惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量pcr檢測試劑盒及核苷酸序列的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列，設計了惡性瘧原蟲特異的引物和探針，優(yōu)化了實時熒光PCR檢測體系；針對惡性瘧原蟲的一對引物，結合普通PCR技術和分子克隆技術，構建了惡性瘧原蟲質粒標準品，建立了目的基因拷貝數與熒光檢測信號之間關系的標準曲線，實現了惡性瘧原蟲的實時熒光定量檢測。本試劑盒將納米磁微粒分離瘧原蟲核酸技術與實時熒光定量PCR技術有機結合，在標本核酸提取方面具有操作方便、價廉、快捷、高效的特點，尤其在濾紙干血片核酸提取和提取微量全血核酸方面具有很大優(yōu)勢，實現了擴大檢測范圍、最大程度降低漏檢率的目標，本試劑盒的檢測限為25copies/μL。
【專利說明】惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于檢驗檢疫領域，但不限于該領域，涉及檢測臨床樣品中惡性瘧原蟲，是一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及核苷酸序列。
【背景技術】
[0002]瘧疾是對人類健康危害最嚴重的傳染病之一，瘧疾病例中有86%發(fā)生在非洲地區(qū)，非洲以外地區(qū)的瘧疾病例80%集中在印度、蘇丹、緬甸、孟加拉、印度尼西亞、巴布亞新幾內亞和巴基斯坦等國。非洲以惡性瘧為主，間日瘧分布最廣，遍及熱帶、亞熱帶、溫帶的國家和地區(qū)，以中美洲和東南亞為多見。[0003]我國自2000年以來瘧疾疫情出現回升，其中云南、海南兩省較為嚴重，許多省受到輸入性惡性瘧的威脅，尤其是境外輸入性惡性瘧的威脅。隨著經濟全球化和國際交往的增多，近年來勞務輸出人數逐年增加，輸入性瘧疾病例逐年增多，呈逐年上升趨勢。輸入性病例大多源于非洲、緬甸等惡性瘧高發(fā)區(qū)勞務輸出的歸國人員，2008年我國瘧疾死亡病例全部為境外勞務回國人員，2009年有21個省(市、區(qū))有輸入性惡性瘧病例報告，且瘧疾死亡也全部為輸入病例。因此,關注瘧疾疫情,特別是境外輸入性惡性瘧疫情十分重要。
[0004]2009年全國報告惡性瘧1027例，占瘧疾總報告病例數的7.4%。其中，當地感染的惡性瘧130例，占惡性瘧報告病例數的12.7%，輸入性惡性瘧病例897例，占惡性瘧報告病例數的87.3%。2010年全年報告惡性瘧1258例，占瘧疾總報告病例數的16.0%，其中報告當地感染的惡性瘧97例，占惡性瘧報告病例數的7.7%，報告輸入性惡性瘧1161例，占惡性瘧報告病例數的92.3%，較上年上升29.4%。輸入性惡性瘧最主要的感染地為東南亞地區(qū)和非洲。東南亞有緬甸、柬埔寨、巴基斯坦、印度、印度尼西亞、馬來西亞等國家。非洲地區(qū)有尼日利亞、安哥拉、馬里、加納、幾內亞、赤道幾內亞、剛果、利比里亞、利比亞、馬拉維、多哥、喀麥隆、莫桑比克、科特迪瓦、南非和肯尼亞等國家，其中東南亞的緬甸，非洲地區(qū)的尼日利亞、安哥拉、幾內亞、赤道幾內亞，是我國輸入性惡性瘧最多的國家。
[0005]惡性瘧來勢兇險，臨床表現復雜多變，熱型不規(guī)則，起病方式各異，有的表現為呼吸道感染，有的表現為消化道感染，有的表現為急腹癥。并且惡性瘧可隨時出現嚴重并發(fā)癥，如腦型瘧、急性血管內溶血(亦稱黑尿熱)等，容易引起誤診，若不及時救治，可出現意識障礙、昏迷、偏癱、腎功能衰竭、呼吸衰竭而死亡，病死率可達22% -50%，甚至高達70%。因此，惡性瘧的早期診斷對于及早實施有效的治療方案，減少重癥病例及死亡病例、防范“二代”病例的發(fā)生十分重要。
[0006]發(fā)熱病人血檢是全世界公認的和推行的發(fā)現傳染源唯一可靠可行的辦法，在瘧疾檢測中占有很重要的地位。鏡檢仍是診斷瘧疾的金標準，但其敏感性低，費時費力，漏檢率高，還需要有相當經驗的檢驗人員才能做到正確診斷，尤其是在低原蟲血癥、混合感染，以及需要大樣本人群現場檢測時，臨床應用受到許多限制。因此，迫切需要研制出新的敏感、特異、快速、方便的惡性瘧診斷技術。[0007]實時熒光定量PCR技術與傳統(tǒng)的PCR技術相比具有特異性和敏感性更強、自動化程度更高以及污染可能性更小等優(yōu)點。
[0008]TaqMan實時熒光定量PCR技術依據目的基因設計合成了一條能夠與之特異性雜交的探針，探針結合位置位于上下游引物之間，當擴增延伸到探針結合的位置時，Taq酶利用5’ 一 3’外切酶活性，將探針5’端連接的熒光基團從探針上解離下來，破壞了兩個熒光基團之間的突光共振能量轉移(fluorescenceresonance energytransfer, FRET),而發(fā)出熒光，解離下來的熒光分子數與PCR產物的數量成正比，因此根據反應體系中的熒光強度即可計算初始模板的數量。
[0009]惡性瘧原蟲的實時熒光定量PCR檢測，包括兩大步驟，首先是從標本中將惡性瘧原蟲核酸提取出來，然后再用實時熒光定量PCR技術對目的基因進行檢測。瘧原蟲的裂殖子進入紅細胞內發(fā)育增殖，被感染的紅細胞最終被脹破，裂殖子、瘧色素和其他代謝產物一起進入血流，引起一次臨床發(fā)病。瘧原蟲檢測標本,通常有兩種,全血標本和濾紙干血片標本，后者由于便于現場采集、保存和運輸，可以滿足現場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、特殊情況下(如在口岸現場)采樣或在邊遠地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用。
[0010]傳統(tǒng)的瘧原蟲核酸分離方法，有水煮法、酚氯仿抽提法等。水煮法提取核酸有幾種方式，一種是先用生理鹽水或用雙蒸水洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用磷酸鹽緩沖液洗滌，然后用雙蒸水煮沸裂解；一種是先用皂素溶液裂解，然后用TriS-HCl溶液高溫裂解。水煮法簡捷、經濟，但是核酸得率低、純度低，不利于核酸的長期保存，并且核酸提取物中含有抑制核酸擴增反應的血紅蛋白等物質，影響瘧原蟲檢出率；商品化試劑盒提取核酸得率較高，在核酸擴增時受到的影響因素較少，但是試劑盒價格昂貴，不適合現場大量使用和邊遠窮困地區(qū)使用。
[0011]其它瘧原蟲核酸提取法有碘化鈉法、酚氯仿抽提法等，這些方法耗時長、使用有毒試劑，對人體有害，污染環(huán)境，不適用于常規(guī)檢測。
[0012]本發(fā)明的納米磁分離瘧原蟲核酸提取法，可用于提取微量全血和濾紙干血片標本，利用經修飾的納米磁微?？梢愿咝Ц患怂崽匦?，可獲得高純度的核酸模板，具有操作方便、快捷、高效，尤其在低水平瘧原蟲標本核酸提取時此納米磁微粒高效捕獲核酸特性，可以大大提聞痕原蟲的檢出率。
[0013]納米磁微粒(MNP)是一種優(yōu)良的磁性分離介質，具有比表面積大，磁響應性強，可應用于生物大分子(如蛋白質、核酸等)的快速分離提取，尤其是其表面進行化學修飾或高分子化合物包裹后，分離提取效率可大為提高，并可實現自動化操作，成本也大為降低，具有廣闊的應用前景。
【發(fā)明內容】
[0014]本發(fā)明的目的在于克服現有技術的不足之處，提供一種快速高效、靈敏度高、特異性好、操作方便、價格低廉的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒。
[0015]本發(fā)明還提供一種與該特異性強、靈敏度高的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測相關的核苷酸序列。
[0016]本發(fā)明實現目的的技術方案如下:
[0017]一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標本稀釋液、裂解液、結合液、洗液、洗脫液、實時熒光PCR反應液、質粒標準品、陽性對照、陰性對照；
[0018]所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液；
[0019]所述標本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； [0020]所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液；
[0021]所述結合液為無水乙醇；
[0022]所述洗液為70%乙醇；
[0023]所述洗脫液為ΤΕρΗ8.0 ；
[0024]所述實時熒光PCR反應液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ；
[0025]所述的質粒標準品為含有惡性瘧原蟲基因片段⑶的質粒；
[0026]所述的陽性對照為惡性瘧原蟲質粒標準品；
[0027]所述的陰性對照為正常人全血核酸提取液。
[0028]而且，瘧疾疑似病例全血標本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或-20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用。
[0029]而且，所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標本和濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下:
[0030]所述納米磁微粒MNP分離提取全血標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0031]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標本50 μ L，標本量不足50 μ L時,用標本稀釋液補足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0032](2)加入200 μ L結合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0033]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0034]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0035]而且，所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為:
[0036]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0037](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0038]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0039]⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0040]一組惡性瘧原蟲實時熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
[0041]而且，所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
[0042]本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果如下:
[0043]1、本試劑盒將納米磁分離提取全血標本和濾紙干血片標本核酸技術與實時熒光定量PCR技術進行有機結合，在標本核酸提取方面具有操作方便、快捷、價廉、高效的特點，尤其在提取微量瘧原蟲核酸方面具有很大優(yōu)勢，實現了最大程度降低漏檢率的目標，本試劑盒的檢測限可以達到25copies/ μ L。
[0044]2、本發(fā)明首次采取了納米磁微粒分離提取全血標本和全血濾紙干血片標本瘧原蟲核酸的方法，可以最大程度地減少提取過程中瘧原蟲核酸的損失，快速高效地分離純化全血標本和濾紙干血片標本中的惡性瘧原蟲DNA，再通過自主設計的實時熒光PCR檢測體系對惡性瘧原蟲進行檢測，通過構建質粒標準品，建立實時熒光PCR標準曲線，實現對惡性瘧原蟲的定量檢測。
[0045]3、本發(fā)明選取惡性痕原蟲(Plasmodium falciparum)基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設計特異性引物及熒光探針進行靶序列擴增，擴增片段長度為162bp。標本模板進行實時熒光PCR擴增，再利用質粒標準品構建的標準曲線，定量推算標本中的惡性瘧原蟲DNA水平。實例檢測結果表明，本發(fā)明的方法可用于惡性瘧原蟲感染的診斷及其惡性瘧原蟲型別的鑒定。
[0046]4、本發(fā)明中瘧原蟲濾紙干血片標本由于現場采集、保存和運輸方便，可以滿足現場人群大規(guī)模篩查瘧疾采樣、或在邊遠地區(qū)采樣的需要，被廣泛采用，但是，從濾紙干血片中提取瘧原蟲核酸的方法多采用傳統(tǒng)方法(水煮法、酚氯仿抽提法等)或者商品試劑盒法，前者核酸得率低、純度低，提取液中含有抑制核酸擴增反應的抑制物，降低了瘧原蟲的檢出率，后者價格昂貴，不適合現場大量使用和邊遠窮困地區(qū)使用。本發(fā)明提取瘧原蟲核酸，操作簡單、快捷，價廉，核酸純度高，經表面修飾的納米磁微?？筛咝Р东@核酸，大大提高了瘧原蟲的檢出率。
[0047]5、本發(fā)明應用納米磁微粒分離提取全血標本和濾紙干血片標本瘧原蟲核酸和實時熒光定量PCR方法，解決了短時間內快速高效提取瘧原蟲核酸并對其準確定量檢測的方法學問題，實驗結果顯示，根據本發(fā)明方法生產的產品靈敏度達到25c0pies/y I。惡性瘧原蟲完成一代紅內期裂體增殖的時間不規(guī)則，一般為36-48小時。惡性瘧原蟲早期滋養(yǎng)體在血液中發(fā)育，逐漸隱匿在微血管等處，繼發(fā)成晚期滋養(yǎng)體和裂殖體，一般在外周血液中不易見到。惡性瘧原蟲在發(fā)作期易于檢測到陽性結果，在其它期陽性率較低。瘧疾初發(fā)時原蟲血癥較低，需在48-72小時內反復涂血片鏡檢，必要時做骨髓涂片，以提高陽性率。由于瘧原蟲耐藥株的產生以及不規(guī)范治療等因素的影響，常會出現外周血瘧原蟲感染密度低或原蟲形態(tài)不典型的情況，一定程度上影響了血液鏡檢陽性率和蟲種的有效鑒定。2008年四川省瘧疾實驗室診斷的占65.7%，其余為臨床診斷，而實驗室診斷中有18.1%未進行瘧原蟲分型。2009年全 國30個省(市、區(qū))共報告瘧疾病例數14140例，其中間日瘧占75.6%，惡性瘧占7.4 %，未分型瘧占17.0 %。2011年全國實驗室未確診病例比例^ 18.3% (821/4479)，其中共7個省(市、區(qū))報告的實驗室未確診病例的比例高于25%。本發(fā)明提供的試劑盒可以敏感地檢測出惡性瘧原蟲感染初期病例或外周血惡性瘧原蟲密度低的感染者，可以為低水平惡性瘧原蟲的感染提供快速確診。
[0048]6、本試劑盒在開發(fā)過程中參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，設計得到了熒光定量PCR引物與探針，并應用于惡性瘧原蟲檢測和定量分析，減少和避免了檢測結果的假陰性或假陽性，提高了檢測方法的準確性，同時該探針對惡性瘧原蟲種特異性非常好，如果確定陽性，可以確診是惡性瘧，使治療更有針對性，根治更加徹底，防止復發(fā)；使用本試劑盒在入境歸國人員中檢測到極低水平的惡性瘧原蟲感染者，檢測靈敏度非常高。
【專利附圖】
【附圖說明】:
[0049]圖1顯示的是標準曲線，質粒標準品拷貝數在2.5 X 10L2.5 X IO8Copies/μ L時，Ct值范圍是11.91-36.45，質粒拷貝數的對數值與Ct值之間呈現良好的對數線性關系。實時熒光定量PCR反應體系標準曲線斜率為-3.43，截距為40.93，R2 = 0.999。 [0050]圖2顯示強、中、弱三個陽性標本實時熒光PCR擴增曲線；三個標本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經標準曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為，8.46 X IO5Copies/μ L、2.00X 103copies/y L,30copies/y L ;反應曲線為典型的實時熒光PCR擴增曲線，均能夠判定為陽性。
[0051]圖3顯示方法特異性曲線，從熒光擴增曲線上可以看到，惡性瘧原蟲出現了明顯的擴增曲線，Ct值為25.30，而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對照的擴增曲線均沒有上升。
[0052]圖4顯示13份從非洲高疫區(qū)回國的入境人員標本檢測曲線，其中1份標本Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經復測最終判斷為惡性瘧原蟲陽性。
【具體實施方式】
[0053]下面結合實施例，對本發(fā)明進一步說明，下述實施例是說明性的，不是限定性的，不能以下述實施例來限定本發(fā)明的保護范圍。
[0054]本實施例使用的所有溶劑及試劑均為市售成品，引物及探針為委托基因公司合成，納米磁微粒由北京出入境檢驗檢疫局、國家納米科學中心聯合研制。
[0055]本發(fā)明除了采用納米磁微粒分離瘧原蟲DNA以外，還可以采用常規(guī)技術分離瘧原蟲DNA，然后根據本發(fā)明提供的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(Pl)來檢測惡性瘧原蟲，具體方法為本領域常規(guī)分離瘧原蟲DNA的方法，不再贅述。但是，在惡性瘧原蟲密度較低時，使用常規(guī)技術分離惡性瘧原蟲，漏檢率會增高。
[0056]本發(fā)明關于實時熒光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測臨床樣品中惡性瘧原蟲的試劑盒，該試劑盒組成包括:(I)分別裝納米磁分離核酸體系、水(超純水)、實時熒光PCR反應體系、陰性對照、陽性對照和質粒標準品并加蓋密封的多個試劑瓶或離心管；(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或離心管的包裝盒。
[0057]本發(fā)明中涉及的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測的核苷酸序列，包括實時熒光PCR檢測的上游引物(Fl)、下游引物(Rl)和熒光探針(P1)，以及質粒標準品序列(S)，其具體序列如下:
[0058]Fl:5’ -TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTA-3’
[0059]Rl:5’ -GAACTCAATCATGACTACCCGTCTGT-3’
[0060]Pl:5’ -TCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGT-3’，
[0061]其中探針的5’端標記報告熒光基團FAM，3’端標記淬滅熒光基團TAMRA，或其他配對的熒光標記均可。
[0062]質粒標準品序列⑶如下:
[0063]TTGCTTTGTTCAAAATAAGGTTTTCTAATAAATTATGTTTTTATCAGATATGACAGAATCTTTTTTAAAATCTCTTCAATATGCTTTTATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTACTTTGAGTAAAATTAAGTGTTCATAACAGACGGGTAGTCATGATTGAGTTC。
[0064]本發(fā)明提供的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，組成如下:
[0065]所述納米磁微粒(簡稱MNP)為表面修飾的納米磁性粒子，其制備過程為:首先利用熱分解法分解乙酰丙酮鐵(Ferric acetylacetonate),合成Fe3O4納米粒子,在堿性條件下水解四乙氧基硅烷(Tetraethylorthosilicate,TEOS),包裹Fe3O4納米粒子,形成表面為硅羥基的納米磁性微粒。
[0066]納米磁微粒具 體制備方法為:在三口燒瓶中將0.500g乙酰丙酮鐵溶解于20mL苯甲醇，室溫抽真空，再在氬氣保護下以平均6.50C /min升溫速率升至190°C，并在此溫度下反應2h，得到黑色的膠體溶液。使用磁鐵收集產物，用正己烷和乙醇分別洗滌數次，在真空干燥箱內抽真空，70°C干燥24h，即可制成四氧化三鐵納米磁微粒；將IOOmg四氧化三鐵納米磁微粒溶解在IOOmL乙醇水的混合溶液中，乙醇與水的體積比為4:1，再加入0.4mLTE0S、4mL氨水(濃度為25% )，TEOS經水解、聚合，最后經無水乙醇洗滌、抽濾、干燥即可制成表面為硅羥基修飾的納米磁微粒。納米磁微粒保存在無水乙醇中或者DEPC處理的水中，室溫保存或者2-8 °C冷藏保存均可。
[0067]所述裂解液為:5M異硫氰酸胍、50mMTris-HCl、20mMEDTA、l% TritonX-100，調節(jié)pH值至6.0。
[0068]所述標本稀釋液為磷酸鹽緩沖液；
[0069]所述結合液為無水乙醇；
[0070]所述洗液為70%乙醇；
[0071 ] 所述洗脫液為TE (ρΗ8.0)；
[0072]所述實時熒光PCR反應液為PremixExTaq酶、上游引物(Fl)和下游引物(Rl)、熒光探針(Pl)、標本DNA |吳板和水；
[0073]質粒標準品為含有惡性痕原蟲基因片段⑶的質粒，濃度為I X IO7Copies/μ L ;
[0074]所述的陽性對照為質粒濃度為I X IO3Copies/ μ L的質粒標準品；
[0075]所述的陰性對照為正常人全血標本核酸提取液。
[0076]具體操作方法如下:
[0077]1、質粒標準品構建步驟如下:
[0078]分離提取惡性瘧原蟲DNA，普通PCR反應擴增目的基因片段⑶；
[0079]對擴增片段進行切膠回收、連接、轉化、篩選陽性克隆、測序，確認插入目的序列片段的準確性；[0080]純化質粒,測定并計算質粒濃度；此次制備質粒濃度為2.5 X IO8Copies/ μ L ；
[0081]對質粒標準品進行10倍梯度稀釋，質粒濃度為2.5X108、2.5X107、2.5X IO6,2.5Χ105、2.5Χ104、2.5Χ103、2.5Χ102 和 2.5X IO1Copies/μ L，Ct 值依次為 11.91,15.88、18.96,22.72,25.90,28.96,32.45,36.45，檢測靈敏度為 25copies/μ L。選定合適的質粒標準品濃度范圍(2.5 X IO1Copies/ μ L~2.5 X IO8Copies/ μ L)，以實時熒光PCR的Ct值為縱坐標(y)，以惡性瘧原蟲核酸拷貝數的對數值為橫坐標(X)，構建標準曲線。
[0082]上述的普通PCR反應液為:10 X PCRbuffer (含Mg2+)、上游引物(Fl)、下游引物(Rl)、Taq酶、dNTPs、模板(惡性瘧原蟲DNA)和水。
[0083]普通PCR反應步驟:在0.2mL離心管中，依次加入2.5 μ LlO X PCRbuffer (含Mg2+)，
0.5 μ LdNTPs (IOmM)，上游引物(FLlOyM)和下游引物(RLlOyM)各 I μ L，0.2 μ LTaq 酶(5~4 1^)、2 4 1^惡性瘧原蟲0嫩提取液，補水至25“1^反應條件為:95°C lmin ；95°C 30s,55°C 30s, 72°C 40s，35 個循環(huán)；72°C lOmin，4°C保存?zhèn)溆谩?br>
[0084]2、納米磁微粒(MNP)分離提取全血標本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0085]⑴在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L,加入惡性瘧疑似病人全血標本50 μ L,標本量不足50 μ L時,用標本稀釋液補足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ；
[0086](2)加入200 μ L結合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；
[0087]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0088]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸
取上清液備用。
[0089]3、納米磁微粒(MNP)分離提取全血濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA步驟如下:
[0090]⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；
[0091](2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200 μ L結合液,加入20 μ LMNP(25 μ g/μ L),渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；
[0092]⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；
[0093]⑷加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0094]4、實時熒光PCR:
[0095]在0.2mL 離心管中，依次加入 12.5 μ L2 X PremixExTaq, 0.5 μ L 上游引物(Fl，10μΜ)、0.5yL下游引物(R1，10 μ M)，0.3 μ L熒光探針(Ρ1，10 μ Μ)、2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液，補水至25 μ L0如采用ΑΒΙ7900實時熒光PCR儀進行實時熒光PCR反應，則使用實時數據采集模式，數據采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0096]循環(huán)反應參數為95°C 30s ；95°C 5s，60°C 30s,40 個循環(huán)。
[0097]5、反應系統(tǒng)的質量控制:
[0098]根據使用不同的實時突光PCR儀設定好基線(baseline),設定的一般原則以閾值線剛好超過正常陰性對照反應曲線的最高點，也可根據儀器噪音情況調整。反應結果應同時符合以下2個條件:即陰性對照無擴增曲線而陽性對照Ct〈35并有明顯擴增曲線。否則，試驗結果無效。
[0099]陰性結果:樣品無Ct值或Ct > 40，且無明顯擴增曲線，報告為惡性瘧原蟲實時熒光PCR檢測結果為陰性。
[0100]陽性結果:樣品Ct值≤35，并有明顯擴增曲線，報告為惡性瘧原蟲實時熒光PCR檢測結果為陽性。
[0101]可疑結果:樣品Ct值在35-40之間的標本必須重做，若重做結果仍然有明顯擴增曲線，則該標本判斷為惡性瘧原蟲實時熒光PCR檢測結果為陽性，否則為陰性。
[0102]值得特別 說明的是，為了實現本發(fā)明的惡性瘧原蟲定量檢測，參考GeneBank中惡性瘧原蟲基因組18SrRNA保守區(qū)基因序列，利用DNAMAN6.0進行序列比對，通過軟件PrimerExpress3.0設計實時突光PCR引物與探針。構建質粒標準品的上、下游引物為實時熒光PCR上、下游引物，質粒標準品基因片段為162bp。借助這些質粒標準品制作外標定量標準曲線，以實現惡性瘧原蟲的定量檢測。
[0103]具體檢測實例
[0104]實施例1:惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒及其使用
[0105]⑴制備包括下列組成成分的試劑盒:
[0106]納米磁微粒、標本稀釋液、裂解液、結合液、洗液、洗脫液、實時熒光PCR反應液、超純水、陰性對照、陽性對照、質粒標準品。
[0107]⑵標本采集、運送和保存:
[0108]全血標本:無菌操作采集疑似惡性瘧病人的全血標本；全血標本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指；抗凝劑可選用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉；一周內進行瘧原蟲檢測的可存放于2-8°C，長時間保存應置于_20°C或_70°C以下；標本運送應符合生物安全要求，在冷藏(2-8°C )或冷凍(_20°C )的條件下運送。
[0109]濾紙干血片標本:取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙片上，室溫自然晾干后放入塑料袋密封，置于常溫(18-25°C )或冷藏或冷凍保存；標本可在常溫、冷藏或者冷凍的條件下運送。
[0110]⑶檢測步驟和結果分析:
[0111]全血標本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性痕疑似病人全血標本50 μ L,標本量不足50 μ L時,用標本稀釋液補足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;加入200 μ L結合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ L，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0112]陰性對照全血與病人全血標本提取核酸步驟相同。
[0113]濾紙干血片標本中的惡性瘧原蟲核酸分離提取:
[0114]將自然晾干的全血濾紙干血片標本，剪成紙條(剪刀在剪切前后均在酒精燈上燒一下)，放入1.5mL 離心管中，向其中加入100 μ L的標本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻，56°C IOmin ;8000rpm離心lmin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中；在上清液中加入200 μ L結合液，加入20 μ LMNP (25 μ g/ μ L)，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置lOmin，用磁鐵吸附MNP，棄上清；加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液；加入洗脫液50 μ LjfMNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
[0115]實時熒光PCR:分別取2 μ L上述惡性瘧原蟲DNA提取液、或2 μ L陽性對照或陰性對照或系列梯度稀釋的質粒標準品，加入實時熒光PCR反應管中，反應總體積為25 μ L，其中上游引物(Fl)200nM，下游引物(Rl) 200nM，熒光探針(Pl) 120nM。采用ABI7900實時熒光PCR儀進行實時熒光PCR反應，使用實時數據采集模式，數據采集分析系統(tǒng)為SDS2.3。
[0116]循環(huán)反應參數為95°C 30s ；95°C 5s,60°C 30s,40 個循環(huán)。
[0117]反應結束后保存檢測數據文件，并對數據文件進行分析。
[0118]由圖2可見強、中和弱三個陽性標本的擴增曲線，三個標本的Ct值分別是20.60,29.62,35.84，經標準曲線推算其惡性瘧原蟲水平分別為8.46X IO5Copies/μ L、2.0OX IO3Copies/ μ L,30copies/ μ L ;反應曲線為典型的實時熒光擴增曲線，均能夠判定為陽性。
[0119]圖3顯示該檢測方法的特異性曲線。惡性瘧原蟲標本檢測Ct值為25.30，根據標準曲線推算出標本中惡性瘧原蟲含量，為3.60 X IO4Copies/μ L ;而間日瘧原蟲、三日瘧原蟲、卵形瘧原蟲以及陰性對照的擴增曲線均沒有上升。
[0120]圖4顯示采用本試劑盒，對非洲流行區(qū)回國的入境人員的惡性瘧原蟲感染狀況進行檢測，結果檢測出I例低水平惡性瘧原蟲感染者，Ct值為37.02，判斷為惡性瘧原蟲可疑陽性，經復測驗證最終判斷為惡性瘧原蟲陽性，惡性瘧原蟲水平為Hcopies/μ L。對此例感染者進行隨訪，發(fā)現其4天前在非洲疫區(qū)醫(yī)院因瘧疾治愈而出院；此次入境時檢出其體內存在低水平的惡性瘧原蟲，說明該患者還沒有完全治愈，還有惡性瘧復燃的危險，建議其及早行瘧疾根治治療；病人隨后及時到專科醫(yī)院就醫(yī)，經抗惡性瘧治療康復。
【權利要求】
1.一種惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述試劑盒包括如下組分:納米磁微粒、標本稀釋液、裂解液、結合液、洗液、洗脫液、實時熒光PCR反應液、質粒標準品、陽性對照、陰性對照； 所述的納米磁微粒為用無水乙醇配制的納米磁微粒溶液； 所述標本稀釋液為磷酸鹽緩沖液PBS ； 所述裂解液為5M異硫氰酸胍溶液； 所述結合液為無水乙醇； 所述洗液為70%乙醇； 所述洗脫液為TEpH8.0 ； 所述實時熒光PCR反應液包括上游引物F1，見序列1，下游引物R1，見序列2和熒光探針Pl，見序列3 ； 所述的質粒標準品為含有惡性瘧原蟲基因片段(S)的質粒； 所述的陽性對照為惡性瘧原蟲質粒標準品； 所述的陰性對照為正 常人全血核酸提取液。
2.根據權利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:瘧疾疑似病例全血標本通常有兩種形式，一種是抗凝全血標本，包括靜脈全血和末梢全血，末梢包括耳垂、中指、無名指或食指，抗凝劑采用EDTA鈉鹽或鉀鹽或枸櫞酸鈉，置于2-8°C或_20°C保存，供核酸提取用；一種是濾紙干血片標本，取疑似病例末梢血滴于滅菌的濾紙上，室溫晾干后放入塑料袋密封，置于常溫18-25°C或2-8°C或-20C保存，供核酸提取用。
3.根據權利要求1所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述Fe3O4納米磁微粒分離提取全血標本和濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟分述如下: 所述納米磁微粒MNP分離提取全血標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: (1)在1.5mL離心管中加入裂解液150 μ L，加入惡性瘧疑似病人全血標本50 μ L，標本量不足50 μ L時,用標本稀釋液補足,潤旋或顛倒混勻，56°C IOmin ； ⑵加入200 μ L結合液，加入20 μ LMNP, 25 μ g/ μ L，渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP，棄上清； ⑶加入300 μ L洗液清洗ΜΝΡ，用磁鐵吸附ΜΝΡ，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
4.根據權利要求3所述的惡性瘧原蟲納米磁分離實時熒光定量PCR檢測試劑盒，其特征在于:所述納米磁微粒MNP分離提取全血濾紙干血片標本中惡性瘧原蟲DNA的步驟為: ⑴將自然晾干的全血濾紙干血片標本，約Icm2大小，血量約為15-30 μ L，剪成紙條，放入1.5mL離心管中，向其中加入100 μ L的標本稀釋液，加入裂解液150 μ L，渦旋或顛倒混勻,56。。IOmin ;8000rpm離心Imin,吸取上清液于另一支1.5mL離心管中； (2)在上述裝有上清液的離心管中，加入200μ L結合液,加入20 μ LMNP, 25 μ g/μ L,渦旋或顛倒混勻，室溫靜置IOmin,用磁鐵吸附MNP,棄上清；⑶ 加入300 μ L洗液清洗MNP，用磁鐵吸附MNP，棄上清；重復清洗一次；2000rpm，短暫離心，用吸頭吸走殘液； ⑷加入50 μ L洗脫液，將MNP吹打混勻，56°C 5min，取出后立即用磁鐵吸附MNP，吸取上清液備用。
5.一組惡性瘧原蟲實時熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于:其核苷酸序列為序列1、序列2、序列3，其中序列I為上游引物、序列2為下游引物、序列3為熒光探針。
6.根據權利要求5所述的一組惡性瘧原蟲實時熒光定量PCR檢測用核苷酸序列，其特征在于:所述上游引物、下游引物、熒光探針的濃度為:上游引物200nM，下游引物200nM，熒光探針120nM。
【文檔編號】C12N15/11GK103937907SQ201410201466
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年5月14日 優(yōu)先權日:2014年5月14日
【發(fā)明者】劉翌, 王飛, 田茵, 孫寧, 楊靜, 孫福軍, 劉艷華, 薛強, 高璟瑜, 張紹福, 鄒明強, 鄧叢良, 葛廣路 申請人:中華人民共和國北京出入境檢驗檢疫局