用于生產(chǎn)β-檀香萜的方法

用于生產(chǎn)β-檀香萜的方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種生產(chǎn)β-檀香萜的方法，所述方法包含將至少一種多肽與法呢基焦磷酸酯(FPP)接觸。具體地，所述方法可在體外或體內(nèi)生產(chǎn)香料和調(diào)味料領域非常有用的化合物—β-檀香萜。本發(fā)明還提供了在用于本發(fā)明方法中的多肽的氨基酸序列。本發(fā)明的又一部分是編碼本發(fā)明多肽的核酸以及含有所述核酸的表達載體。本發(fā)明的又一目的是用于生產(chǎn)β-檀香萜的方法的經(jīng)轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細胞。
【專利說明】用于生產(chǎn)β-擅香萜的方法
[0001]本發(fā)明是2009年12月9日申請的發(fā)明名稱為“用于生產(chǎn)β_檀香萜的方法”的第200980149896.7號發(fā)明專利申請的分案申請。
【技術領域】
[0002]本發(fā)明提供一種生產(chǎn)β -檀香萜的方法，所述方法包括將至少一種多肽與法呢基焦磷酸酯(FPP)接觸。特別是，所述方法可以在體外或體內(nèi)進行以產(chǎn)生β_檀香萜，其是一種在香料和調(diào)味料領域中非常有用的化合物。本發(fā)明還提供可用于本發(fā)明方法的多肽的氨基酸序列。編碼本發(fā)明多肽的核酸和含有所述核酸的表達載體也是本發(fā)明的一部分。本發(fā)明的另一個目的是一種經(jīng)轉(zhuǎn)化以在生產(chǎn)β-檀香萜的方法中使用的非人宿主生物體或細胞。
【背景技術】
[0003]已經(jīng)在大多數(shù)生物體(微生物、動物和植物)中發(fā)現(xiàn)了萜。這些化合物由稱為異戊二烯單元的五碳單元組成，并按由結(jié)構(gòu)之中存在的這些單元的數(shù)目來進行劃分。因此單萜、倍半萜和雙萜分別是包含10、15和20個碳原子的萜。例如，倍半萜已廣泛見于植物界。許多倍半萜分子因它們的調(diào)味料和香味性質(zhì)以及它們的美容、醫(yī)藥和抗菌效果而眾所周知。已經(jīng)鑒定出了 300多種倍半萜烴類和3000多種倍半萜化合物(Joulain, D.,和 Kdnig, W.A., The Atlas of Spectral Data of SesquiterpeneHydrocarbons,EB Verlagj Hamburg, 1998 ；Connolly,J.D.，Hill R.A.，Dictionary ofTerpenoids, Vollj Chapman and Hall (publisher), 1991)，并且每年還鑒定出許多新的結(jié)構(gòu)。將通過不同方式如蒸汽蒸餾或溶劑萃取獲得的植物提取物用作萜源。萜分子往往原樣使用，但是有時候使用化學 反應將該萜轉(zhuǎn)化成其它的高價值分子。
[0004]萜的生物合成生產(chǎn)涉及的酶被稱為萜合酶。事實上植物界中存在大量的倍半萜合酶，其全部使用相同的底物(法呢基焦磷酸酯，F(xiàn)PP)但是具有不同的產(chǎn)物分布。已經(jīng)克隆了編碼倍半萜合酶的基因和cDNA并且描述了相應的重組體酶。在植物中及其他生物體中的職的生物合成已經(jīng)被廣泛研究，在此不另外詳述，但可參考Dewick的Nat.Prod.Rep.,2002，19，181-222，其綜述了萜生物合成路徑的現(xiàn)有技術的狀況。
[0005]β -檀香萜是天然生成的倍半萜分子，其可以被用作化學合成或生物合成β -檀香醇(如圖2Β所示)的起始原料，該檀香醇為檀香油的主要組分。通過蒸餾檀香物種的心材獲得的檀香油是重要的香料成分。檀香也被大量用于熏香和傳統(tǒng)醫(yī)學。該油包含90%的倍半萜醇。在不同的檀香醇的異構(gòu)體中，β_檀香醇對于典型的檀香油的甜木香和香脂氣味起到主要貢獻。其它組分例如表檀香醇和α-檀香醇可同樣有助于檀香木氣味。
[0006]通常，植物天然提取物的價格和可用性取決于植物的豐度、油的收率和地理來源。另外，天然提取物的可獲性和品質(zhì)極大地依賴于導致每年差異化的氣候及其他當?shù)貤l件，使得某些年在高品質(zhì)香料中使用上述成分非常困難，甚至不可能使用。由于過度開發(fā)自然資源、難以耕作、檀香植物的緩慢生長，在過去的十年期間檀香原料的可獲性已經(jīng)顯著地減少。因此，有利的是提供一種β-檀香醇的來源，其更少地受可獲性和品質(zhì)的波動的影響。檀香倍半萜組分的化學合成迄今為止是不可利用的。因此合成β-檀香萜(然后其可被用于生產(chǎn)β-檀香醇)的生物化學途徑很受關注。
[0007]在若干植物品種中鑒定出檀香烷型倍半萜、特別是具有β_檀香烷骨架的倍半萜。但是還未有能合成檀香萜的倍半萜合酶的記載。
[0008]在國際專利申請W02006/134523中公開了一種能夠合成至少一種雙環(huán)和/或三環(huán)的具有檀香烷碳骨架的倍半萜的倍半萜合酶、相應的核酸和具有檀香烷碳骨架的該化合物的制備方法。但是，在其實施例中公開的倍半萜合酶產(chǎn)物中并沒有檢測到β_檀香萜的蹤跡，僅有的具有檀香烷骨架的產(chǎn)物為表-β-檀香萜。表檀香萜的性質(zhì)與檀香萜的性質(zhì)懸殊。特別是，在檀香醇的合成過程中表檀香萜不是重要的。此外，在W02006/134523中公開的倍半萜合酶僅僅與本發(fā)明序列共有27%的同一性。
[0009]從數(shù)據(jù)庫中公知的倍半萜合酶和本發(fā)明的多肽的同一性的比率非常低。與本發(fā)明的β -檀香職合酶最接近的蛋白序列是來自于白檀(Santalum album)(檢索號ACF24767 ； Jones, C.G.，Keeling, C.1.，Ghisalbertij E.L.，Barbour, E.L.，Plummer, J.A.和 Bohlmannj J.Arch.Biochem.Biophys.，2008，477 (I)，121-130)的單胳合酶，其與本發(fā)明的β_檀香萜合酶具有58%的氨基酸序列同一性。當與FPP接觸之后，該酶產(chǎn)生超過90%的β_紅沒藥烯并且沒有檀香萜異構(gòu)體形成。
[0010]除序列本身之間的差異之外，還應指出的是，由上述酶合成的產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)與倍半萜β-檀香萜的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相差懸殊。特別是由該酶產(chǎn)生的單萜，即α-松油萜、檸檬稀、香茅醇、月桂烯、里哪醇和其它一些單體產(chǎn)物都不適合作為香料領域非常有用的成分β-檀香醇的合成的起始原料。
[0011]盡管廣泛研究了萜的環(huán)化，但是由于它們的低豐度、通常的瞬時表達模式和在其表達組織中從樹脂和酚類化合物的混合物中純化它們的復雜性的原因，萜合酶的分離和表征仍然是困難的，尤其是在植物中。
[0012]本發(fā)明的目的是，如上所指出的，提供以經(jīng)濟的方式生產(chǎn)檀香萜的方法。因此，本發(fā)明的目的是生產(chǎn)β_檀香萜，同時有極少的浪費的方法、其節(jié)約能源和資源并同時減少了對化石燃料的依賴性。本發(fā)明的另一目的是提供能夠合成可用作香料和/或芳香成分的檀香萜的酶。
[0013]使用的縮寫
[0014]ACC 1-氨基環(huán)丙烷甲酸
[0015]bp 堿基對
[0016]kb 千堿基
[0017]BSA 牛血清清蛋白
[0018]2, 4D 2，4-二氯苯氧基乙酸
[0019]DNA 脫氧核糖核酸
[0020]cDNA 互補 DNA
[0021]dNTP脫氧核苷三磷酸
[0022]DTT 二硫蘇糖醇
[0023]EDTA 乙二胺四乙酸[0024]FPP 法呢基焦磷酸酯
[0025]GC 氣相色譜
[0026]IPTG異丙基-D-硫代半乳糖苷
[0027]Kin 細胞分裂素
[0028]LB 溶菌肉湯
[0029]MS 質(zhì)譜
[0030]PCR 聚合酶鏈式反應
[0031]RMCE重組酶介導的盒式交換
[0032]3’ -/5’ -RACE 3’ 和 5’ cDNA 末端快速擴增
[0033]RNA 核糖核酸
[0034]mRNA 信使核糖核酸
[0035]RNAse 核糖核酸酶

【發(fā)明內(nèi)容】

[0036]本發(fā)明提供一種使用具有β_檀香萜合酶活性的多肽以經(jīng)濟、可靠并且可再現(xiàn)的方式生物合成生產(chǎn)β-檀香職的方法。由于現(xiàn)有技術未曾記載過該多肽并且未曾描述過該β_檀香萜的生物合成，本發(fā)明是特別有價值的。本發(fā)明解決了對于香料業(yè)工業(yè)非常有用的化合物檀香萜的供給的非常重要的難題。本發(fā)明還提供一種與所述多肽密切相關的編碼本發(fā)明方法中使用的多肽的核酸序列。多肽和核酸是非常重要的工具，它們同為實施本發(fā)明所必需的。對于用本發(fā)明的核酸進行修飾以異源表達本發(fā)明的多肽的載體和生物體來說也是同樣的。
[0037]“倍半萜合酶”或“具有倍半萜合酶活性的多肽”是用于本發(fā)明目的作為能夠催化從無環(huán)萜前體FPP合成倍半萜分子或倍半萜分子混合物的多肽。
[0038]作為“ β -檀香萜合酶”或“具有β -檀香萜合酶活性的多肽”，此處我們是指能夠催化從FPP開始合成任何立體異構(gòu)體或其混合物形式的β -檀香萜的多肽。β -檀香萜可以是唯一的產(chǎn)物或可以是倍半萜混合物的一部分。β_檀香萜以圖2Α所示的結(jié)構(gòu)來定義。
[0039]多肽催化特定倍半萜(例如β_檀香萜)的合成的能力可以簡單地通過實施實施例3詳述的酶活性分析來確認。
[0040]根據(jù)本發(fā)明，多肽也意味著包括截短的多肽，條件是它們能夠保持如任何上述實施方案所定義的倍半萜合酶活性，而且它們與SEQ ID NO:1的相應片段共有至少規(guī)定百分數(shù)的同一'I"生。
[0041]如本文以下所指出的，“通過修飾SEQ ID N0:2、SEQ ID Ν0:4或它們的互補序列而獲得的核苷酸序列”包含已經(jīng)通過使用本領域公知的任何方法(例如通過引入任何類型的突變?nèi)缛笔А⒉迦牖蛉〈耐蛔?改變SEQ ID N0:2、SEQ ID Ν0:4或它們的互補序列的序列所獲得的任何序列。在與變體多肽及其制備方法有關的描述部分列舉了上述方法的實例。
[0042]在兩個肽或核苷酸序列之間的同一性百分比是在已經(jīng)生成這兩個序列的比對時，在這兩個序列中相同的氨基酸或核苷酸殘基數(shù)目的函數(shù)。相同的殘基定義為在這兩個序列中在給定的比對位置上相同的殘基。在此處使用的序列同一性的百分比是由最優(yōu)比對，通過將在兩個序列之間的相同殘基的數(shù)目除以在最短的序列中的殘基的總數(shù)然后乘以100而計算得到的。該最佳比對是同一性百分比可能是最高的比對。在該比對的一個或多個位置中的一或兩個序列中引入間隙以便獲得最佳比對。然后在序列同一性的百分比計算中將這些間隙作為不相同的殘基來考慮。
[0043]以測定氨基酸或核酸序列同一性百分比為目的的比對可以使用計算機程序以多種方式來實現(xiàn)，例如在萬維網(wǎng)上可獲得的公開可用的計算機程序。優(yōu)選，可使用來自National Center for Biotechnology Information (NCBI)的地址為 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/bl2seq/wblast2.cgi 的 BLAST 程序(Tatianaet al, FEMS MicrobiolLett.，1999，174:247-250, 1999)，其參數(shù)設為默認，來獲得肽或核苷酸序列的最優(yōu)比對，以及來計算序列同一性的百分比。
[0044]因此，本發(fā)明的一個目的是一種生產(chǎn)β -檀香萜的方法，其包含:
[0045]a)使FPP與至少一種具有β -檀香萜合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ IDNO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列；
[0046]b)非強制選擇地，分離在步驟a)中產(chǎn)生的檀香萜。
[0047]根據(jù)一個優(yōu)選的實施方案，檀香萜占由本發(fā)明方法生產(chǎn)的產(chǎn)物的至少20%、優(yōu)選至少30%、優(yōu)選至少35%。 [0048]該方法可在體外和體內(nèi)實施，條件是本發(fā)明方法不包含僅涉及植物天然代謝而無任何轉(zhuǎn)化的方法，其在下文中將進一步詳細解釋。
[0049]要與FPP在體外接觸的多肽可以通過使用標準蛋白質(zhì)或酶提取技術從表達它的任何生物體中提取來獲得。如果宿主生物體是將本發(fā)明多肽釋放到培養(yǎng)基內(nèi)的單細胞生物或細胞，可以簡單地從該培養(yǎng)基內(nèi)收集該多肽，例如通過離心法、非強制選擇地隨后進行洗滌步驟和在適合的緩沖溶液中再懸浮。如果該生物體或細胞將該多肽聚集在它的細胞之內(nèi)，該多肽可以通過分裂或溶解該細胞并進一步自該細胞溶解產(chǎn)物提取該多肽來獲得。
[0050]然后可以將具有β_檀香萜合酶活性的多肽(以分離形式或與其它蛋白質(zhì)一起，例如以從培養(yǎng)細胞或微生物中獲得的粗蛋白提取物的方式)懸浮在最佳PH下的緩沖溶液中。如果適當，可以添加鹽、DTT、BSA及其他種類的酶輔助因子以便優(yōu)化酶活性。可以調(diào)節(jié)這些酶輔助因子的濃度以獲得最佳的收率。例如降低多肽懸濁液中Mg2+離子濃度對于增加β-檀香萜的收率是非常有利的。最佳的Mg2+離子濃度為2~0.75mM。適當?shù)臈l件將在下文的實施例中更詳細地描述。
[0051]將前體FPP添加到該多肽懸浮液中，然后將其在最佳的溫度下培養(yǎng)，例如在15°C和40°C之間、優(yōu)選在25°C和35°C之間、更優(yōu)選在30°C下。在培養(yǎng)之后，可以非強制選擇地在自該溶液去除多肽之后通過標準分離工序如溶劑萃取和蒸餾將產(chǎn)生的β-檀香萜從該培養(yǎng)的溶液中分離出來。
[0052]根據(jù)另一個優(yōu)選方案，任何上述實施方案中的方法是在體內(nèi)進行的。在這種情況下，步驟a)包含在有利于生產(chǎn)β -檀香萜的條件下培養(yǎng)能夠生產(chǎn)FPP并且經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達至少一種多肽的非人宿主生物體或細胞，其中該多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。
[0053]根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，該方法在步驟a)之前還包含用編碼多肽的至少一種核酸將能夠生產(chǎn)FPP的非人生物體或細胞轉(zhuǎn)化以使所述生物體表達所述多肽，該多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50 %同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。
[0054]本發(fā)明的這些實施方案是特別有益的，因為有可能在體內(nèi)進行該方法，無需預先分離該多肽。在經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達所述多肽的生物體或細胞之內(nèi)直接發(fā)生該反應。
[0055]根據(jù)本發(fā)明特定的實施方案，該至少一種編碼檀香萜合酶的核酸包含與SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，所述核酸包含核苷酸序列SEQ IDN0:2,SEQ ID NO:4或它們的互補序列。在更加優(yōu)選的實施方案中，所述核酸由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列組成。
[0056]在另一優(yōu)選實施方式中，核酸由與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列組成。在更優(yōu)選的實施方案中，所述核酸由SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列組成。
[0057]根據(jù)更加優(yōu)選的實施方式，任何上述實施方式中使用的該至少一種核酸包含通過修飾SEQ ID NO: 2,SEQ ID NO: 3或它們的互補序列獲得的核苷酸序列。根據(jù)更加優(yōu)選的實施方式，所述至少一種核酸由通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 3或它們的互補序列獲得的核苷酸序列組成，優(yōu)選SEQ ID NO:3或它的互補序列。 [0058]根據(jù)另一實施方式，該至少一種核酸分離自檀香種的植物，優(yōu)選自白檀。
[0059]該生物體或細胞意在“表達”多肽，條件是該生物體或細胞被轉(zhuǎn)化以包含編碼所述多肽的核酸，該核酸被轉(zhuǎn)錄成mRNA并且在該宿主生物體或細胞中發(fā)現(xiàn)該多肽。術語“表達”包含“異源表達”和“過表達”，后者是指mRNA、多肽和/或酶活性的水平超過在非轉(zhuǎn)化生物體或細胞內(nèi)測量得到的水平。隨后在致力于將上述轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細胞作為本發(fā)明特定目的的說明書部分和實施例中對轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細胞的適合方法作更詳細地描述。
[0060]特定的生物體或細胞，當其天然產(chǎn)生FPP時或當其并不天然產(chǎn)生FPP但可經(jīng)轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生FPP時，不管是用此處描述的核酸轉(zhuǎn)化之前還是與所述核酸一起都意味著“能夠產(chǎn)生FPP”。經(jīng)轉(zhuǎn)化的與天然存在的生物體或細胞相比產(chǎn)生更高量FPP的生物體或細胞也包括在“能夠產(chǎn)生FPP的生物體或細胞”內(nèi)。轉(zhuǎn)化生物體(例如微生物)以便它們產(chǎn)生FPP的方法已經(jīng)是本領域公知的。這些方法可以例如在文獻中找到，例如在下列出版物中:Martin, V.J., Pitera, D.J., Withers, S.T., Newman, J.D.和 Keasling, J.D.NatBiotechnol.，2003，21 (7)，796-802 (大腸桿菌的轉(zhuǎn)化)；Wu, S.，Schalk, Μ.，Clark, A.，Miles, R.B.，Coates, R.和 Chappell, J.，Nat Biotechnol.，2006，24 (11)，1441-1447 (植物的轉(zhuǎn)化)；Takahashi, S., Yeo, Y., Greenhagen, B.T., McMul I in, T., Song, L., Maurina-Brunker,J., Rosson, R., Noel, J., Chappell, J, Biotechnology and Bioengineering, 2007, 97 (I), 170-181(酵母的轉(zhuǎn)化)。
[0061]為了在體內(nèi)實施本發(fā)明，在有利于生產(chǎn)檀香萜的條件下培養(yǎng)宿主生物體或細胞。因此，如果該宿主是轉(zhuǎn)基因植物，則提供最佳的生長條件，例如，如最佳的光、水和營養(yǎng)條件。如果該宿主是單細胞生物，有利于生產(chǎn)β_檀香萜的條件可以包含在宿主的培養(yǎng)基內(nèi)添加適合的輔助因子。另外，可以選擇培養(yǎng)基，以便最佳化β-檀香萜的合成。在下列實施例中更詳細地描述了最佳的培養(yǎng)條件。
[0062]適合于在體內(nèi)進行本發(fā)明方法的非人宿主生物體可以是任何非人的多細胞或單細胞生物體。在優(yōu)選的實施方案中，用于在體內(nèi)進行本發(fā)明的非人宿主生物體是植物、原核生物或真菌。可以使用任何植物、原核生物或真菌。特別有用的植物是天然產(chǎn)生高含量萜的植物。在更優(yōu)選的方案中，該植物選自爺科(Solanaceae)、禾本科(Poaceae)、十字花科(Brassicaceae)、碟形花科(Fabaceae)、錦奏科(Malvaceae)、菊科(Asteraceae)或唇形科(Lamiaceae)。例如,該植物選自煙草屬(Nicotiana)、爺屬(Solanum)、高粱屬(Sorghum)、擬南芥屬(Arabidopsis)、蕓苔屬(Brassica (油菜))、苜猜屬(Medicago (紫花苜猜))、棉屬(Gossypium(棉花))、蒿屬(Artemisia)、鼠尾草屬(Salvia)和薄荷屬(Mentha)。優(yōu)選，該植物屬于煙草(Nicotianatabacum)種。
[0063]在更優(yōu)選的實施方案中，用于在體內(nèi)進行本發(fā)明方法的非人宿主生物體是微生物?？梢允褂萌魏挝⑸铮歉鶕?jù)更加優(yōu)選的實施方案，所述微生物是細菌或酵母。最優(yōu)選，所述細菌是大腸桿菌(E.coli),所述酵母是釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0064]這些生物體中的一些天然不會產(chǎn)生FPP。為了適于進行本發(fā)明的方法，必須將這些生物體轉(zhuǎn)化以產(chǎn)生所述前體。如以上所述，可以在用上述任何實施方案描述的用核酸修飾之前或者同時將它們進行轉(zhuǎn)化。
[0065]還可以使用分離的高等真核細胞代替完整生物體作為宿主以便在體內(nèi)實施本發(fā)明的方法。適合的真核細胞可以是任何非人的細胞，但是優(yōu)選植物細胞或真菌細胞。
[0066]根據(jù)一個優(yōu) 選實施方案，具有β_檀香萜合酶活性并在上述任何實施方案中使用的至少一種多肽或由用于任何上述實施方案中的核酸編碼的至少一種多肽包含與SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:3有至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一性的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實施方案，所述多肽包括氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3。在更加優(yōu)選的實施方案中，所述多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ IDΝ0:3。
[0067]在另一個優(yōu)選實施方案中，多肽由與SEQ IDN0:1或SEQ ID N0:3有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列組成。在更加優(yōu)選的實施方式中，所述多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3組成。
[0068]根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，上述任一實施方式中使用的或由上述任一實施方式中使用的核苷酸編碼的具有β_檀香萜合酶活性的至少一種多肽包含通過基因工程獲得的SEQID NO:1或SEQ ID NO: 3的變體氨基酸序列，條件是所述變體保持了如上定義的β -檀香萜合酶活性并且與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有所需百分比的同一性。換句話說，所述多肽優(yōu)選包含通過修飾SEQ ID NO:2,SEQ ID Ν0:4或它們的互補序列獲得的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實施方式，上述任一實施方式中使用的或由上述任一實施方式中使用的核苷酸編碼的具有β_檀香萜合酶活性的至少一種多肽由通過基因工程獲得的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的變體氨基酸序列組成，即，通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列獲得核苷酸序列編碼的氨基酸序列。[0069]根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，上述任一實施方式中使用的或由上述任一實施方式中使用的核苷酸編碼的具有β_檀香萜合酶活性的至少一種多肽是可在其它生物體中(例如其它植物品種中)天然發(fā)現(xiàn)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的變體，條件是該變體保持了如上定義的檀香萜合酶活性并且它們與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3具有規(guī)定百分比的同一性。
[0070]在此處所使用的多肽指的是包含此處標明的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或變體多肽，條件是它們保持如以上定義的β -檀香萜合酶活性，而且它們與相應的SEQ ID NO:1或SEQ ID Ν0:3片段共有至少所定義的百分比的同一性。
[0071]變體多肽的實例是由選擇性mRNA剪接或此處所述形成多肽的蛋白酶剪切而得到的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？蓺w因于蛋白水解的變體包括，例如，當在不同類型的宿主細胞中表達時，由于從本發(fā)明多肽上蛋白水解移除一個或多個末端氨基酸而導致在N-或C-末端的差異。本發(fā)明也包含如其后所描述的用由本發(fā)明核酸的天然或人工突變而獲得的核酸編碼的多肽。
[0072]由在氨基和羧基末端融合額外的肽序列而產(chǎn)生的多肽變體也可用于本發(fā)明的方法。尤其是這樣的融合可以提高多肽的表達，在期望的環(huán)境或表達系統(tǒng)中利于蛋白質(zhì)的提純或多肽酶活性的改善。這種額外的肽序列可以例如是信號肽。因此，本發(fā)明包含使用變體多肽的方法，例如通過與其它寡肽或多肽融合而獲得的多肽和/或與信號肽連接的多肽。在本發(fā)明的方法中有利地還可以使用由與另外的功能蛋白(例如來源于萜生物合成路徑的另外的蛋白質(zhì))融合而產(chǎn)生的多肽。
[0073]根據(jù)另一實施方式，上述任一實施方式中使用的或由上述任一實施方式中使用的核苷酸編碼的具有β_檀香萜合酶活性的至少一種多肽是從檀香種類的植物(優(yōu)選白檀中)分離出來的。
[0074]實施本發(fā)明的重要工具為多肽本身。因此，具有檀香萜合酶活性并且包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽是本發(fā)明的另一目的。
[0075]根據(jù)優(yōu)選實施方式，多肽能夠生產(chǎn)倍半萜混合物，其中檀香萜占生成的倍半萜的至少20%、優(yōu)選占至少30%、優(yōu)選占至少35%。
[0076]根據(jù)優(yōu)選實施方式，多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實施方式，該多肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3。
[0077]根據(jù)另一優(yōu)選實施方式，多肽由與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的氨基酸序列組成。根據(jù)更優(yōu)選的實施方式，多肽由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3組成。
[0078]至少一種多肽包含由基因工程獲得或由檀香植物或其它植物種類中天然發(fā)現(xiàn)的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的變種氨基酸序列。換句話說，當變體多肽是通過基因工程獲得時，所述多肽包含通過修飾SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列獲得核苷酸序列編碼的氨基酸序列。根據(jù)更優(yōu)選的實施方式，具有檀香萜合酶活性的該至少一種多肽由通過基因工程獲得的SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的變體的氨基酸序列組成，即，通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列獲得的核苷酸序列編碼的氨基酸序列。
[0079]根據(jù)另一實施方式，多肽是從檀香種類的植物中，優(yōu)選白檀中分離出來的。
[0080]此處所使用的多肽指的是含有此處確定的氨基酸序列的多肽或肽片段、以及截短的或變體多肽，條件是它們保持如上定義的活性，而且它們與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3的相應片段有至少所定義百分比的同一性。
[0081]變體多肽的實例是由選擇性mRNA剪接或此處所述形成多肽蛋白酶剪切而得到的天然產(chǎn)生的蛋白質(zhì)?？蓺w因于蛋白水解的變體包括，例如，當在不同類型的宿主細胞中表達時，由于從本發(fā)明多肽上蛋白水解去移除一個或多個末端氨基酸而導致在N-或C-末端的差異。如其后所描述本發(fā)明還包含用由本發(fā)明核酸的天然或人工突變而獲得的核酸編碼的多肽。 [0082]由額外的肽序列在氨基和羧基末端融合而產(chǎn)生的多肽變體也包含于本發(fā)明的多肽之中。尤其是這樣的融合可以在期望的環(huán)境或表達系統(tǒng)中提高多肽的表達，利于蛋白質(zhì)的提純或多肽酶活性的改善。這種額外的肽序列可以例如為信號肽。因此，本發(fā)明包括本發(fā)明的多肽變體，例如通過與其它寡肽或多肽融合而獲得的多肽變體和/或與信號肽連接的那些多肽變體。本發(fā)明的多肽還可以包括由與另外的功能蛋白(例如來源于萜生物合成路徑的另外的蛋白質(zhì))融合而產(chǎn)生的多肽。
[0083]如上所述，編碼本發(fā)明多肽的核酸是修飾在體內(nèi)進行該方法時意欲使用的非人宿主生物體或細胞的有效手段。
[0084]因此，編碼任何上述實施方案所述的多肽的核酸也是本發(fā)明的一個目的。
[0085]根據(jù)優(yōu)選的實施方案，該核酸包含與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一'丨生的核苷酸序列。根據(jù)更加優(yōu)選的實施方案,該核酸包含核苷酸序列SEQ ID N0:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列。
[0086]根據(jù)另一優(yōu)選的實施方案，該核酸由與SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少55%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少65%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少75%、優(yōu)選至少80%、優(yōu)選至少85%、優(yōu)選至少90%、更優(yōu)選至少95%甚至更加優(yōu)選至少98%同一性的核苷酸序列組成。根據(jù)更加優(yōu)選的實施方案，該核酸由SEQ ID NO: 2、SEQ IDNO:4或它們的互補序列組成。
[0087]根據(jù)又一實施方式，該核酸是從檀香種類植物中，優(yōu)選從白檀中分離出來的。
[0088]本發(fā)明的核酸可以定義為包括單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物(DNA和/或RNA)。術語“核苷酸序列”也應該被理解為包含分離片段形式或作為較大核酸組分的聚核苷酸分子或寡核苷酸分子。本發(fā)明的核酸還包含某些分尚的核苷酸序列，其包括基本上無污染內(nèi)源材料的那些核苷酸序列。本發(fā)明的核酸可以是截短的，條件是其編碼本發(fā)明包含的如上所述的多肽。
[0089]本發(fā)明的核酸可以是檀香物種或其它物種植物中天然存在的，也可以通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO: 4或它們的互補序列獲得。優(yōu)選所述核酸由通過修飾SEQ ID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列獲得的核苷酸序列組成。
[0090]本發(fā)明也包括包含由SEQ ID NO:2,SEQ ID N0:4或它們的互補序列突變而獲得的序列的核酸，條件是該序列與SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4或它們互補序列的相應片段有至少所定義百分比的同一性，并且它們編碼如上任何實施方案所定義的具有檀香萜合酶活性的多肽。突變可以是這些核酸任何種類的突變，如點突變、缺失突變、插入突變和/或移碼突變?？梢灾苽渥凅w核酸以便使其核苷酸序列適應特異性表達系統(tǒng)。例如，已知細菌的表達系統(tǒng)在由優(yōu)選的密碼子編碼氨基酸時更有效地表達多肽。由于該遺傳密碼的簡并性，其中多于一個的密碼子可以編碼相同的氨基酸，多個DNA序列可以編碼相同的多肽，本發(fā)明包含所有這些DNA序列。
[0091]另一個用于轉(zhuǎn)化適于在體內(nèi)實施本發(fā)明方法的宿主生物體或細胞的重要工具是包括本發(fā)明任何實施方案的核酸的表達載體。因此這種載體也是本發(fā)明的一個目的。
[0092]如此處所使用的“表達載體”包括任何直線的或環(huán)狀的重組載體，其包括但不限于病毒載體、曬菌體和質(zhì)粒。技術人員能夠根據(jù)表達系統(tǒng)選擇適合的載體。在一個實施方案中，該表達載體包括本發(fā)明的核酸，其可操作地連接到至少一種控制轉(zhuǎn)錄、翻譯、開始和終止的調(diào)節(jié)序列，如轉(zhuǎn)錄的啟動子、操縱子或增強子，或mRNA核糖體的結(jié)合部位，并且非強制選擇地包括至少一種選擇標記。當該調(diào)節(jié)序列功能上與本發(fā)明的核酸相關時，該核苷酸序列是“可操作地連接的”。
[0093]本發(fā)明的表達載體可在如下進一步公開的用于在包含本發(fā)明核酸的宿主生物體和/或細胞中制備遺傳轉(zhuǎn)化的宿主生物體和/或細胞的方法和生產(chǎn)具有β-檀香萜合酶活性的多肽的方法中使用。
[0094]經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含本發(fā)明至少一種核酸以便使其異源表達或過表達本發(fā)明至少一種多肽的重組非人宿主生物體和細胞也是實施本發(fā)明方法的十分有用的手段。因此，這種非人宿主生物體和細胞是本發(fā)明的另一個目的。
[0095]任何上述實施方案所述的核酸都可用于轉(zhuǎn)化該非人宿主生物體和細胞并且所表達的多肽可以是任何上述的多肽。
[0096]本發(fā)明的非人宿主生物體可以是任何非人的多細胞或單細胞生物體。在優(yōu)選的實施方案中，該非人宿主生物體是植物、原核生物或真菌。根據(jù)本發(fā)明任何植物、原核生物或真菌都是適合于轉(zhuǎn)化的。特別有用的植物是天然產(chǎn)生高數(shù)量萜的植物。在更優(yōu)選的實施方案中，該植物選自茄科、禾本科、十字花科、蝶形花科、錦葵科、菊科或唇形科類。例如，該植物選自煙草屬、茄屬、高粱屬、擬南芥屬、蕓苔屬(油菜)、苜蓿屬(紫花苜蓿)、棉屬(棉花)、蒿屬、鼠尾草屬和薄荷屬。優(yōu)選地，該植物屬于煙草種。
[0097]在更優(yōu)選的實施方案中，該非人宿主生物體是微生物。任何微生物都適合于本發(fā)明，但是根據(jù)更加優(yōu)選的實施方案，所述微生物是細菌或酵母。最優(yōu)選，所述細菌是大腸桿菌，而所述酵母是釀酒酵母。
[0098]還可以將分離的高等真核細胞轉(zhuǎn)化以代替完整的生物體。作為高等真核細胞，這里我們是指除酵母細胞之外的任何非人真核細胞。優(yōu)選的高等真核細胞是植物細胞或真菌細胞。
[0099] 術語“經(jīng)轉(zhuǎn)化”是指宿主經(jīng)過遺傳工程以便使其包含上述任何實施方案中所需要的每個核酸的一個、兩個或更多個拷貝。優(yōu)選地，術語“經(jīng)轉(zhuǎn)化”涉及異源表達由該核酸編碼的多肽(該多肽使用所述核酸轉(zhuǎn)化)以及過表達所述多肽的宿主。因此，在實施方案中，本發(fā)明提供了經(jīng)轉(zhuǎn)化的生物體，其中該多肽的表達量高于未經(jīng)如此轉(zhuǎn)化的相同生物體的表達量。
[0100]現(xiàn)有技術中已知有多種方法用于生成轉(zhuǎn)基因宿主生物體或細胞，如植物、真菌、原核生物或高等真核細胞的培養(yǎng)物。適用于細菌、真菌、酵母、植物和哺乳動物細胞宿主的克隆和表達載體的描述參見，例如，Pouwels等的Cloning Vectors:A LaboratoryManual, 1985, Elsevier, New York 和 Sambrook 等的 Molecular Cloning:A LaboratoryManual,第二版，1989，Cold Spring Harbor Laboratory Press。尤其用于高等植物和/或植物細胞的克隆和表達載體是技術人員可以得到的。參見例如Schardl等的Gene61:1-11, 1987。
[0101]轉(zhuǎn)化宿主生物體或細胞以使其包含轉(zhuǎn)基因核酸的方法為技術人員所熟知。對于生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因植物，例如通用的方法包括:植物原生質(zhì)體的電穿孔法、脂質(zhì)體介導的轉(zhuǎn)化法、土壤桿菌介導的轉(zhuǎn)化法、聚乙二醇介導的轉(zhuǎn)化法、粒子轟擊法、植物細胞的顯微注射法和應用病毒的轉(zhuǎn)化法。
[0102]在一個實施方案中，經(jīng)轉(zhuǎn)化的DNA被整合到非人宿主生物體和/或細胞的染色體中，從而得到穩(wěn)定的重組體系統(tǒng)?，F(xiàn)有技術中任何公知的染色體整合方法可以應用于本發(fā)明的實踐中，包括但不限于重組酶介導的盒式交換(RMCE)、病毒位點特異性染色體插入法、腺病毒法和核內(nèi)注射法。
[0103]為了在體外實施如上所述生產(chǎn)檀香萜的方法，提供一種制備如本發(fā)明任何實施方案所述的至少一種具有β_檀香萜合酶活性的多肽的方法是非常有利的。因此，本發(fā)明提供一種本發(fā)明任何實施方案所述的至少一種多肽的生產(chǎn)方法，該方法包括:
[0104]a)培養(yǎng)用本發(fā)明表達載體轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細胞，以便使其包含本發(fā)明的核酸并且表達或過表達本發(fā)明的多肽；
[0105]b)從步驟a)中培養(yǎng)的非人宿主生物體或細胞中分離該多肽。
[0106]根據(jù)優(yōu)選實施方案，所述方法還包含在步驟a)之前，用本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細胞，以便使其包含本發(fā)明的核酸并且表達或過表達本發(fā)明的多肽。
[0107]可以使用任何上述實施方案所述的核酸。
[0108]可以用如上所述在體內(nèi)生產(chǎn)β_檀香萜的方法來轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)該非人宿主生物體或細胞?？墒褂帽绢I域公知的任何技術從生物體或細胞中分離出特定多肽以實施步驟b)。
[0109]“多肽變體”這里指的是這樣一種多肽，其具有β -檀香萜合酶活性且基本上與任何上述實施方案的多肽同源，但是其具有的氨基酸序列因為一處或多處缺失、插入或取代而不同于由本發(fā)明任一核酸序列所編碼的氨基酸序列。
[0110]變體可以包含保守取代序列，意味著某一特定氨基酸殘基被一具有類似理化特性的殘基所取代。保守取代的實例包括:用一個脂肪族殘基取代另一個脂肪族殘基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之間相互取代；或者用一個極性殘基取代另一個極性殘基，例如在Lys和Arg之間、Glu和Asp之間或Gln和Asn之間相互取代。參見Zubay, Biochemistry, 1983, Addison-ffesley Pub.C0.。這類取代的效果可以用取代打分矩陣，如Altschul, J.Mol.Biol.，1991，219，555-565 中所述的 PAM-120, PAM-200 和 PAM-250 來計算。其他這類保守取代，例如具有近似疏水特性的完整區(qū)域的取代，已為本領域熟知。
[0111]天然生成的肽變體也包含在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種變體的實例是由于選擇性mRNA剪接或者本文所述多肽的蛋白酶剪切而得到的蛋白質(zhì)。蛋白水解引起的變體包括，例如，在不同類型宿主細胞中表達時，由本發(fā)明序列編碼的多肽由于蛋白水解移除了一個或多個末端氨基酸而導致N-或C-末端的差異。
[0112]本發(fā)明多肽的變體可以用于獲得例如期望的增強的或減弱的酶活性、改性的區(qū)域化學(regiochemistry)或立體化學、或者改變的底物利用或者產(chǎn)物分布、增加了親和力的底物、改進了特異性的一種或多種目標化合物的生產(chǎn)方法、酶反應速率的增加、在特定環(huán)境(pH、溫度、溶劑等等)中的更高活性或穩(wěn)定性、或者在目標表達系統(tǒng)中的改進的表達水平。變體或定位突變體可以通過現(xiàn)有技術已知的任何方法來生成。天然多肽的變體和衍生物能夠通過分離其它或相同植物品系或物種(例如，來自檀香屬物種的植物)的天然產(chǎn)生的變體或者變體的核苷酸序列來獲得，或者通過對編碼本發(fā)明多肽的核苷酸序列進行人工規(guī)劃突變來獲得。天然氨基酸序列的改變可通過多種傳統(tǒng)方法中的任一種完成。
[0113]由附加肽序列在本發(fā)明多肽的氨基和羧基末端融合產(chǎn)生的多肽變體可被用于增強多肽的表達，在期望的環(huán)境或表達系統(tǒng)中利于蛋白的純化或提高多肽的酶活性。這種附加肽序列例如可為信號肽。因此，本發(fā)明包含本發(fā)明多肽的變體，例如通過與其它寡肽或多肽和/或連接到信號肽上的多肽融合獲得的那些變體。包含在本發(fā)明范圍內(nèi)的融合多肽還包含由融合其它功能蛋白質(zhì)如來自萜生物合成路徑的其它蛋白質(zhì)而產(chǎn)生的融合多肽。
[0114]因此，在實施方案中，本發(fā)明提供一種如在上述任何實施方案中所述的具有β -檀香萜合酶活性的變體多肽的制備方法，該方法包括步驟:
[0115](a)選擇如上公開的任何實施方案的核酸；
[0116](b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸；
[0117](c)用突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞或單細胞生物以表達用該突變核酸序列編碼的多肽；
[0118](d)按照至少一種修飾的性質(zhì)篩選該多肽；和，
[0119](e)非強制選擇地，如果該多肽不具有期望的變體檀香萜合酶活性，則重復步驟(a)至(d)直到獲得具有所期望的變體β_檀香萜合酶活性的多肽；
[0120](f)非強制選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所期望的變體β -檀香萜合酶活性的多肽，則分離在步驟(C)中獲得的相應突變核酸。
[0121]根據(jù)優(yōu)選實施方式，制備的變體多肽能夠生產(chǎn)倍半萜，其中β_檀香萜占生產(chǎn)的倍半萜的至少20%、優(yōu)選至少30%、優(yōu)選至少35%。
[0122]在步驟(b)中，例如通過隨機誘變，位點特異性誘變或DNA改組方法可生成大量的突變核酸序列?；蚋慕M的詳細的步驟可在Stemmer的DNA shuffling by randomfragmentation and reassembly:in vitro recombination for molecular evolution.ProcNatl Acad Sci USA.，1994，91 (22): 10747-1075中發(fā)現(xiàn)?？傊?，DNA改組指的是已知序列在體外的隨機重組的方法，其包括選擇至少兩種核酸用于重組。例如能夠通過合成含有突變序列的寡聚核苷酸在特定位點引入突變，與能夠連接到天然序列片段的限制性位點側(cè)面相連。連接之后，得到的重構(gòu)序列編碼具有期望的氨基酸插入、置換或缺失的類似物。另外，可使用寡聚核苷酸-定位位點特異性誘變步驟以提供改變的基因，其中預先確定的密碼子可通過置換、缺失或插入來改變。
[0123]因 此，包含SEQ ID NO:1的多肽可與任何其它編碼核酸的倍半萜合酶例如從除白檀之外的有機體中分離出來的倍半萜合酶進行重組。因此，可獲得并分離出突變核酸，其可根據(jù)例如本實施例公開的標準步驟來轉(zhuǎn)化宿主細胞。
[0124]在步驟(d)中，對步驟(C)中獲得的多肽進行至少一種修飾的特性例如期望改變的酶活性的篩選。對表達的多肽進行活性篩選所期望的酶活性的實例包括由Km或Vmax值度量的增強或減弱的酶活性、修飾的區(qū)域化學或立體化學、和改變的底物利用或產(chǎn)物分布。酶活性的篩選可根據(jù)本領域的技術人員熟知的步驟以及在本實施例中公開的步驟來實施。
[0125]提供步驟(e)以重復步驟(a)~(d)的過程，優(yōu)選其可平行操作。因此，通過生成大量的突變核酸，可同時用不同的突變核酸將多個宿主細胞轉(zhuǎn)化，使較多數(shù)量的多肽進行隨后的篩選。因此獲得期望的多肽變體的機會隨技術人員意愿增加。
[0126]本申請中提及的所有出版物均以參照的方式并入于此，以公開并描述與所引用出版物有關的方法和/或材料。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0127]圖1:由來自白檀(SaSantS)的重組檀香萜合酶生產(chǎn)的倍半萜的GC-MS分析。
[0128]圖1(1):總離子色譜圖。1:α-檀香萜；2:反式-α-佛手柑油烯；3:表_β_檀香萜；4: β -檀香萜；5: β -法呢烯
[0129]圖1 (2) -圖1 (4):確認為倍半萜的峰值的質(zhì)譜
[0130]圖2: β -檀香萜和β -檀香醇的分子結(jié)構(gòu)。
【具體實施方式】
[0131 ] 現(xiàn)在將通過下列實施例進一步詳細地描述本發(fā)明。
[0132]實施例1
[0133]萜合酶相關序列的DNA文庫構(gòu)建、測序和提取
[0134]將從白檀(五周齡)無菌發(fā)芽的種子獲得的幼下胚軸段用于誘導愈傷組織形成。白擅的種子由 B&T World Seeds (Aigues-Vives,法國)和 Sandeman Seeds (Lalongue,法國)處獲得。首先將種子在2.5% HClO中表面消毒120分鐘，并且在無菌的超純水中清洗三次。然后將種子去殼并置于添加了 15g/L蔗糖和7.8g/L瓊脂，pH為5.7的MS基礎培養(yǎng)基(Murashige&Skoog, 1962，Physiologia Plantaruml5, 473-497)上。通常在9-18天后發(fā)芽，發(fā)芽率大約40%。在27°C的，陰涼、白色螢光以及16小時的光照周期的培養(yǎng)室內(nèi)使幼芽離體生長2-3個月。將下胚軸段切成3-4mm橫向段，并將其置于在陪替氏培養(yǎng)皿中添加了 0.5 μ M2，4D (2，4-二氯苯氧基乙酸，Sigma-Aldrich C0.)和10 μ MKin (細胞分裂素，Sigma-Aldrich C0.)的 Gbg 基礎培養(yǎng)基(Gamborg&al, 1968, Exp CellRes.50(1)，151-158)上，以誘導綠色愈傷組織的形成。通過每四周將所述組織轉(zhuǎn)移到陪替氏培養(yǎng)皿中的新培養(yǎng)基上來維持愈傷組織的生長。所有的愈傷組織培養(yǎng)均在生長室內(nèi)并在上述相同條件下進行。
[0135]將在含有5 μ M Kin和2mM ACC的Gbg培養(yǎng)基中培養(yǎng)I個月后獲得的愈傷組織用于RNA 的提取和 cDNA 文庫的構(gòu)建。按照 Lefort 和 Douglas (Ann.For.Sc1.56 (1999)，259-263)所述的步驟提取總RNA，只是省略了 RNA酶處理。在200 μ I不含RNA酶的水中將提取物再懸浮，并以20000g將其離心兩次，每次10分鐘以除去多糖。從2.2g的細胞中獲得大約
125 μ g總RNAo根據(jù)制造商手冊使用FastTrack? 2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen)純化 mRNA,和使用 S MART* PCR cDMA 合成試劑盒(Clontech Laboratories, Inc.)生成cDNA文庫。
[0136]將由Illumina(San Diego, California)開發(fā)的小DNA片段的大規(guī)模并行測序技術用于整個cDNA文庫的測序。制備用于測序DNA,通過Fasteris SA (P I an-1 e s-Ouat e s,瑞士)實施對read(讀出序列)的測序和組裝。cDNA文庫用如下基因組樣本制備試劑盒(Illumina)進行處理并在Genome Analyzer system(Illumina)上進行測序?？偣搏@得了
4.03 X IO6的35bp序列(read)。這些read使用EDENA2.1.1進行拼接，該軟件用于發(fā)現(xiàn)read 間重疊和拼接從頭重疊群(de novo contig) (Hernandez 等，De novo bacterial genomesequencing!Millions of very short reads assembled on a desktop computer.GenomeRes.2008 ; 18:802 - 809)。使用最小匹配26-20堿基進行拼接。在排除短于100堿基的contig后，根據(jù)用于拼接所選擇的參數(shù)得到最大長度為1331-1914的1983-3473個獨特的contig。另一拼接使用 Velvetl.0 程序(Zerbino and Birney (2008), Velvet: algorithmsfor de novo short read assembly using de Bruijn graphs.Genome Res.18 (5), 821-829)進行，得到100-1616之間的堿基長度的5905個獨特contig。
[0137]使用Blastx 算法(Altschul 等,J.Mol.Biol.215, 403-410，1990 ；http://www.ncb1.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi)將所有產(chǎn)生的contig與蛋白序列數(shù)據(jù)庫(非冗余蛋白序列，NCBI, http://www.ncb1.nlm.nih.gov)比較。將顯示出與植物倍半職合酶具有顯著的序列同源性的這些contig保留下來。總共選出具有100-621個堿基長度的46個contig。隨后使用 CAP 程序(Huang, Genomicsl4 (I), 18-25，1992)處理這些 contig 以拼接和生成更長的序列。5個445-1064長度的獨特的contig由此被拼接出來。推定的氨基酸序列顯示出與植物萜合酶，特別是與記載或注釋作為單萜合酶的序列，具有顯著同源性。這些氨基酸序列的比對 顯示存在至少2條不同的cDNA(在整個序列比對中絕大多數(shù)位置上都發(fā)現(xiàn)了這兩條序列)。該序列比對還顯示存在至少一個N-末端和一個C-末端序列。為了獲得全長序列以及為每一條cDNA定位確切的5’ -末端和3’ -末端序列，使用了 cDNA末端快速擴增(RACE)實驗。
[0138]實施例2
[0139]萜合酶cDNA的全長序列的擴增
[0140]從如上所述的5個contig的一個設計一系列引物用于RACE實驗。因此，根據(jù) SCH5-contig-5(SEQ ID NO: 5)得出了正向引物 SCH5_Ct58_Rl (SEQ ID NO:6)和SCH5-Ct58-R2 (SEQ ID NO: 7)和反向引物 SCH5_Ct58_F3 (SEQ ID NO: 8)和 SCH5_Ct58_F4 (SEQID NO:9)。
[0141]使用通用混合引物(UPM) (SMART? RACE cDNA擴增試劑盒，ClontechLaboratories, Inc.)進行 PCR，在 50 μ I 最終體積中含 200 μ M 混合 dNTP、5 μ I cDNA 文庫(實施例1)、0.2 μ M 基因特定引物、0.2 μ M UPM 混合引物(Clontech Laboratories, Inc.)、I μ I Advantage2 混合聚合酶(Clontech Laboratories, Inc.)和 5μ IlOx cDNA PCR 反應緩沖液(Clontech Laboratories, Inc.)。熱循環(huán)條件如下:94°C下3分鐘；94°C下30秒和72°C下3分鐘，5個循環(huán)；94°C下30秒和70°C下3分鐘，5個循環(huán)；94°C下30秒和68°C下3分鐘，5個循環(huán)；72°C下3分鐘。使用5’ RACE，獲得了包括5’末端的cDNA的610bp DNA片段(SCH5-Ct58_RRl, SEQ ID NO: 10)。使用 3’RACE，獲得了 1049bp 片段(SCH5_Ct58-RF4, SEQ10勵:11)，并且具有5015-(301^丨8-5序列(SEQ ID NO:5)的兩個RACE產(chǎn)物的結(jié)合重組為一個新的全長 cDNA(SCH5-Ct58, SEQ ID NO: 12)。2157bp SCH5_Ct58cDNA 編碼 569 個氨基酸蛋白(SEQ ID NO: 13)，該蛋白顯示出與植物萜合酶序列有同源性，并且含有萜合酶特征的基序(例如存在于所有單萜和倍半萜合酶中的DDxxD基序)。有趣的是與倍半萜合酶相比該蛋白顯示出與單萜合酶更高的相似性。然而，葉綠體肽信號(植物單萜合酶中常見特征)的存在不能從 N-末端序列的分析(EmanueIsson, 0., Nielsen, N.和 von Hei jne, G.1999.ChloroP, a neural network-based method for predicting chloroplast transit peptidesand their cleavage sites.Protein Science8, 978-984)中預測得到。
[0142]實施例3
[0143]SCH5~Ct58的異源表汰和體外酶活件
[0144]我們決定對SCH5-Ct58 (SEQ ID NO: 12)的DNA序列進行修飾并且重新設計該序列以獲得在大腸桿菌細胞中最佳的異源表達。以真實的氨基酸序列為起始，首先必須在cDNA文庫中建立SCH5-Ct58的確切的核苷酸序列。使用Eland軟件(Illumina)以最大2個錯配來提取與SCH5-Ct58序列(SEQ ID NO: 12)匹配的所有read?？偣不謴土?5224個read,并且使用 CAP 程序(Huang, GenomicsH(I)，18-25，1992)以 SCH5_Ct58DNA 序列(SEQ IDNO: 12)作為參照進行比對。整個序列的平均覆蓋率高于100X，這使得明確地推定出新cDNA序列SCH5-Ct94(SEQ ID NO: 14) 。在這個新的序列中，與從RACE結(jié)果推定的SCH5_Ct58序列(SEQ ID NO: 12)相比訂正了 5個堿基，并且那些訂正得出了具有兩個殘基差異的新的氨基酸序列(SCH5-Ct94, SEQ ID NO: 15)。對于異源表達來說，SCH5_Ct94(SEQ ID NO: 14)的DNA序列被修飾以移去了第一個23位密碼子并且用ATGGCT序列取代，并且改變該密碼子使用以優(yōu)化用于大腸桿菌表達的序列(DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)。由此設計出的cDNA(SCH5-Ct94-opt, SEQ ID NO:2)被合成(DNA2.0, Menlo Park, CA, USA)并被亞克隆到pETDuet-Ι質(zhì)粒的Nde1-KpnI位點，獲得質(zhì)粒Ct94_pETDuet。這種優(yōu)化后的cDNA序列編碼多肽 SCH5-Ct94-opt (SEQ ID NO:1) ?
[0145]使用質(zhì)粒Ct94_pETDuet在大腸桿菌BL21 (DE3)細胞中來實施Ct94的異源表達。體外酶的測定使用FPP作為底物在上述條件下進行，并且倍半萜合酶活性上觀測到5種倍半萜的混合物的形成。以白檀的倍半萜特征:α-檀香萜、反式-α-佛手柑油烯、表-β-檀香萜、檀香萜和法呢烯(圖1)，通過GC-MS確認這些倍半萜的同一性。在ρΗ7.0和15mM MgCl2的存在下，重組倍半萜產(chǎn)物的相對比例為:38.0%的α -檀香萜、18.2%的反式-α-佛手柑油烯、5.7%的表-β-檀香萜、36.7%的β-檀香萜和1.3%的β-法呢烯。因此SCH-Ct98-opt cDNA編碼β -檀香萜合酶。產(chǎn)物的比例與用作這些倍半萜的羥化產(chǎn)物的檀香油中觀察到的比例非常相似。當省略MgCl2并且在培養(yǎng)基上添加2.5mM EDTA (以螯合剩余陽離子)時沒有檢測到任何活度，這表明二價陽離子是必要條件。存在于檢測中的二價陽離子的性質(zhì)和濃度對于產(chǎn)物分布有影響(表1)。例如，降低Mg2+的濃度對于β-檀香萜有有利影響，最終成為酶的主要產(chǎn)物。此外，Mn2+的添加對于β-檀香萜的形成有不利影響，因為檀香萜倍半萜產(chǎn)物的比例降低并且反式-α -佛手柑油烯和β -法呢烯的比例增加，反式-α -佛手柑油烯為ImM MgCl2存在下酶的主要產(chǎn)物。
[0146]表1:Μ產(chǎn)和Mr^離子的濃度對用FPP接觸SEQ ID NO:1獲得的倍半萜混合物的組合物的作用
【權利要求】
1.一種生產(chǎn)β-檀香萜的方法，包含: a)使FPP與至少一種具有β-檀香萜合酶活性的多肽接觸，該多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列； b)非強制選擇地，分離在步驟a)中產(chǎn)生的β_檀香萜。
2.權利要求1所述的方法，其中步驟a)包含在有利于生產(chǎn)檀香萜的條件下培養(yǎng)能夠生產(chǎn)FPP并且經(jīng)轉(zhuǎn)化以表達至少一種多肽的非人宿主生物體或細胞，其中該多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。
3.權利要求2所述的方法，其中該方法還包含在步驟a)之前用至少一種編碼多肽的核酸將能夠生產(chǎn)FPP的非人生物體或細胞轉(zhuǎn)化以使所述生物體表達所述多肽，該多肽包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列并且具有β -檀香萜合酶活性。
4.權利要求3所述的方法，其中所述至少一種編碼β-檀香萜合酶的核酸包含與SEQID NO:2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少90%同一'丨生的核苷酸序列。
5.權利要求2~4中任一項所述的方法，其中非人宿主生物體為植物、原核生物或真菌。
6.權利要求5所述的方法，其中非人宿主生物體為微生物，優(yōu)選細菌或酵母。
7.權利要求6所述的方法，其中所述細菌為大腸桿菌并且所述酵母為釀酒酵母。
8.具有β-檀香萜合酶活性并且包含與SEQ ID NO:1或SEQ ID NO: 3有至少50%同一性的氨基酸序列的多肽。
9.編碼權利要求8所述的多肽的核酸。
10.權利要求9所述的核酸，其包含與SEQID NO: 2、SEQ ID NO:4或它們的互補序列有至少50%、優(yōu)選至少60%、優(yōu)選至少70%、優(yōu)選至少90%同一性的核苷酸序列。
11.表達載體，其包含權利要求9或10所述的核酸。
12.經(jīng)轉(zhuǎn)化以包含至少一種權利要求9或10所述的核酸的非人宿主生物體或細胞，從而其異源表達或過表達至少一種權利要求8所述的多肽。
13.權利要求12所述的非人宿主生物體，其中所述非人宿主生物體為植物、原核生物或真菌。
14.權利要求13所述的非人宿主生物體，其中所述非人宿主生物體為微生物，優(yōu)選細菌或酵母。
15.權利要求14所述的非人宿主生物體，其中所述細菌為大腸桿菌并且所述酵母為釀酒酵母。
16.—種生產(chǎn)至少一種權利要求8所述的多肽的方法，包含: a)培養(yǎng)用權利要求11所述表達載體轉(zhuǎn)化的非人宿主生物體或細胞，以便使其包含權利要求9或10所述的核酸并且表達或過表達權利要求8所述的多肽； b)從在步驟a)中培養(yǎng)的非人宿主生物體或細胞中分離該多肽。
17.權利要求16所述的方法，其進一步包含在步驟a)之前，用權利要求11所述的表達載體轉(zhuǎn)化非人宿主生物體或細胞，以便使其包含權利要求9或10所述的核酸并且表達或過表達權利要求8所述的多肽。
18.一種制備具有β_檀香萜合酶活性的變體多肽的方法，該方法包含步驟: (a)選擇權利要求9或10所述的核酸； (b)修飾所選擇的核酸以獲得至少一種突變核酸； (c)用突變核酸序列轉(zhuǎn)化宿主細胞或單細胞生物體以表達用該突變核酸序列編碼的多肽； (d)按照至少一種修飾的性質(zhì)篩選該多肽；和， (e)非強制選擇地，如果該多肽不具有期望的變體β_檀香萜合酶活性，則重復步驟(a)至(d)直到獲得具有所期望的變體檀香萜合酶活性的多肽； (f)非強制選擇地，如果在步驟(d)中鑒別出具有所期望的變體β_檀香萜合酶活性的多肽，則分離在步驟 (C)中獲得的相應突變核酸。
【文檔編號】C12N15/70GK104004789SQ201410177104
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2009年12月9日 優(yōu)先權日:2008年12月11日
【發(fā)明者】M·沙爾克 申請人:弗門尼舍有限公司