枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF及應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF及應用，枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF序列用SEQ?ID?No.1所示。本發(fā)明所構建的包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌生物安全，遺傳背景清晰，可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，提高核黃素積累水平20%以上。
【專利說明】枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF及應用
【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物技術與分子生物學領域，具體地涉及枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因PurF及該突變基因編碼的氨基酸序列，包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因PurF的工程菌及該菌在產核黃素的應用。
【背景技術】
[0002]以細菌為宿主菌的基因工程菌具有發(fā)酵周期短、原料要求簡單、成熟的基因工程技術等優(yōu)點。在芽孢桿菌屬中，包括枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)在內的許多菌株具有可靠的安全性。傳統(tǒng)菌株選育發(fā)現，枯草芽孢桿菌的突變株能夠過量合成葉酸、腺苷、肌苷、鳥苷、核黃素等一系列嘌呤途徑代謝中間產物或該途徑的衍生代謝產物，成為選育高產核苷類代謝產物重要出發(fā)菌株?？莶菅挎邨U菌作為模式菌株，對其生理生化特性及遺傳背景已經有了比較深入的了解，相關的分子生物學方法和基因操作技術都比較成熟，有利于通過理性代謝工程及系統(tǒng)生物學手段來選育核苷類代謝產物(如核黃素)高產菌種。核黃素(分子式C17H2tlO6N4, IUPAC中文名:7，8- 二甲基-10- 0- -D-核糖基)-異咯嗪)是人體必需的13種維生素之一，是黃素酶類的輔酶組成部分，在生物體內主要以黃素單核苷酸(FMN)和黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)的形式存在。它作為黃素蛋白的輔酶參與機體組織呼吸鏈電子傳遞及氧化還原反應，在呼吸和生物氧化中起著重要的作用。[0003]枯草芽孢桿菌的嘌呤合成途徑包括10步反應，其中催化這10步反應所需要的酶由嘌呤操縱子負責編碼。嘌呤核苷酸生物合成的第一步是由磷酸戊糖焦磷酸激酶催化，5’ -磷酸-D-核糖與ATP反應生成5’ -磷酸核糖焦磷酸(PRPP)，隨后經過9步反應生成肌苷酸(MP)，反應生成的MP并不堆積在細胞內，而是迅速轉變?yōu)橄佘账?AMP)和鳥苷酸(GMP)。嘌呤從頭合成是合成嘌呤核苷酸的主要途徑，此過程要消耗氨基酸及ΑΤΡ，同時嘌呤從頭合成途徑受到嚴格的多重調控機制。
[0004]嘌呤操縱子存在兩種相互獨立的代謝調控機制:腺嘌呤介導的轉錄起始阻遏機制和鳥嘌呤通過作用于前導mRNA來調節(jié)其轉錄的衰減機制。嘌呤基因轉錄起始位點上游-145~-29區(qū)的順式作用元件是阻遏轉錄起始的調節(jié)蛋白結合位點。該調控區(qū)域的缺失突變會使腺嘌呤的阻遏作用消失，但對鳥嘌呤的衰減機制幾乎沒有影響。腺嘌呤介導的轉錄起始阻遏機制利用屬于LacI類的調節(jié)蛋白-PurR阻抑物調節(jié)嘌呤基因的表達。PurR蛋白的調控是通過胞內代謝物PRPP介導的，PurR蛋白與DNA的結合不受腺嘌呤、腺苷或腺苷酸的影響，但PRPP可抑制它們的結合。嘌呤合成途徑中除了轉錄水平的調節(jié)，還存在著終產物對關鍵酶的反饋抑制作用，對合成速度有著精細的調節(jié)，不僅調節(jié)嘌呤核苷酸的總量，而且使ATP和GTP的水平保持相對平衡。PRPP轉酰胺酶是嘌呤從頭合成途徑的關鍵調節(jié)酶，該酶活的高低直接影響進入嘌呤合成途徑的通量。PRPP轉酰胺酶受到ATP，AMP, GTP和GMP的反饋抑制作用。解除嘌呤途徑受到的反饋抑制對于提高嘌呤途徑的通量以及核苷類(肌苷和鳥苷)代謝產物或源于嘌呤途徑代謝物的積累具有重要的意義。
[0005]目前，尚未有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF用于核黃素高產菌種的選育的報道。
【發(fā)明內容】
[0006]本發(fā)明的目的是提供一種能夠解除嘌呤核苷類反饋抑制的枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF。
[0007]本發(fā)明的第二個目的是提供一種枯草芽孢桿菌突變基因purF所編碼的氨基酸序列。
[0008]本發(fā)明的第三個目的是提供一種包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌。
[0009]本發(fā)明的第四個目的是提供一種包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌的應用。
[0010]本發(fā)明的技術方案概述如下:
[0011]枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF，所述突變基因purF序列用SEQID N0.1 所示。
[0012]枯草芽孢桿菌突變基因purF所編碼的氨基酸序列，所述氨基酸序列用SEQ IDN0.2所示。
[0013]包含有枯草 芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌。
[0014]包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌在產核黃素的應用。
[0015]本發(fā)明所構建的包含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌生物安全，遺傳背景清晰，可以大幅提高枯草芽孢桿菌合成核黃素的能力，提高核黃素積累水平20%以上。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0016]圖1為無痕基因操作所需pSS質粒圖譜。
[0017]圖2為無痕基因操作所需purF點突變引入的pSS-purF*_FB質粒圖譜。
[0018]圖3為牛血清蛋白BSA標準曲線繪制。
[0019]圖4為PRPP轉酰胺酶野生酶(B.subtilis RC2)和突變酶(B.subtilis RC5)酶活性測定。
[0020]圖5為不同濃度ATP對PRPP轉酰胺酶野生酶(B.subtilis RC2)和突變酶(B.subtilis RC5)酶活性的抑制作用。
[0021]圖6為不同濃度AMP對PRPP轉酰胺酶野生酶(B.subtilis RC2)和突變酶(B.subtilis RC5)酶活性的抑制作用。
[0022]圖7為不同濃度GTP對PRPP轉酰胺酶野生酶(B.subtilis RC2)和突變酶(B.subtilis RC5)酶活性的抑制作用。
[0023]圖8為不同濃度GMP對PRPP轉酰胺酶野生酶(B.subtilis RC2)和突變酶(B.subtilis RC5)酶活性的抑制作用。
[0024]圖9為菌株B.subtilis RC2和B.subtilis RC5核黃素合成水平發(fā)酵驗證。【具體實施方式】
[0025]下面結合實施例對本發(fā)明做進一步說明，下述實施例是為了使本領域的技術人員能夠更好地理解本發(fā)明，但對本發(fā)明不作任何限制。
[0026]本發(fā)明所用到的原始菌株B.subtilisl68 來源為 BGSC(Bacillus Genetic StockCenter, http://www.bgsc.0rg/)。本發(fā)明所用到的原始質粒pUC18購買于生工生物工程(上海)股份有限公司(http://www.sangon.com/)。
[0027]本發(fā)明所用到的ATP，AMP, GTP, GMP和PRPP (磷酸核糖焦磷酸)藥品從Sigma公司(http://www.sigmaaldrich.com/sigma-aldrich)購買，所用限制性內切酶、去磷酸化酶、DNA連接酶等分子生物學試劑從Thermo公司購買(http://www.thermoscientificbi0.com/fermentas),所用其他生化試劑從生工生物工程(上海)股份有限公司購買(http://www.sangon.com/)。
[0028]實施例1:基礎操作質粒pSS的構建
[0029]利用PCR 反應以 pC194 (來源:Bacillus Genetic Stock Center, BGSC,http://www.bgsc.0rg/)質粒為模版使用上下游引物pSS_Pl和pSS_P2獲取cat基因、以B.subtilisl68基因組為模版使用上下游引物PSS-P3和pSS_P4獲取upp基因，再以上面的兩個片段為模版，利用融合PCR反應使用上下游引物pSS-Pl和pSS-P4獲取重組片段Cat-Upp0將該重組片段與PUC18 (通用載體)質粒經酶切、酶連、轉化、驗證等操作后，得到基礎操作質粒PSS，見圖1。
[0030]本發(fā)明對該基礎操作質粒pSS的構建方法以及抗性基因的選擇不做限定。
[0031]實施例2:purF點突變引入質粒pSS_purF*_FB構建
[0032]利用purF-F-U和purF-F-L —對引物，以B.subtilisl68基因組為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增得到大小為836bp的上游同源臂purF*_F，其中下引物purF-F-L中引入突變點D293V。purF*_F的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fastdigest BglII和XhoI雙酶切，連接、轉化質粒pSS后得到質粒pSS-purF*_F。
[0033]利用purF-B-Fsn-l 和 purF-B-Fsn-2 — 對引物，以 B.subtilisl68 基因組為模版，使用KOD-p Ius高保真DNA聚合酶擴增得到大小為345bp的片段A，其中上引物purF-B-Fsn-l中引入突變點K316Q，下引物purF-B-Fsn-2中引入突變點S400W。利用purF-B-Fsn-3 和 purF-B-Fsn-4 —對引物，以 B.subtilisl68 基因組為模版，使用 KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增得到大小為594bp的片段B，其中上引物purF-B-Fsn-3中引入突變點S400W。以片段A和片段B為模版，利用融合PCR反應使用上下游引物purF-B-U和purF-B-L獲取大小為818bp的下游同源臂purF*_B。purF*_B的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切,連接、轉化質粒pSS_purF*_F后得到質粒pSS-purF*-FB。質粒構建成功后送測序檢查突變點成功引入至質粒載體中，見圖2。
[0034]實施例3:枯草芽孢桿菌系統(tǒng)出發(fā)菌株B.subtilis BUK的構建
[0035]本發(fā)明中所用到的枯草芽孢桿菌出發(fā)菌株B.subtilis BUK來源于B.subtilisl68，詳細構建過程可參考公開發(fā)表文獻I。
[0036]該菌株具有誘導條件下快速制備感受態(tài)細胞的能力，并同時具有較高的外源DNA的吸收能力。
[0037]實施例4:工程菌株B.subtilis RCl和B.subtilis RC2構建過程[0038](I)向菌株B.subtilis BUK基因組上無痕引入基因突變ribC (G596A)操作流程如下:
[0039]利用ribC-F-U、ribC-F-L 和 ribC-B-U、ribC-B-L 兩對引物，以 B.subtilisl68 為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為894bp和928bp的上下游同源臂ribC*-F和ribO-B。ribC*-F的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digestAatII和XhoI雙酶切，連接、轉化質粒pSS后得到質粒pSS-ribC*_F。ribC*_B的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和Seal雙酶切，連接、轉化質粒pSS_ribC*_F后得到這質粒 pSS-ribC*-FB。
[0040]將測序結果正確的質粒pSS-ribC*-FB通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿B.subtilis BUK中，用含5μ g/mL氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h (0D約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基(添加終濃度為5 μ mol/L FMN)上挑出菌落，使用引物ribC-F-U、ribC-B-L進行PCR和測序驗證，得到ribC (G596A)正確引入的陽性菌株B.subtilis RCl0
[0041](2)向菌株B.subtilis RCl基因組上無痕引入基因突變ribO (G+39A)具體操作如下:
[0042]利用rib0-F_U、rib0-F-L 和 rib0-B_U、rib0-B-L 兩對引物，以 B.subtilisl68 為模版，使用KOD-plus高保真DNA聚合酶擴增分別得到大小為922bp和1234bp的上下游同源臂rib0*-F和rib0*-B。rib0*-F的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digestAatII和XhoI雙酶切，連接、轉化質粒pSS后得到質粒pSS-rib0*_F。rib0*_B的PCR片段經切膠回收后，使用Thermo Fast digest Sail和KpnI雙酶切,連接、轉化質粒pSS_rib0*-F后得到質粒pSS-rib0*-FB。
[0043]將測序結果正確的質粒pSS-rib0*-FB通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿B.subtilis RCl中，用含5 μ g/mL氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆，并用菌落PCR驗證。挑出的轉化子接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h (0D約為2)，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基(添加終濃度為5 μ mol/L FMN)上挑出菌落，使用引物rib0-F-U、rib0-B-L進行PCR和測序驗證，得到ribO (G+39A)正確引入的陽性菌株B.subtilis RC20
[0044]實施例5:工程菌株B.subtilis RC5 (含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌)構建
[0045]將實施例2中測序結果正確的質粒pSS-purF*_FB通過Spizizen轉化導入枯草芽孢桿B.subtilis RC2中，用含5 μ g/mL氯霉素LB固體培養(yǎng)基中篩選重組成功的陽性克隆。將正確的陽性克隆接種于5mL LB液體培養(yǎng)基中，200rpm震蕩培養(yǎng)6h，并在五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基上培養(yǎng)并挑出菌落，使用引物purF-F-U、purF-B-L進行PCR驗證和測序驗證，得到PurF正確引入的陽性菌株，即含有枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌，命名為B.subtilis RC5，其中枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF (D293V,K316Q，S400W)和枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF所編碼的氨基酸序列分別用 SEQID N0.1 和 SEQ ID N0.2 所示。
[0046]LB液體培養(yǎng)基配方為:10g/L蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L NaCl，調節(jié)pH至7.5ο 0.1Mpa 壓力下滅菌 20min。
[0047]LB固體培養(yǎng)基配方為:在LB液體培養(yǎng)基中加入瓊脂粉(終濃度15g/L)，0.1Mpa壓力下滅菌20min。
[0048]五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基配方見表1:
[0049]表1五氟尿嘧啶基本培養(yǎng)基配方
【權利要求】
1.枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF，其特征是所述突變基因purF序列用 SEQ ID N0.1 所示。
2.權利要求1所述的枯草芽孢桿菌突變基因purF所編碼的氨基酸序列，其特征是所述氨基酸序列用SEQ ID N0.2所示。
3.包含有權利要求1枯草芽孢桿菌編碼PRPP轉酰胺酶突變基因purF的工程菌。
4.權利要求3所述的工程菌在產核黃素的應用。
【文檔編號】C12R1/125GK103952422SQ201410150391
【公開日】2014年7月30日 申請日期:2014年4月15日 優(yōu)先權日:2014年4月15日
【發(fā)明者】王智文, 石婷, 王永成, 陳濤, 趙學明 申請人:天津大學