芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記及制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記及制備方法和應(yīng)用，所述的標(biāo)記GB50的正向引物序列為：ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物序列為：GGACTACTCCTCCTCCCCA；SBM298的正向引物的序列為：CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列為：CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。步驟是：A、在苗期對(duì)顯性細(xì)胞核雄性不育兄妹交分離群體各編號(hào)，分單株采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮處理后冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆茫籅、利用EST-SSR引物SBM系列，生物合成；C、采用PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增；D、PCR擴(kuò)增與產(chǎn)物檢測；E、多態(tài)性標(biāo)記的獲得；F、與雄性不育相關(guān)分子標(biāo)記的獲得。獲得100%雄性不育的群體，顯著提高芝麻輪回選擇的效率，避免了利用形態(tài)特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻煩。本發(fā)明效果明顯、成本低、無公害，應(yīng)用前景十分廣闊。
【專利說明】芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記及制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于芝麻遺傳育種和分子生物學(xué)領(lǐng)域，更具體涉及一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記，同時(shí)還涉及一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育相關(guān)分子標(biāo)記的制備方法，還涉及一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育分子標(biāo)記在分子標(biāo)記輔助選擇中的應(yīng)用，以提高利用芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因進(jìn)行高產(chǎn)育種的效率。
【背景技術(shù)】
[0002]芝麻是我國主要油料作物之一，芝麻油芳香純正，營養(yǎng)價(jià)值高，素有“油中之王”的美譽(yù)。我國芝麻年種植面積60萬公頃左右，占世界總面積的十分之一，總產(chǎn)60-70萬噸，占世界總產(chǎn)的四分之一，其總產(chǎn)和單產(chǎn)均居世界首位(楊湄，黃鳳洪.中國芝麻產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與存在問題、發(fā)展趨勢與對(duì)策建議.中國油脂，2009，34 (1):7-12)，是農(nóng)業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整的優(yōu)勢作物，也是傳統(tǒng)的出口創(chuàng)匯作物。但近十年來，國內(nèi)芝麻消費(fèi)量大幅度上升，年均消費(fèi)芝麻籽80萬噸以上，其中20萬噸靠進(jìn)口，芝麻已經(jīng)轉(zhuǎn)變?yōu)榧冞M(jìn)口作物。因此，進(jìn)一步提高芝麻單產(chǎn)和總產(chǎn)以滿足國內(nèi)消費(fèi)需求是當(dāng)前的緊迫任務(wù)。
[0003]芝麻在全國各地均可種植，但主要集中在河南、湖北、安徽、江西四省。我國芝麻產(chǎn)業(yè)發(fā)展中存在的主要問題有:①產(chǎn)量常常低而不穩(wěn)，長期徘徊在畝產(chǎn)70公斤的水平(楊湄，黃鳳洪.中國芝麻產(chǎn)業(yè)現(xiàn)狀與存在問題、發(fā)展趨勢與對(duì)策建議.中國油脂，2009，34 (I):7-12);②抗病性差，易發(fā)生莖點(diǎn)枯病、枯萎病，且目前未發(fā)現(xiàn)免疫或高抗材料(Zhang X R,Zhao Y Z, Cheng Y, Feng X F， et al.Establishment of sesame germplasm core collectionin China.Genetic Resources and Crop Evolution, 2000, 47: 273-279);③外觀品質(zhì)差，含油量低，市場競爭力不強(qiáng) 。因此開展高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、抗病芝麻新品種選育是當(dāng)前的主要育種目標(biāo)。
[0004]芝麻具有很強(qiáng)的雜種優(yōu)勢，通過雜種優(yōu)勢利用可以大幅度提高芝麻的產(chǎn)量(屠禮傳，柳家榮，梁秀銀.芝麻雜種優(yōu)勢研究.中國油料，1988 (2):8-12 ;樂美旺，曹開蔚，張冬仙等.黑芝麻雜種優(yōu)勢研究.江西農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2006，18 (1):1-5)。作物雜種優(yōu)勢利用途徑主要有:細(xì)胞質(zhì)雄性不育、細(xì)胞核雄性不育、化學(xué)殺雄、自交不親和等(傅廷棟主編.雜交油菜的育種與利用(第二版).武漢:湖北科學(xué)技術(shù)出版社，2000;劉后利主編，作物育種學(xué)論叢.北京:中國農(nóng)業(yè)大學(xué)出版社，2002)。在芝麻中，目前雜種優(yōu)勢利用的主要方式為隱性細(xì)胞核雄性不育，尚未見到顯性細(xì)胞核不育的報(bào)道。利用芝麻隱性細(xì)胞核雄性不育雖然育成了一些雜交品種，但芝麻隱性核不育的缺點(diǎn)是缺乏完全的保持系，只能以兩型系的形式加以利用，在生產(chǎn)雜交種時(shí)存在著必須及時(shí)拔除兩型系中50%可育株的問題，較費(fèi)時(shí)費(fèi)力，人工成本高，因此限制了其在芝麻生產(chǎn)上的應(yīng)用。
[0005]顯性核不育是雜種優(yōu)勢利用的另外一條重要途徑，在油菜、白菜等作物中已經(jīng)被廣泛應(yīng)用。本發(fā)明 申請(qǐng)人:通過種間雜交，首次創(chuàng)制出芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育兩型系W1098AB，其不育系敗育徹底、穩(wěn)定、無不良胞質(zhì)效應(yīng)。通過前期研究表明，W1098AB兄妹交群體的育性分離比例穩(wěn)定在1:1，可育株自交后代全部可育，而且利用17份芝麻地方品種與不育株測交，所有Fl代均發(fā)生育性分離。上述結(jié)果進(jìn)一步說明，W1098AB為顯性核不育，可能受I對(duì)基因控制，絕大部分品種為其保持系。該雄性不育在芝麻輪回選擇育種中是一個(gè)很好的材料，可進(jìn)行廣泛的基因重組和品種選育。但輪回選擇一般需于初花期及時(shí)拔除不育系中50%的可育株(張立森，江慶芬，泰立芳.太谷顯性核不育小麥輪回選擇育種簡報(bào).河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1989，12 (4): 143-144)，而芝麻W1098AB不育株與可育株的形態(tài)特征十分相似，在營養(yǎng)生長期無法區(qū)別，只能等到開花后根據(jù)花粉有無進(jìn)行區(qū)分，十分費(fèi)時(shí)費(fèi)力，去除不及時(shí)將產(chǎn)生大量花粉污染，影響選擇效率。針對(duì)上述問題，本發(fā)明利用分子標(biāo)記技術(shù)，開發(fā)出多個(gè)與育性緊密連鎖的分子標(biāo)記，在苗期即可對(duì)可育株進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和拔除，獲得100%雄性不育的群體，顯著提高芝麻輪回選擇的效率，應(yīng)用前景廣闊。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0006]本發(fā)明的目的是在于提供了一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記，開發(fā)出多個(gè)與育性緊密連鎖的分子標(biāo)記，在苗期即可對(duì)可育株進(jìn)行準(zhǔn)確識(shí)別和拔除，獲得100%雄性不育的群體，顯著提高芝麻輪回選擇的效率，避免了利用形態(tài)特征只有等到花期才能拔除50%可育株的麻煩。本發(fā)明效果明顯、成本低、無公害，應(yīng)用前景十分廣闊。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記的制備方法，方法易行，操作性強(qiáng)，其特點(diǎn)是特異性強(qiáng)，擴(kuò)增重復(fù)性好，可以確定植株或品系中是否有不育基因的存在，從而在早期鑒定芝麻植株的育性。 [0008]本發(fā)明的再一個(gè)目的是在于提供了一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因的分子標(biāo)記在芝麻親本選擇中的應(yīng)用，通過分子標(biāo)記輔助選擇，鑒定和篩選不育材料速度快，極大地減輕了在鑒定過程中必需經(jīng)過測交及后代種植觀察的工作量，有效提高了選擇的效率和準(zhǔn)確性，從而大大提高了芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因選育的速度與鑒定效率，加快了雜交種選育的進(jìn)程。
[0009]為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因分子標(biāo)記的制備方法，其步驟是:
A、在苗期首先對(duì)顯性細(xì)胞核雄性不育兄妹交分離群體各單株編號(hào)掛牌，然后分單株采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮處理后于-70°C超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?。在盛花期，利用田間觀察和室內(nèi)醋酸洋紅染色等方法(劉絢霞，醋酸洋紅染色法測定油菜花粉的生活力.陜西農(nóng)業(yè)科學(xué)，1998，(I):23-24)，綜合調(diào)查群體的花粉育性，將其準(zhǔn)確劃分為可育株或不育株。
[0010]B、利用本課題組開發(fā)的EST-SSR引物SBM系列(Kun Wu，Minmin Yang,Hongyan Liuj Ye Taoj Ju Meij Yingzhong Zha0.Genetic analysis and molecularcharacterization of Chinese sesame {SesamumindicumL.) cultivars usingInsertion-Deletion (InDel) and Simple sequence repeat (SSR) markers.BMC Genetics,2014，15)，并根據(jù)文獻(xiàn)(張鵬，張海洋，郭旺珍，鄭永戰(zhàn)，魏利斌，張?zhí)煺?以SRAP和EST-SSR標(biāo)記分析芝麻種質(zhì)資源的遺傳多樣性.作物學(xué)報(bào)，2007,33(10):1696-1702 ;Dixit A，JinM H，Chung J Wj Yu J Wj Chung H K，Ma K H，Park Y J，Cho E G.Development of polymorphicmicrosatellite markers in sesame {Sesamumindicum L.).Molecular Ecology Notes,2005，5: 736-738)下載SSR引物序列，共1500多對(duì)，委托上海英駿生物合成公司合成。
[0011]C、用 CTAB 法(Doyle J.DNA protocols for plants — CTAB total DNAisolation.1n: Hewitt G M， Johnston A.Molecular Techniques in Taxonomy, Berlin:Springer-Verlag, 1991.P283-293)提取芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育系兄妹交群體中的可育株與不育株葉片DNA，采用PCR程序(劉紅艷，楊敏敏，左陽，舒巖，趙應(yīng)忠.芝麻SSR檢測體系的優(yōu)化與應(yīng)用.中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2011,27(21): 138-143)進(jìn)行擴(kuò)增，所用PCR儀型號(hào)為ABI9700。
[0012]D、PCR產(chǎn)物的檢測根據(jù)所需的分辨率不同可采用兩種不同的方法，第一種為在1%~1.5%濃度(g/v)的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢后，進(jìn)行溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，記錄多態(tài)性結(jié)果。第二種為在聚丙烯酰胺凝膠中點(diǎn)樣，電泳完畢后，用2%濃度(g/v) AgNO3銀染，普通蒸餾水漂洗，顯影液中顯影，及時(shí)用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，并記錄多態(tài)性結(jié)果。
[0013]E、由于所用材料是顯性細(xì)胞核雄性不育兄妹交后代，電泳時(shí)差異條帶呈現(xiàn)出可育(基因型為msms)為無帶，不育(基因型為Msms)為有帶。為方便記錄，在相同遷移率位置上，將有帶記為“1”，無帶記為“0”，并統(tǒng)計(jì)SSR擴(kuò)增產(chǎn)物。為保證數(shù)據(jù)準(zhǔn)確、可靠，每膠板均由2人獨(dú)立記錄(僅記錄主帶),然后比對(duì)確認(rèn)。
[0014]F、利用能檢測出多態(tài)性的引物對(duì)全部單株逐一進(jìn)行檢測，將所得數(shù)據(jù)輸入電腦，并用 JoinMap3.0軟件(Van Ooijen J ff, Voorips R E.JoinMap Version 3.0: Software forthe Calculation of Genetic Linkage Maps[M].ffageningen, The Netherlands: PlantResearch International, 2001)進(jìn)行分析,遺傳圖距用Kosambi函數(shù)加以轉(zhuǎn)換(KosambiD D.The estimation of map distance from recombination values.Annals of Eugenics,1944，12:172-175)，兩個(gè)性狀(標(biāo)記)間的重組交換率由以下公式計(jì)算:交換率(％)=重組型的配子數(shù)/總配子數(shù)X 100。
[0015]G、將重組交換率 高于15%的標(biāo)記予以剔除(因?yàn)樗鼈兣c不育基因呈松散的連鎖關(guān)系)，找出重組交換率為15%以內(nèi)、特異擴(kuò)增片段大小為100-500bp的標(biāo)記。
[0016]H、將所得標(biāo)記檢測結(jié)果使用 JoinMap軟件(Van Ooijen J ff, Voorips R E.JoinMapVersion 3.0: Software for the Calculation of Genetic Linkage Maps[M].ffageningen,The Netherlands: Plant Research International, 2001)分析，設(shè)定 LOD 值為 2.0，如果發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)記都分為一組，隨后將LOD值設(shè)置為最高值10.0,如果這些標(biāo)記仍然沒有分開，則表明它們之間是緊密連鎖的。運(yùn)行“Calculate Map”命令，即可獲得一個(gè)遺傳連鎖圖。從這張遺傳連鎖圖上可以看出每個(gè)標(biāo)記與不育基因間的遺傳距離及方向，以及各個(gè)標(biāo)記間的距離與方向。通過本方法目前已獲得了 13個(gè)與不育基因緊密連鎖的標(biāo)記(請(qǐng)見表1)，其中標(biāo)記SBM298和GB50距離不育基因最近。標(biāo)記GB50的正向引物的序列為:ATGGGTTTATGGCAGGCT，反向引物的序列為:GGACTACTCCTCCTCCCCA ；SBM298 的正向引物的序列為:CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG，反向引物的序列為:CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。SBM298標(biāo)記的引物為本實(shí)驗(yàn)室開發(fā)。
[0017]表1多態(tài)性引物序列
【權(quán)利要求】
1.一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因的分子標(biāo)記，其特征在于:標(biāo)記GB50的正向引物序列為:ATGGGTTTATGGCAGGCT,反向引物序列為:GGACTACTCCTCCTCCCCA ；SBM298的正向引物的序列為:CCCCTTTTCACTTACGTACAGCAG,反向引物的序列為:CTCTTCCTCCACCATCTCCTCTTC。
2.權(quán)利要求1所述的一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因的分子標(biāo)記的制備方法，其步驟是: A、在苗期對(duì)顯性細(xì)胞核雄性不育兄妹交分離群體各單株編號(hào)掛牌，然后分單株采集幼嫩葉片，經(jīng)液氮處理后于-70°C超低溫冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆?，在盛花期，利用田間觀察和室內(nèi)醋酸洋紅染色方法，調(diào)查群體各單株的花粉育性，將其劃分為可育株或不育株； B、利用EST-SSR引物SBM系列，并根據(jù)文獻(xiàn)下載SSR引物序列，生物合成； C、用CTAB法提取芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育系兄妹交群體中的可育株與不育株葉片DNA，采用PCR程序進(jìn)行擴(kuò)增； D、PCR產(chǎn)物的檢測根據(jù)分辨率不同采用兩種不同的方法，第一種為在1%~1.5%濃度g/v的瓊脂糖凝膠上電泳，電泳完畢后，進(jìn)行溴化乙啶染色，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，記錄多態(tài)性結(jié)果；第二種為在聚丙烯酰胺凝膠中點(diǎn)樣，電泳完畢后，用2%濃度g/v的AgNO3銀染，普通蒸餾水漂洗，顯影液中顯影，用凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，并記錄多態(tài)性結(jié)果； E、所用材料是顯性細(xì)胞核雄性不育兄妹交后代，電泳時(shí)差異條帶呈現(xiàn)出可育為無帶，不育為有帶； F、利用能檢測出多態(tài)性的引物對(duì)全部單株逐一進(jìn)行檢測，將所得數(shù)據(jù)輸入電腦，并用JoinMap3.0軟件進(jìn)行分析,遺傳圖距用Kosambi函數(shù)加以轉(zhuǎn)換,兩個(gè)性狀間的重組交換率由以下公式計(jì)算:交換率％=重組型的配子數(shù)/總配子數(shù)X 100 ； G、將重組交換率高于15%的標(biāo)記予以剔除，找出重組交換率為15%以內(nèi)、特異擴(kuò)增片段大小為100-500bp的標(biāo)記； H、將所得標(biāo)記檢測結(jié)果使用JoinMap軟件分析，設(shè)定LOD值為2.0，發(fā)現(xiàn)所有標(biāo)記都分為一組，隨后將LOD值設(shè)置為最高值10.0，這些標(biāo)記沒有分開，表明它們之間緊密連鎖，獲得一個(gè)遺傳連鎖圖，標(biāo)明每個(gè)標(biāo)記與不育基因間的遺傳距離及方向，及各個(gè)標(biāo)記間的距離與方向，最終獲得了 13個(gè)與不育基因緊密連鎖的標(biāo)記。
3.權(quán)利要求1所述的一種芝麻顯性細(xì)胞核雄性不育基因的分子標(biāo)記在芝麻親本選擇中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK103993011SQ201410111566
【公開日】2014年8月20日 申請(qǐng)日期:2014年3月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月24日
【發(fā)明者】劉紅艷, 趙應(yīng)忠, 吳坤, 楊敏敏 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院油料作物研究所