一種提高井岡霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種提高井岡霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法。該方法采用將孢子懸浮液進(jìn)行菌種活化與平板培養(yǎng)，制成孢子活化液，再將孢子活化液接種于種子培養(yǎng)基中進(jìn)行初步培養(yǎng)，得到種子培養(yǎng)液，再將種子培養(yǎng)液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，并將發(fā)酵一定時間的培養(yǎng)液取上清液滅菌后加入發(fā)酵培養(yǎng)基中，實現(xiàn)井岡霉素的發(fā)酵生產(chǎn)。本發(fā)明所述的方法在不加大能耗的前提下，獲得了較高的井岡霉素產(chǎn)量，縮短了發(fā)酵周期，降低了生產(chǎn)成本，在工業(yè)化生產(chǎn)中具有較大的應(yīng)用價值。
【專利說明】一種提高井網(wǎng)霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種生物【技術(shù)領(lǐng)域】的微生物發(fā)酵方法，具體是一種提高井R霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法。
【背景技術(shù)】
[0002]井R霉素又稱有效霉素，是一種安全高效的抗真菌抗生素。目前在我國以及東南亞各主要糧食產(chǎn)區(qū)，井R霉素作為一種優(yōu)質(zhì)農(nóng)藥在防治水稻、玉米以及小麥紋枯病方面取得了顯著的成效。另外，作為合成抗糖尿病臨床藥物阿卡波糖(拜糖平)和伏格列波糖(倍欣)的重要原料，井R霉素的發(fā)酵生產(chǎn)在醫(yī)藥領(lǐng)域也受到了廣泛關(guān)注。目前工業(yè)化發(fā)酵采用的菌株是上海農(nóng)藥所報道的吸水鏈霉菌5008變種(Sirepio焊Ce1S hygroscopi cus var.jinggangensis 5008 )，盡管自70年代開始該菌株使用已有近40年，但其代謝產(chǎn)物井岡霉素仍是最為有效、應(yīng)用面積最廣的農(nóng)用抗生素。
[0003]微生物的群體感應(yīng)(Quorum sensing, QS)也稱為自誘導(dǎo),最初是指細(xì)菌調(diào)節(jié)自身菌體密度的一種環(huán)境感應(yīng)系統(tǒng)。通過擴(kuò)散性信號小分子(又稱為自誘導(dǎo)物)與轉(zhuǎn)錄活化蛋白的相互作用而打開與細(xì)胞群體密度有關(guān)的基因表達(dá)。這些信號分子從細(xì)菌細(xì)胞擴(kuò)散到環(huán)境中，一旦達(dá)到一個臨界濃度(或者說達(dá)到某一特定的群體密度)，這些信號分子就可誘導(dǎo)調(diào)節(jié)一系列目標(biāo)基因的轉(zhuǎn)錄，可調(diào)節(jié)的功能包括抗生素的生物合成、穩(wěn)定期的進(jìn)入等。目前，已在許多革蘭氏陽性菌和陰性菌中發(fā)現(xiàn)群體感應(yīng)系統(tǒng)可調(diào)控許多基因的表達(dá)。
[0004]經(jīng)文獻(xiàn)查閱發(fā)現(xiàn)為提高井R霉素的產(chǎn)量人們也做了廣泛研究，從優(yōu)良菌種選育、培養(yǎng)及優(yōu)化到發(fā)酵條件控制和產(chǎn)品的分離純化，都取得了卓越的成果。中國發(fā)明申請?zhí)?00610112671.2 (循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)井網(wǎng)霉素的方法)，公開了一種循環(huán)發(fā)酵生產(chǎn)井網(wǎng)霉素的新方法。中國發(fā)明申請?zhí)?01010173832.5 (井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法)，公開了一種生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】的井R霉素發(fā)酵生產(chǎn)方法，該方法在不加大能耗的前提下，縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，獲得較高的井R霉素產(chǎn)量。中國發(fā)明申請?zhí)?01110088294.4 (—種提高井岡霉素發(fā)酵水平的生產(chǎn)方法)，公開了一種提高井R霉素發(fā)酵水平的生產(chǎn)方法，明確了碳源的品種、補(bǔ)入時機(jī)和補(bǔ)入方式，根據(jù)碳源不同的補(bǔ)入量，把發(fā)酵周期延長，較大幅度地提高井岡霉素的發(fā)酵水平。中國發(fā)明申請?zhí)?01310010562.X (—種高效節(jié)能的井R霉素發(fā)酵方法)，公開了一種高效節(jié)能的井R霉素發(fā)酵方法。而這些研究也表明，在現(xiàn)有的高效發(fā)酵基礎(chǔ)上，再靠這些方面的技術(shù)操作來提高井R霉素產(chǎn)量，其提升空間就比較有限。
[0005]前人研究顯示，通過向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加發(fā)酵上清液，利用群體感應(yīng)的方法可提高菌核青霉發(fā)酵過程中核叢青霉素的產(chǎn)量。因此，在現(xiàn)有的發(fā)酵水平的基礎(chǔ)上，控制成本能耗的前提下，若能通過發(fā)酵液回添，在發(fā)酵過程中提前添加內(nèi)源群體感應(yīng)信號分子，刺激細(xì)胞之間的感應(yīng)作用，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，從而實現(xiàn)相關(guān)次級代謝廣物的廣量提聞，將為提聞井R霉素的廣量提供一種新的思路。
[0006]參考文獻(xiàn)
Raina S， Odell Mj Keshavarz T.Quorum sensing as a method for improvingsclerotiorin production in Penic i11ium sc Ierotiorum [J].Journal ofbiotechnology, 2010, 148(2): 91-98。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0007]本發(fā)明在現(xiàn)有的發(fā)酵技術(shù)基礎(chǔ)上，通過向發(fā)酵液中添加前一批發(fā)酵上清液，利用群體感應(yīng)現(xiàn)象，使細(xì)胞群體感應(yīng)分子的數(shù)量快速達(dá)到啟動次級代謝的閾值，提前進(jìn)入發(fā)酵穩(wěn)定階段，以提高井R霉素的發(fā)酵效率及產(chǎn)量。該方法在控制能耗的前提下，縮短了發(fā)酵周期，提高了設(shè)備利用率，獲得較高的井R霉素產(chǎn)量，降低了生產(chǎn)成本，在未來的工業(yè)化生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用價值。
[0008]本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的。
[0009]提高井R霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法包括如下步驟:
第一步，將_80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體產(chǎn)孢培養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，并于37°C培養(yǎng)5-8 d后取平板表面覆蓋的孢子，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權(quán)專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網(wǎng)變種5008菌株，Strep tomyces hygroscopi cus var.jinggangensi s 5008,屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ； 第二步，將孢子活化液與種子培養(yǎng)基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)15-30 h ；
第三步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)72-120 h后發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20°C保存；
第四步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)5-20 h后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加第三步得到的發(fā)酵上清液
0.01-2.0%，繼續(xù)培養(yǎng)72-108 h后發(fā)酵結(jié)束。
[0010]所述的固體培養(yǎng)基的組分為:黃豆餅粉20 g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L,余量為自來水。
[0011]所述的種子培養(yǎng)基的組分為:玉米粉30 g/L、黃豆餅粉22 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
[0012]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:玉米粉100 g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
[0013]本發(fā)明利用微生物的群體感應(yīng)現(xiàn)象，提前向發(fā)酵液中添加含群體感應(yīng)信號分子的發(fā)酵上清液，利用群體感應(yīng)信號分子對其進(jìn)行刺激，可激活群體感應(yīng)通路的響應(yīng)，促進(jìn)相關(guān)基因的表達(dá)，使得某些次級代謝物的分泌提前進(jìn)行，并提高次級代謝物的產(chǎn)量，提高生產(chǎn)效率。本發(fā)明確定了發(fā)酵上清液的最適添加時間為發(fā)酵開始12 h，最適添加濃度為0.5%，96h發(fā)酵培養(yǎng)后，井R霉素的絕對積累量從12 g/L提高到了 16 g/L，降低了生產(chǎn)成本。且使發(fā)酵96 h就達(dá)到最高產(chǎn)量，發(fā)酵提前24 h結(jié)束，縮短了發(fā)酵周期，取得了更大的生產(chǎn)效率。【專利附圖】
【附圖說明】
[0014] 圖1為實施例中發(fā)酵上清液的添加時間對井岡霉素發(fā)酵產(chǎn)量的動態(tài)影響圖。
[0015]圖2為實施例中發(fā)酵上清液的添加濃度對井R霉素發(fā)酵產(chǎn)量的動態(tài)影響圖。
【具體實施方式】
[0016]下面對本發(fā)明的實施例作詳細(xì)說明。本實施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實施，給出了詳細(xì)的實施方式和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實施例。
[0017]提高井R霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法包括如下步驟:
第一步，將_80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，于37 °C培養(yǎng)5-8 d,待表面布滿青灰色孢子時取出，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權(quán)專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網(wǎng)變種5008菌株，hygroscopi cus var.jinggangensi s 5008,屬于放線菌門、放線菌綱、放線菌目、鏈霉菌科、鏈霉菌屬，保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ；
第二步，將孢子活化液與種子培養(yǎng)基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)15-30 h ；
第三步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)72-120 h后發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20°C保存；
第四步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)5-20 h后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加第三步得到的發(fā)酵上清液0.01-2.0%，繼續(xù)培養(yǎng)到72-108 h后發(fā)酵結(jié)束。
[0018]所述的固體培養(yǎng)基的組分為:黃豆餅粉20 g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L,余量為自來水。
[0019]所述的種子培養(yǎng)基的組分為:玉米粉30 g/L、黃豆餅粉22 g/L、酵母粉10 g/L、NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
[0020]所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:玉米粉100 g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
[0021]實施例1
發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵上清液添加時間對井R霉素產(chǎn)量的影響考察，選擇3個時間段:種子液接種前即O h、發(fā)酵開始后12 h、發(fā)酵開始后24 h，分別添加不同濃度的發(fā)酵上清液，進(jìn)行發(fā)酵試驗。實施步驟和結(jié)果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養(yǎng)
將配制的固體孢子培養(yǎng)基(成分:黃豆餅粉2 g、甘露醇2 g、瓊脂按2 g，自來水100 mL)滅菌，倒平板冷卻后待用。將_80°C保存的井R霉素產(chǎn)生菌吸水鏈霉菌5008的孢子懸浮液甘油凍存管融化，將其涂布于固體培養(yǎng)基平板上，然后將平板倒置，于37°C培養(yǎng)5-8 d后可以看到平板表面形成大量的青色孢子。往孢子長勢良好的平板上加入5 mL無菌水，用涂布棒輕輕刮動平板表面覆蓋的孢子，使其懸浮于無菌水中，制成孢子活化液。
[0022](2)種子培養(yǎng)
將不銹鋼彈簧卷曲成環(huán)狀，置于250 mL錐形瓶底部，裝入50 mL種子培養(yǎng)基(成分:玉米粉3 g、黃豆餅粉2.2 g、酵母粉I g、NaCl 0.2 g、KH2P04 0.08 g、蒸餾水100 mL)，滅菌。待培養(yǎng)基冷卻至室溫，吸取孢子活化液50 PL加入搖瓶中接種。接種后，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)24 h，至少設(shè)置3個平行樣。
[0023](3)發(fā)酵培養(yǎng)
對照組:將不銹鋼彈簧卷曲成環(huán)狀，置于250 mL錐形瓶底部，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(成分:玉米粉10 g、黃豆餅粉2.5 g、酵母粉0.5 g、NaCl 0.1 g、KH2P04 0.15 g、去離子水100 mL)。轉(zhuǎn)接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后使用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。
[0024]發(fā)酵液添加組:設(shè)置了三個發(fā)酵上清液添加時間O h、12 h、24 h，設(shè)置相對較寬的添加濃度范圍0.01%,0.1%、1.0%。
[0025]O h添加組:發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌冷卻后直接加入不同量的處理好的發(fā)酵上清液(0.01%,0.1%、1.0%)。每個劑量組至少3個平行樣，然后將9個搖瓶接種種子液。轉(zhuǎn)接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220rpm培養(yǎng)，至少設(shè)置3個平行樣。培養(yǎng)進(jìn)行到24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。
[0026]12 h添加組:發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌。轉(zhuǎn)接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL,種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發(fā)酵上清液(0.01%,0.1%、1.0%)，每個劑量組至少設(shè)置3個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220 rpm繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行12 h即達(dá)到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。
[0027]24 h添加組:發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌。轉(zhuǎn)接時首先將3個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到24 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中先取出2 mL培養(yǎng)液作為井R霉素檢測樣品(24 h取樣點)，然后加入不同劑量的處理好的發(fā)酵上清液(0.01%、0.1%、1.0%)，每個劑量組至少設(shè)置3個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內(nèi)按37 °C、220 rpm繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行24 h即達(dá)到48 h取樣點，依次在48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2mL培養(yǎng)液進(jìn)行井岡霉素檢測。
[0028](4)井R霉素產(chǎn)量檢測
樣品處理:取2 mL發(fā)酵液于離心管，10000 rpm離心5 min,吸取0.5 mL上清液于新離心管。加入0.5 mL氯仿，劇烈震蕩直至形成乳濁液。將乳濁液常溫靜置15 min, 12000 rpm離心5 min。吸取上清液，并稀釋5倍到測量范圍內(nèi)，以0.22 μπι微孔濾膜過濾，作為HPLC
上樣樣品。
[0029]井岡霉素標(biāo)品處理:井岡霉素標(biāo)準(zhǔn)品粉末，配成10 g/L (0.1 g/10 mL)，取100μ L>200 μ L>300 μ L、400 μ L、500 μ L 加水至 I mL(濃度為 I g/L、2 g/L、3 g/L、4 g/L、5 g/L，乘以標(biāo)品純度即為標(biāo)準(zhǔn)品的實際濃度)。
[0030]流動相配置:5 mmol/L、pH 7.0的磷酸鹽緩沖液，吸取1.8 g/L的NaH2P04.2H20溶液51 mL,吸取17.9 g/L的Na2HP04.12H20溶液49 mL，用去離子水定容1000 mL，調(diào)節(jié)pH到7.0。流動相抽濾、脫氣處理20 min。
[0031]液相色譜條件:流動相為98%的磷酸鹽緩沖液與2%的甲醇；流速為I mL/min ;檢測波長210 nm，使用伊力特Hypersil ODS 25 μπι、4.6 mmX250 mm分析柱，柱溫為35°C ；出峰時間約為8 min。根據(jù)峰面積對比標(biāo)準(zhǔn)曲線得到井R霉素含量，因樣品處理時均稀釋5倍，所以比對得到的含量乘以5得到井R霉素的發(fā)酵產(chǎn)量。
[0032]2.實施結(jié)果分析
對照組與發(fā)酵上清液不同添加時間下井網(wǎng)霉素的最高產(chǎn)量分別為:對照組12.47 g/L；O h添加0.01%發(fā)酵上清液組13.24 g/L、0 h添加0.1%發(fā)酵上清液組13.71 g/L,O h添加1.0%發(fā)酵上清液組14.06 g/L, 12 h添加0.01%發(fā)酵上清液組13.59 g/L、12 h添加0.1%發(fā)酵上清液組14.13 g/L、12 h添加1.0%發(fā)酵上清液組15.35 g/L, 24 h添加0.01%發(fā)酵上清液組13.08 g/L、24 h添加0.1%發(fā)酵上清液組13.62 g/L、24 h添加1.0%發(fā)酵上清液組13.94 g/L。由此可見，在不同的添加濃度下，處理組均在12 h添加的井R霉素產(chǎn)量更高。其中發(fā)酵上清液添加量在1.0%時相對于對照組井R霉素產(chǎn)量有較大提高，所以對其在不同添加時間的動態(tài)影響作圖(見圖1)。由于吸水鏈霉菌5008在發(fā)酵進(jìn)行到10-12 h時處于細(xì)胞代謝最旺盛的對數(shù)生長期，因此我們分析相對于O h和24 h，12 h向發(fā)酵液中添加上清液對井R霉素產(chǎn)量提高的影響更明顯，與對照組相比可提高23%左右。
[0033]實施例2
由實施例1得出，發(fā)酵培養(yǎng)基中在12 h添加發(fā)酵上清液可以促進(jìn)井R霉素產(chǎn)量提高，接下來更加詳細(xì)地比較了不同上清液添加量對井R霉素產(chǎn)量的影響，先選擇3組相對較低添加濃度0.01%,0.05%,0.10%ο實施步驟和結(jié)果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養(yǎng) 同實施例1。
[0034](2)種子培養(yǎng) 同實施例1。
[0035](3)發(fā)酵培養(yǎng) 對照組:同實施例1。
[0036] 發(fā)酵液添加組:發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL，種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發(fā)酵上清液(0.01%、0.05%,0.1%)，每個劑量組至少設(shè)置三個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220 rpm繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行12 h即達(dá)到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。
[0037] (4)井R霉素產(chǎn)量檢測 同實施例1。
[0038](5 )吸水鏈霉菌5008生物量檢測
樣品處理:取2 mL發(fā)酵液于離心管中，10000 rpm離心5 min,去除上清液,沉淀用作測量。用STE緩沖液懸浮菌體沉淀，離心后去上清反復(fù)洗滌兩次，用STE緩沖液將沉淀復(fù)溶到2 mL，分裝兩個2 mL離心管(250 μ L/管+250 μ L STE)。將20 μ L溶菌酶液(50 mg/mL)加入其中的一個離心管，另一管做為對照實驗。將加入溶菌酶的離心管與對照離心管一同放入37°C的恒溫水浴中反應(yīng)I h。在反應(yīng)后的樣品中加入10 UL 10% SDS溶液并充分震蕩，使細(xì)胞進(jìn)一步裂解。放置5 min, 12000 rpm離心10 min,以濃度為0-100 μ g/mL的牛血清蛋白制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，吸取上清液稀釋25倍到測定范圍，用考馬斯亮藍(lán)G250工作液染色，以Bradford法測定蛋白濃度。其中STE緩沖液組分為:1 mol/L Tris-HCl (pH 8.0)
2.5 mL、0.5 mol/L EDTA 0.5 mL、5 mol/L NaCl 5 mL 定容至 250 mL。
[0039]樣品測定:分別取試管，其中一支加入1.0 mL空白樣，另外一支加入同體積的處理樣，加入5 mL考馬斯亮藍(lán)G250搖勻放置5 min, 595 nm處吸光度，用測得的吸光值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得相當(dāng)于牛血清蛋白的mg數(shù)，乘以稀釋倍數(shù)(2X25)得蛋白量表征的生物量。
[0040](6)發(fā)酵培養(yǎng)基殘?zhí)菧y定
參考培養(yǎng)基中各組分含糖量數(shù)據(jù)(玉米粉82.92%，黃豆餅粉24.57%，酵母粉25.89%)，計算得出培養(yǎng)基初始糖濃度為90.35 g/L。本研究以濃度為0-100 mg/L的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，采用苯酚-濃硫酸法測定殘留可溶性還原糖含量。具體操作:
樣品處理:取2 mL發(fā)酵液加入到離心管中，10000 rpm離心5min,吸取上清液。根據(jù)樣品的發(fā)酵時間，72 h前樣品(包括72 h)梯度稀釋1000倍，96 h后(包括96 h)梯度稀釋500 倍。
[0041]標(biāo)品處理:葡萄糖烘干Id,配制10 g/L標(biāo)品母液,稀釋100倍(100 mg/L),取200μ L、400 μ L、600 μ L、800 μ L、1000 μ L 加水至 I mL (濃度:20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L、80 mg/L、100 mg/L),每個濃度3個平行。樣品測定:加入5%苯酹溶液5 mL ,再與5 mL濃H2S04混合均勻，快速加入，邊加邊振蕩，放置反應(yīng)10 min，冷卻后在488 nm下檢測吸光值。比照標(biāo)準(zhǔn)曲線，分別乘以稀釋倍數(shù)(1000或500)得殘?zhí)橇俊?br>
[0042]2.實施結(jié)果分析
發(fā)酵液回添量在濃度較低的情況下，井R霉素產(chǎn)量較對照組有一定的提高，但提高量較低，隨著添加濃度的增加，產(chǎn)量提高逐漸增大(見圖2)。12 h添加0.01%組產(chǎn)量14.57 g/L、12 h添加0.05%組產(chǎn)量14.85 g/L、12 h添加0.10%組產(chǎn)量15.16 g/L。根據(jù)生物量與殘?zhí)菧y定結(jié)果得知，在添加不同濃度發(fā)酵液情況下，發(fā)酵液處理組與對照組生物量與殘?zhí)橇烤鶝]有顯著差異，這表明單位細(xì)胞井R霉素的產(chǎn)量有所提高，而并非添加發(fā)酵液后使細(xì)胞量提升而提高井R霉素產(chǎn)量。
[0043]實施例3
發(fā)酵培養(yǎng)基中在12 h添加發(fā)酵上清液可促進(jìn)井R霉素產(chǎn)量提高，接下來更加詳細(xì)地比較了不同上清液添加量對井R霉素產(chǎn)量的影響，選擇3個相對較高的添加濃度:0.50%、1.0%、1.5%。實施步驟和結(jié)果如下:
1.實施步驟
(I)菌種活化與平板培養(yǎng)
同實施例1。
[0044](2)種子培養(yǎng) 同實施例1。
[0045](3)發(fā)酵培養(yǎng) 對照組:同實施例1。
[0046]發(fā)酵液添加組:發(fā)酵搖瓶選擇放入彈簧的250 mL錐形瓶，瓶內(nèi)裝入50 mL發(fā)酵培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)接時首先將三個平行種子液混合均勻，然后用滅過菌的5 mL移液管吸取5 mL，種子液轉(zhuǎn)移到發(fā)酵搖瓶中，將搖瓶至于37°C下、轉(zhuǎn)速220 rpm培養(yǎng)。培養(yǎng)進(jìn)行到12 h時，將搖瓶取出，在超凈臺中加入不同劑量的處理好的發(fā)酵上清液(0.50%、1.0%、1.5%)，每個劑量組至少設(shè)置三個平行樣，然后將9個搖瓶放置搖床內(nèi)按37°C、220 rpm繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)再進(jìn)行12 h即達(dá)到24 h取樣點，依次在24 h、48 h、72 h、96 h、120 h，每個搖瓶分別取出2 mL培養(yǎng)液進(jìn)行井R霉素檢測。
[0047](4)井R霉素產(chǎn)量檢測 同實施例1。
[0048](5 )吸水鏈霉菌5008生物量檢測 同實施例2。
[0049](6)發(fā)酵培養(yǎng)基殘?zhí)菧y定 同實施例2。
[0050]2.實施結(jié)果分析
發(fā)酵液回添量在0.5%和1.0%時，井R霉素產(chǎn)量較對照組有較大提高(見圖2)，0.5%較
1.0%提高更大，再加大添加量到1.5%時，產(chǎn)量提高有所下降，因此得出最適添加量為0.5%。最高產(chǎn)量出現(xiàn)在添加0.5%發(fā)酵液處理組中，發(fā)酵96 h時，井R霉素產(chǎn)量由對照組的12.47g/L提高至16.39 g/L，產(chǎn)量提高了 31.5%左右。根據(jù)對生物量與殘?zhí)堑臏y定結(jié)果來看，對照組與處理組之間的生物量與殘?zhí)橇坎o明顯差異，證明單位細(xì)胞的井R霉素產(chǎn)量有提高。由于細(xì)胞感應(yīng)信號分子濃度達(dá)到一定閾值即會產(chǎn)生群體感應(yīng)現(xiàn)象，信號分子濃度的不斷提高并不能持續(xù)增加井R霉素的產(chǎn)量，因此添加發(fā)酵上清液最適濃度有一定范圍，在實際應(yīng)用中的添加濃度也應(yīng)嚴(yán)格控制。
【權(quán)利要求】
1.一種提高井R霉素產(chǎn)量的發(fā)酵方法，其特征在于包括如下步驟: 第一步，將-80°C保存的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株的孢子懸浮液融化，將其涂布于含有固體培養(yǎng)基的平板上，然后將平板倒置，于37 °C培養(yǎng)5-8d,待表面布滿青灰色孢子時取出，制備孢子活化液；所述的吸水鏈霉菌井R變種5008菌株為中國專利公報中公告的授權(quán)專利號為ZL2010173832.5的生物材料，所述的吸水鏈霉菌井網(wǎng)變種5008菌株，Streptomyces hygroscopicus var.jinggangensis 5008,保藏于中國普通微生物菌種保藏管理中心，保藏號為CGMCC4.1026 ； 第二步，將孢子活化液與種子培養(yǎng)基按照體積比為1:1000的比例接種到種子培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)，培養(yǎng)15-30 h ； 第三步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)72-120 h后發(fā)酵結(jié)束，將發(fā)酵液6000-12000 rpm離心10 min，并用無菌濾膜過濾得到上清液后，于-20 °C保存； 第四步，將種子培養(yǎng)液與發(fā)酵培養(yǎng)基按照體積比為1:10的比例接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種后于37°C下培養(yǎng)5-20 h后，在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加第三步得到的發(fā)酵上清液0.01-2.0%，繼續(xù)培養(yǎng)到72-108 h后發(fā)酵結(jié)束。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的固體培養(yǎng)基的組分為:黃豆餅粉20g/L、甘露醇20 g/L以及瓊脂20 g/L，余量為自來水。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的種子培養(yǎng)基的組分為:玉米粉30g/L、黃豆餅粉22 g/L、 酵母粉10 g/L, NaCl 2 g/L以及KH2P04 0.8 g/L，余量為蒸餾水。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征是，所述的發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為:玉米粉100g/L、黃豆餅粉25 g/L、酵母粉5 g/L, NaCl I g/L以及KH2P04 1.5 g/L，余量為去離子水。
【文檔編號】C12R1/55GK103937856SQ201410159547
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年4月21日
【發(fā)明者】周文文, 李瑋, 屠鵬程, 高慧, 劉燕, 鄭曉冬 申請人:浙江大學(xué)