiàn)及現(xiàn)在的一些文獻(xiàn)中所提及的木醋桿菌(Acetobacter xyIinum)就等同于 Ga.xylinus (或 G.xylinus)。
[0003]葡糖醋桿菌產(chǎn)生的纖維素又稱為細(xì)菌纖維素(Bacterial cellulose，BC)，因其純度、結(jié)晶度、持水力、楊氏模量高及生物相容性好等獨(dú)特性能，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、造紙、音響等領(lǐng)域。
[0004]常用的培養(yǎng)葡糖醋桿菌有3種方式:淺盤靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、氣升式培養(yǎng)。
[0005]淺盤靜置方式培養(yǎng)時，在收獲BC前不宜觸動，否則氣/液界面很難成膜，這使發(fā)酵過程中的氧氣濃度、PH維持及營養(yǎng)成分的補(bǔ)充都無法實(shí)現(xiàn)，從而降低了生產(chǎn)效率。但當(dāng)裝液量大時，易出現(xiàn)負(fù)變異菌株，導(dǎo)致BC產(chǎn)量降低。
[0006]振蕩培養(yǎng)時，發(fā)酵過程中的氧氣濃度、pH維持及營養(yǎng)成分都便于控制，因此，得以廣泛研究，但振蕩培養(yǎng)時的最大的缺點(diǎn)是在剪切力的作用下，葡糖醋桿菌易出現(xiàn)不產(chǎn)BC的負(fù)變異菌株，從而降低了 BC的產(chǎn)量。
[0007]氣升式培養(yǎng)時，發(fā)酵過程中的氧氣濃度、pH維持及營養(yǎng)成分的補(bǔ)充便于控制，但其缺點(diǎn)是在氣體沖擊下，菌體運(yùn)動加劇，易出現(xiàn)負(fù)變異菌株，導(dǎo)致BC產(chǎn)量下降。
[0008]可以看出，現(xiàn)有的常規(guī)培養(yǎng)方法都會出現(xiàn)負(fù)變異菌株，導(dǎo)致BC產(chǎn)量的降低。因此，需要提供一種簡便的培養(yǎng)方法來解決此問題，提高生產(chǎn)效率。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0009]有鑒于此，本發(fā)明的目的在于提供一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法，使得所述方法能夠顯著提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量；
[0010]本發(fā)明的另一個目的在于提供一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法，使得所述方法能夠完全避免負(fù)變異菌株的產(chǎn)生。
[0011]為實(shí)現(xiàn)以上發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案:
[0012]一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法，將保存在固體培養(yǎng)基上的葡糖醋桿菌用液體培養(yǎng)基依次進(jìn)行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉(zhuǎn)接到新鮮的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)纖維素培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)容器內(nèi)設(shè)置篩網(wǎng)。
[0013]針對現(xiàn)有的常規(guī)培養(yǎng)方式易產(chǎn)生負(fù)變異菌株，導(dǎo)致細(xì)菌纖維素產(chǎn)量不高的缺陷，本發(fā)明采用在培養(yǎng)容器中設(shè)置篩網(wǎng)的簡便方式，避免負(fù)變異菌株的產(chǎn)生，提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。
[0014]本發(fā)明所述方法中菌種活化、種子液制備以及所采用的培養(yǎng)基可按照本領(lǐng)域常規(guī)方法進(jìn)行相關(guān)操作。作為優(yōu)選，本發(fā)明菌種活化、種子液制備具體為:
[0015]固體培養(yǎng)基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HPO4^0.115g檸檬酸，2g瓊脂，12rC，15min滅菌，適用于菌種保存；
[0016]液體培養(yǎng)基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HP04、0.115g檸檬酸，121 °C, 15min滅菌,適用于靜置培養(yǎng)；
[0017]液體培養(yǎng)基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27g Na2HP04、0.115g檸檬酸，Ig乙醇，121 °C, 15min滅菌,適用于氣升式培養(yǎng)和振蕩培養(yǎng)；
[0018]液體培養(yǎng)基(IOOmL):自然發(fā)酵椰子水20_99mL、4g白砂糖、0.3g(NH4)2S04、0.1gKH2P04、0.05g MgSO4, pH4.5，105°C,15min消毒，適用于振蕩培養(yǎng)結(jié)合氣升式培養(yǎng)；
[0019]挑取固體培養(yǎng)基上的葡糖醋桿菌于50mL液體培養(yǎng)基中進(jìn)行菌種活化，30°C靜置培養(yǎng)4d ;菌種活化液按5% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL液體培養(yǎng)基，30°C靜置培養(yǎng)4d，制備種子液。
[0020]作為優(yōu)選，所述培養(yǎng)為靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、氣升式培養(yǎng)或振蕩培養(yǎng)結(jié)合氣升式培養(yǎng)。進(jìn)一步優(yōu)選地，所述靜置培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為30°C，所述振蕩培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn)速120rpm，所述氣升式培養(yǎng)培養(yǎng)溫度為30°C，通氣率為2.5L/min，所述振蕩培養(yǎng)結(jié)合氣升式培養(yǎng)的培養(yǎng)溫度為30°C，轉(zhuǎn) 速120rpm，通氣率為2.5L/min。
[0021]作為優(yōu)選，所述種子液接種量為5%,即每IOOmL中接種5mL種子液。
[0022]作為優(yōu)選，所述設(shè)置篩網(wǎng)的方式具體為:
[0023]設(shè)置2個或2個以上第一篩網(wǎng)，所述各第一篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次排布，各第一篩網(wǎng)之間相距3-8cm，各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm，示意圖見圖1 ;
[0024]或，
[0025]設(shè)置2個或2個以上第二篩網(wǎng)，所述各第二篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，各第二篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，第二篩網(wǎng)至少高于液面
0.5cm,第二篩網(wǎng)距容器底面為Ocm,不意圖見圖2 ；
[0026]或，
[0027]設(shè)置2個或2個以上第三篩網(wǎng)，所述各第三篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，在所述各第三篩網(wǎng)橫截面上設(shè)置有2個或2個以上的第四篩網(wǎng)，所述各第四篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次排布，各第四篩網(wǎng)之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm ;各第三篩網(wǎng)和第四篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，所述第三篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm，第三篩網(wǎng)距容器底面為Ocm,示意圖見圖3。
[0028]本發(fā)明所舉示意圖只是為了便于理解篩網(wǎng)設(shè)置方式，并不對其形狀、數(shù)量、高度等起限定作用，其中篩網(wǎng)數(shù)量可根據(jù)容器的體積合理設(shè)置，本發(fā)明示意圖均以2個為例。
[0029]更優(yōu)選地，所述設(shè)置篩網(wǎng)的方式具體為:
[0030]設(shè)置2個第一篩網(wǎng)，所述2個第一篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網(wǎng)的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網(wǎng)之間相距3-8cm，各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm，示意圖見圖1 ;
[0031]或，
[0032]設(shè)置2個第二篩網(wǎng)，所述2個第二篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，所述2個第二篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，第二篩網(wǎng)至少高于液面
0.5cm,第二篩網(wǎng)距容器底面為Ocm,不意圖見圖2 ；
[0033]或，
[0034]設(shè)置2個第三篩網(wǎng)，所述2個第三篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，在所述2個第三篩網(wǎng)橫截面上設(shè)置有2個第四篩網(wǎng)，所述2個第四篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第四篩網(wǎng)的中心位于同一豎直軸線上，各第四篩網(wǎng)之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm ;各第三篩網(wǎng)和第四篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離≤1cm，所述第三篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm，第三篩網(wǎng)距容器底面為0cm，示意圖見圖3。
[0035]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述篩網(wǎng)為不銹鋼篩網(wǎng)、塑料篩網(wǎng)、棉布篩網(wǎng)、陶瓷篩網(wǎng)或硅膠篩網(wǎng)。
[0036]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述篩網(wǎng)網(wǎng)格大小≤18目。
[0037]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述篩網(wǎng)網(wǎng)格形狀為方形或圓形。
[0038]作為優(yōu)選，本發(fā)明所述篩網(wǎng)為圓形或矩形。
[0039]在本發(fā)明所述方法和未安裝篩網(wǎng)的常規(guī)培養(yǎng)方法的對比試驗(yàn)中，保證其他所有培養(yǎng)條件一致，僅存在設(shè)置篩網(wǎng)和未設(shè)置篩網(wǎng)的區(qū)別，結(jié)果顯示，本發(fā)明所述方法在培養(yǎng)過程中，負(fù)變異率為0，而對照的方法負(fù)變異率在28-60%，細(xì)菌纖維素產(chǎn)量也得到顯著提高。
[0040]由以上技術(shù)方案可知，本發(fā)明針對葡糖醋桿菌在培養(yǎng)時易出現(xiàn)負(fù)變異菌株的問題，通過安裝篩網(wǎng)這種簡便的方式，讓菌體產(chǎn)生纖維素時，可附著于篩網(wǎng)上，既避免了負(fù)變異菌株的出現(xiàn)，同時又提高了纖維素產(chǎn)量，能夠廣泛應(yīng)用于葡糖醋桿菌的培養(yǎng)中。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1所示為本發(fā)明篩網(wǎng)設(shè)置方式示意圖；其中h即表示頂層第一篩網(wǎng)距液面的距離，也表示各第一篩網(wǎng)之間的距離，d表示各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁的距離；
[0042]圖2所示為本發(fā)明篩網(wǎng)設(shè)置方式示意圖；其中，h表示第二篩網(wǎng)高于液面的高度，d表示各第二篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁的距離；
[0043]圖3所示為本發(fā)明篩網(wǎng)設(shè)置方式示意圖；其中，h表示第三篩網(wǎng)高于液面的高度，d表示各第三篩網(wǎng)和第四篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁的距離；
[0044]圖4所示為負(fù)變異菌株和正常菌株的對比圖，其中箭頭所指為負(fù)變異菌株?！揪唧w實(shí)施方式】
[0045]本發(fā)明公開了一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以借鑒本文內(nèi)容，適當(dāng)改進(jìn)工藝參數(shù)實(shí)現(xiàn)。特別需要指出的是，所有類似的替換和改動對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是顯而易見的，它們都 被視為包括在本發(fā)明。本發(fā)明所述方法已經(jīng)通過較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述，相關(guān)人員明顯能在不脫離本
【發(fā)明內(nèi)容】
、精神和范圍內(nèi)對本文所述的方法和應(yīng)用進(jìn)行改動或適當(dāng)變更與組合，來實(shí)現(xiàn)和應(yīng)用本發(fā)明技術(shù)。
[0046]以下就本發(fā)明所提供的一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法做進(jìn)一步說明。
[0047]實(shí)施例1:靜置培養(yǎng)
[0048]液體液體培養(yǎng)基(IOOmL):2g葡萄糖、0.5g酵母膏、0.5g蛋白胨、0.27gNa2HP04、
0.115g 朽1 樣酸，121 °C，15min 滅菌。
[0049]菌種活化:挑取固體培養(yǎng)基上的葡糖醋桿菌于50mL種子培養(yǎng)液中，30°C靜置培養(yǎng)4d。
[0050]種子液制備:菌種活化液按5% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于IOOmL液體培養(yǎng)液，30°C靜置培養(yǎng)4d。
[0051]靜置培養(yǎng)生產(chǎn):種子液按5% (v/v)的接種量轉(zhuǎn)接于800mL液體培養(yǎng)液，30°C，4d，以不安裝篩網(wǎng)作對照，每個實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0052]此處采用的篩網(wǎng)結(jié)構(gòu)如圖1所示，具體設(shè)置方式如下描述: [0053]設(shè)置2個第一篩網(wǎng)，所述2個第一篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網(wǎng)的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網(wǎng)之間相距3-8cm(3次重復(fù)試驗(yàn)分別為3Cm、5Cm、8Cm)， 各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< lcm(3次重復(fù)試驗(yàn)分別為1cm、
0.5cm、0.2cm),位于頂層的第一篩網(wǎng)距液面距離為3_8cm(3次重復(fù)試驗(yàn)分別為3cm、5cm、8cm),位于底層的第一篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm(3次重復(fù)試驗(yàn)分別為3cm、5cm、8cm)。
[0054]分析方法:
[0055]纖維素產(chǎn)量分析:篩網(wǎng)上的纖維素用鑷子剝?nèi)?，沒有篩網(wǎng)中的纖維素通過16層紗布過濾后獲取，置于80°C，0.lmol/L NaOH溶液中，維持2h，冷卻后用0.lmol/L HCl中和、自來水充分洗滌，在80°C下干燥至恒重，稱重。
[0056]負(fù)變異株率:將種子液取lmL，加入9mL無菌0.85%生理鹽水，稀釋至一定濃度，取
0.1mL稀釋液涂布于固體平板上，置于30°C靜置培養(yǎng)6d，計(jì)數(shù)，負(fù)變異率=負(fù)變異株菌落數(shù)/總菌落數(shù)(以百分率表示)。負(fù)變異株呈現(xiàn)個體變大、粘稠狀(見圖4箭頭所指菌株)，與野生型菌株的菌落形態(tài)明顯不同。
[0057]結(jié)果如表1所示。
[0058]表1篩網(wǎng)對葡糖醋桿菌靜置培養(yǎng)中負(fù)變異率的控制及BC產(chǎn)量的影響
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種培養(yǎng)葡糖醋桿菌的方法，其特征在于，將保存在固體培養(yǎng)基上的葡糖醋桿菌用液體培養(yǎng)基依次進(jìn)行菌種活化、種子液制備，然后種子液轉(zhuǎn)接到新鮮的液體培養(yǎng)基中進(jìn)行產(chǎn)纖維素培養(yǎng)，同時在培養(yǎng)容器內(nèi)設(shè)置篩網(wǎng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述產(chǎn)纖維素培養(yǎng)為靜置培養(yǎng)、振蕩培養(yǎng)、氣升式培養(yǎng)或振蕩結(jié)合氣升式培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述方法，其特征在于，所述設(shè)置篩網(wǎng)的方式具體為: 設(shè)置2個或2個以上第一篩網(wǎng)，所述各第一篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次排布，各第一篩網(wǎng)之間相距3-8cm，各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm ； 或， 設(shè)置2個或2個以上第二篩網(wǎng)，所述各第二篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，各第二篩網(wǎng)側(cè) 邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，第二篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm，第二篩網(wǎng)距容器底面為Ocm ； 或， 設(shè)置2個或2個以上第三篩網(wǎng)，所述各第三篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互交叉于其豎直軸心線上，在所述各第三篩網(wǎng)橫截面上設(shè)置有2個或2個以上的第四篩網(wǎng)，所述各第四篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次排布，各第四篩網(wǎng)之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm ;各第三篩網(wǎng)和第四篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，所述第三篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm，第三篩網(wǎng)距容器底面為0cm。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述方法，其特征在于，所述設(shè)置篩網(wǎng)的方式具體為: 設(shè)置2個第一篩網(wǎng)，所述2個第一篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第一篩網(wǎng)的中心位于同一豎直軸線上，各第一篩網(wǎng)之間相距3-8cm，各第一篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，位于頂層的第一篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第一篩網(wǎng)距容器底面為3_8cm ； 或， 設(shè)置2個第二篩網(wǎng)，所述2個第二篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，所述2個第二篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離< 1cm，第二篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm,第二篩網(wǎng)距容器底面為Ocm ； 或， 設(shè)置2個第三篩網(wǎng)，所述2個第三篩網(wǎng)沿豎直方向延伸并相互垂直交叉于其豎直軸心線上，在所述2個第三篩網(wǎng)橫截面上設(shè)置有2個第四篩網(wǎng)，所述2個第四篩網(wǎng)相互平行且沿豎直方向依次均布，所述2個第四篩網(wǎng)的中心位于同一豎直軸線上，各第四篩網(wǎng)之間相距3-8cm，位于頂層的第四篩網(wǎng)距液面距離為3-8cm，位于底層的第四篩網(wǎng)距容器底面為3-8cm ;各第三篩網(wǎng)和第四篩網(wǎng)側(cè)邊緣距容器內(nèi)側(cè)壁距離≤1cm，所述第三篩網(wǎng)至少高于液面0.5cm,第三篩網(wǎng)距容器底面為0cm。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述篩網(wǎng)為不銹鋼篩網(wǎng)、塑料篩網(wǎng)、棉布篩網(wǎng)、陶瓷篩網(wǎng)或硅膠篩網(wǎng)。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述篩網(wǎng)網(wǎng)格大小>18目。
7.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述篩網(wǎng)網(wǎng)格形狀為方形或圓形。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-4任意一項(xiàng)所述方法，其特征在于，所述篩網(wǎng)為圓形或矩形。
【文檔編號】C12R1/01GK103966140SQ201410208851
【公開日】2014年8月6日 申請日期:2014年5月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月16日
【發(fā)明者】王志國, 王錫彬 申請人:海南大學(xué)