一種重組沙眼衣原體蛋白及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明涉及一種重組沙眼衣原體蛋白，還涉及該重組沙眼衣原體蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。本發(fā)明的重組沙眼衣原體蛋白制備的診斷試劑盒具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿(mǎn)足了沙眼衣原體感染臨床診斷的需要。
【專(zhuān)利說(shuō)明】一種重組沙眼衣原體蛋白及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及基因工程、疫苗研制和診斷試劑等領(lǐng)域，具體地涉及一種沙眼衣原體蛋白及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002]《伯氏系統(tǒng)手冊(cè)》(1984)的記載,將沙眼衣原體(Chlamydiatrachomatis, CT)分為3個(gè)生物型，即小鼠生物型(biovarmouse)、沙眼生物型(biovartrachoma)和性病淋巴肉芽腫生物型(biovar lyCThogranulomavenereum, LGV),后二者與人類(lèi)疾病有關(guān)。用間接微量免疫熒光試驗(yàn)，沙眼生物型又分A、B、Ba、C、D、Da、E、F、G、H、1、la、J、K14個(gè)血清型，LGV生物型又有L1、L2、L2a、L34個(gè)血清型。
[0003]沙眼衣原體是I種細(xì)胞內(nèi)寄生菌，它的感染形態(tài)是原體。原體感染宿主細(xì)胞，轉(zhuǎn)變?yōu)榇x活躍的網(wǎng)狀體，經(jīng)二分裂增殖，最終仍產(chǎn)生原體，從細(xì)胞中釋放出來(lái)感染新的細(xì)胞。沙眼衣原體所引起的泌尿生殖道感染是性傳播疾病(sextransmitted disease, STD)中最常見(jiàn)的I種，在性活躍期感染率高。沙眼衣原體的傳播受多種因素的影響，其中年齡、性別、種族、避孕措施、多性伴、既往沙眼衣原體感染史、性伴有性傳播疾病表現(xiàn)、合并其他疾病等因素均可成為獨(dú)立危險(xiǎn)因素。據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，全球每年新發(fā)的性傳播沙眼衣原體感染患者約8900萬(wàn)。近年來(lái)，由沙眼衣原體感染而導(dǎo)致的非淋菌性尿道炎、陰道炎、宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎等已超過(guò)淋球菌感染而居性傳播疾病之首，從而引起不孕不育。因此，有必要開(kāi)發(fā)出適用于臨床檢測(cè)且操作方法簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確的沙眼衣原體診斷方法。
[0004]目前實(shí)驗(yàn)室檢查衣原體的方法有衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法、血清學(xué)方法和核酸擴(kuò)增法。其中以衣原體細(xì)胞培養(yǎng)法最敏感、最可靠，但由于操作繁瑣、費(fèi)用高、培養(yǎng)時(shí)間，而且受標(biāo)本采集、運(yùn)送保存及實(shí)驗(yàn)技術(shù)的影響，一般實(shí)驗(yàn)室難以開(kāi)展。核酸擴(kuò)增法由于應(yīng)用特異性引物，大大增強(qiáng)了檢測(cè)的敏感性和特異性，但對(duì)`實(shí)驗(yàn)室條件、儀器設(shè)備、人員專(zhuān)業(yè)素質(zhì)要求很高，而且容易因?yàn)楹怂釘U(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染而出現(xiàn)假陽(yáng)性。因此希望獲得一種、能夠利用重組抗原進(jìn)行檢測(cè)、避免由于蛋白質(zhì)抗原純度低或特異性查造成假陽(yáng)性而降低檢測(cè)特異性等問(wèn)題，為沙眼衣原體感染的檢測(cè)提供一種特異性更高、更準(zhǔn)確的檢測(cè)用蛋白、檢測(cè)方法和檢測(cè)試劑盒。
【發(fā)明內(nèi)容】
[0005]本發(fā)明的目的是提供一種重組沙眼衣原體蛋白，本發(fā)明的另一目的是提供該重組沙眼衣原體蛋白在制備檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0006]本發(fā)明提供了一種編碼沙眼衣原體蛋白的重組DNA，其核苷酸序列如SEQ ID N0.1所示。同時(shí)提供了由該重組DNA序列編碼的沙眼衣原體蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
[0007]本發(fā)明還提供了一種沙眼衣原體蛋白的表達(dá)載體pET-21a-PGP3_D，它是將SEQ IDN0.1所示所述的重組DNA序列插入到質(zhì)粒pET-21a上得到的重組質(zhì)粒,其質(zhì)粒圖譜如附圖2所示。將表達(dá)載體pET-21a-PGP3-D導(dǎo)入大腸桿菌中，得到表達(dá)沙眼衣原體蛋白的工程菌株，該菌株是大腸埃希氏菌Escherichia coli YNT pET-21a_PGP3_D，于2014年03月05日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8894。
[0008]本發(fā)明利用SEQ ID N0.1所示核苷酸序列通過(guò)基因工程方法制備沙眼衣原體蛋白可以通過(guò)如下步驟實(shí)現(xiàn):
[0009]1)獲得具有SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列；
[0010]2)將該核苷酸序列導(dǎo)入質(zhì)粒，優(yōu)選pET-2Ia質(zhì)粒；
[0011]3)將該質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞，優(yōu)選大腸桿菌宿主細(xì)胞，更優(yōu)選BL21 (DE3)菌株中；
[0012]4)在有利于所述核苷酸序列表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞；
[0013]5)回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。
[0014]上述步驟4)中的培養(yǎng)條件為:37°C培養(yǎng)3小時(shí)后(轉(zhuǎn)速200r/min)，加入誘導(dǎo)劑(終濃度為1mmol/mL)，常溫(22°C左右)誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)(轉(zhuǎn)速140_160r/min)。
[0015]本發(fā)明提供的檢測(cè)沙眼衣原體感染的試劑盒，其組分中的抗原是本發(fā)明的重組沙眼衣原體蛋白。用于標(biāo)記沙眼衣原體蛋白的標(biāo)記物選自膠體金。
[0016]本發(fā)明所述的采用膠體金標(biāo)記抗原的試劑盒中，鼠抗人IgM (抗μ鏈)單克隆抗體劃線(xiàn)包被濃度為1.0mg/ml，沙眼衣原體抗原膠體金復(fù)合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊，膠體金結(jié)合物噴點(diǎn)量為60.0 μ L/cm2。兔抗沙眼衣原體抗體包被量為1.0 μ 1/cm,包被濃度為5.0mg/ml ο
[0017]以下將更詳細(xì)的描述本發(fā)明的技術(shù)方案:
[0018]本發(fā)明公開(kāi)了一種編碼沙眼衣原體蛋白的核苷酸序列，如SEQ ID N0.1所示，和利用該核苷酸序列制備沙眼衣原體蛋白的方法，由該方法制備的包含SEQ ID N0.2所示氨基酸序列的沙眼衣原體蛋白，以及包含該蛋白的組合物和試劑盒，同時(shí)還公開(kāi)了它們?cè)跈z測(cè)沙眼衣原體感染的應(yīng)用。
[0019]SEQ ID N0.1所示核苷酸序列可以通過(guò)本領(lǐng)域常規(guī)的方法制備，選擇其強(qiáng)抗原表位即沙眼衣原體PGP3-D基因組(GenBank:NC007430.1)中DNA序列為模板，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物(Pl，P2)，引物pi和p2分別帶有BamHl和XhoI的酶切位點(diǎn)。
[0020]引物序列如下:
[0021]Pl:ATAGGATCCATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG
[0022]P2:ATACTCGAGAGCGTTTGTTTGAGGTATTACTTC
[0023]以沙眼衣原體培養(yǎng)物為模板，以引物Pl和P2擴(kuò)增PGP3-D片段。
[0024]本發(fā)明對(duì)上述核苷酸序列的核酸分子采用適當(dāng)載體和宿主細(xì)胞表達(dá)時(shí)可以大大提高表達(dá)產(chǎn)率。
[0025]本發(fā)明還提供應(yīng)用如SEQ ID N0.1所示的核苷酸序列制備沙眼衣原體蛋白的方法。將含編碼沙眼衣原體蛋白的如SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的核酸分子連接到一個(gè)表達(dá)載體中，然后通過(guò)常規(guī)方法轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常，優(yōu)選原核生物用于DNA序列的起始克隆和用于本發(fā)明的載體構(gòu)建。例如，大腸桿菌等腸科桿菌。
[0026]編碼本發(fā)明蛋白的核酸與pET-2Ia形成的雜合質(zhì)粒具有高度的穩(wěn)定性，有利于本發(fā)明的蛋白的表達(dá)。
[0027]在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，如圖2所示，制備含有SEQ ID N0.1所示核苷酸序列的核酸分子和pET-21a質(zhì)粒的表達(dá)構(gòu)建體，并將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)化BL21 (DE3)，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)后，收集菌體?？刹捎贸Ｒ?guī)的純化方法純化所得到的蛋白。
[0028]本發(fā)明還提供用上述方法制備、純化的沙眼衣原體蛋白，該蛋白具有SEQ ID N0.2所示氨基酸序列。
[0029]本發(fā)明還提供包含上述沙眼衣原體蛋白的組合物和試劑盒。所述組合物或試劑盒可制備成檢測(cè)人沙眼衣原體感染的試劑或試劑盒形式，在臨床上用于方便、快速和準(zhǔn)確的沙眼衣原體感染。任何生物學(xué)樣品，只要它們含有沙眼衣原體抗體，就可用本發(fā)明蛋白，包含該蛋白的組合物或試劑盒來(lái)檢測(cè)。
[0030]本申請(qǐng)的“試劑盒”是指利用本申請(qǐng)的蛋白完成沙眼衣原體感染檢測(cè)而組配制成的成套試劑，可用于診斷沙眼衣原體感染。在用于沙眼衣原體感染檢測(cè)的試劑盒中，本發(fā)明的沙眼衣原體蛋白也可以是經(jīng)過(guò)標(biāo)記的。具體可使用酶、金屬螯合物等標(biāo)記。優(yōu)選的標(biāo)記性酶例如辣根過(guò)氧化物酶，過(guò)氧化物酶，堿性磷酸酶等。特別優(yōu)選的金屬物質(zhì)有膠體金等。
[0031]在采用膠體金標(biāo)記抗原的試劑盒中，鼠抗人IgM (抗μ鏈)單克隆抗體劃線(xiàn)包被濃度為1.0mg/ml,沙眼衣原體抗原膠體金復(fù)合物在濃縮原液到稀釋一倍之間包被載金墊，膠體金結(jié)合物噴點(diǎn)量為60.0 μ L/cm2。兔抗沙眼衣原體抗體包被量為1.0 μ 1/cm，包被濃度為 5.0mg/ml。
[0032]與市場(chǎng)上的同類(lèi)試劑盒相比，采用本發(fā)明提供的重組沙眼衣原體蛋白制備的診斷試劑盒，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，很好的滿(mǎn)足了沙眼衣原體感染臨床診斷的需要。
[0033]本發(fā)明涉及的大腸埃希氏菌Escherichia coli YNTpET_21a-PGP3_D 于 2014 年 3月5日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委`員會(huì)普通微生物中心，地址北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路I號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵編100101，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8894。
【專(zhuān)利附圖】
【附圖說(shuō)明】
[0034]圖1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳圖；其中M表示Marker，I表示擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0035]圖2是表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-PGP3_D的構(gòu)建流程圖；
[0036]圖3是誘導(dǎo)后菌體12% SDS — PAGE電泳圖，其中M表示Marker。
【具體實(shí)施方式】
[0037]以下實(shí)施例用于說(shuō)明本發(fā)明，但不用來(lái)限制本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0038]實(shí)施例1沙眼衣原體蛋白的制備
[0039]1.1沙眼衣原體蛋白抗原表位篩選及目的基因克隆
[0040]通過(guò)計(jì)算機(jī)分析沙眼衣原體的全部氨基酸序列篩選出沙眼衣原體蛋白的強(qiáng)抗原表位，所述的重組蛋白質(zhì)從N-末端到C-末端依次含有CT129-B7基因組中pll6從N-末端第11位到第304位核苷酸，和第339位到第465位核苷酸的421個(gè)氨基酸。其中上述重組蛋白質(zhì)的DNA序列如SEQ ID N0.2所示。
[0041]根據(jù)沙眼衣原體CT PGP3-D基因組中目的肽段的cDNA序列和質(zhì)粒上的酶切位點(diǎn)，設(shè)計(jì)一對(duì)PCR引物(Pl，P2)。引物pl和p2分別帶有BamHl和XhoI的酶切位點(diǎn)。
[0042]引物序列如下:
[0043]Pl:ATAGGATCCATGGGAAATTCTGGTTTTTATTTG
[0044]P2:ATACTCGAGAGCGTTTGTTTGAGGTATTACTTC
[0045]上述引物由(華美生物技術(shù)有限公司)合成。
[0046]以沙眼衣原體培養(yǎng)物(中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院病毒研究所贈(zèng))為模板，以引物Pl和P2擴(kuò)增得到目的基因重組片段PGP3-D ;擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如附圖1所示。切割含目的DNA條帶的膠塊，用DNA快速純化試劑盒(購(gòu)自六合通-北京TAKARA公司，產(chǎn)品名稱(chēng):TAKARAMiniBESTPlasmidpurification)回收目的DNA，操作按產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0047]1.2表達(dá)載體pET-21a-PGP3_D的構(gòu)建及鑒定
[0048]pET-2Ia載體(購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司)與PCR擴(kuò)增產(chǎn)物目的DNA片段經(jīng)BamHI和XhoI雙酶切，產(chǎn)物純化(采用TAKARA MiniBESTPlasmidpurification試劑盒，購(gòu)自六合通-北京TAKARA公司)后經(jīng)T4DNA連接酶與載體連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)(購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含氨芐青霉素(終濃度為50μ g/mL)的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑選平板上生長(zhǎng)的菌落，堿裂解法抽提質(zhì)粒，瓊脂糖凝膠電泳選擇可疑重組質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)有擴(kuò)增產(chǎn)物的重組子質(zhì)粒經(jīng)內(nèi)切酶BamHI和XhoI雙酶切、鑒定，其中有3個(gè)重組子為陽(yáng)性重組子。從3個(gè)陽(yáng)性重組子中選一個(gè)陽(yáng)性重組子送賽百勝公司測(cè)序鑒定，結(jié)果表明該質(zhì)粒上確實(shí)插入了目的基因，且插入方向正確，將此重組質(zhì)粒命名為表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-PGP3-D。
[0049]1.3表達(dá)沙眼衣原體蛋白的工程菌的構(gòu)建
[0050]將表達(dá)質(zhì)粒pET-21a-PGP3_D用`化學(xué)轉(zhuǎn)化法((美)J.薩姆布魯克(JosephSambrook),(美)D.W.拉塞爾(DavidW.Russell)著，黃培堂等譯.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南.科學(xué)出版社，2002.)轉(zhuǎn)入大腸埃希氏菌BL21 (DE3)菌株(購(gòu)自華美生物技術(shù)有限公司)，涂布于含氨芐青霉素(終濃度為50μ g/mL)的LB平板上37°C倒置培養(yǎng)過(guò)夜，次日挑選平板上生長(zhǎng)的菌落用含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基培養(yǎng)，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)4小時(shí)，誘導(dǎo)后的菌體用12% SDS - PAGE分析(同上文獻(xiàn))，結(jié)果如附圖3所示，確定表達(dá)沙眼衣原體蛋白的菌株即為所需的工程菌株大腸埃希氏菌Escherichia coli YNT pET_21a-PGP3_D CGMCCN0.8894，用甘油冷凍保存。
[0051]1.4重組沙眼衣原體蛋白的表達(dá)制備及純化
[0052]誘導(dǎo)培養(yǎng)已構(gòu)建的表達(dá)沙眼衣原體蛋白的大腸埃希氏菌，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)5小時(shí)，離心收集菌體，以質(zhì)量濃度100g/L加入菌體裂解液(50mm pH8.0Tris-Cl, 50mmNaCl,50%甘油)，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子攪拌30分鐘，經(jīng)超聲破菌(冰浴，功率200W，超聲3秒，間隔5秒，超聲80次)、組氨酸親和柱(300ml200mm的NiCl2過(guò)柱,流速5ml/min ；500ml平衡緩沖液洗注，流速10ml/min ;超聲離心后的沉淀用200ml平衡緩沖液稀釋后上樣,流速3ml/min,500ml平衡緩沖液洗注，流速5ml/min ;用分別含咪唑20mm、50mm、100mm、200mm各100ml的洗脫緩沖液洗脫，紫外檢測(cè)儀280nm檢測(cè)吸收值，收集洗脫峰；SDS — PAGE電泳檢測(cè)純化組分)得到純化的重組蛋白。
[0053]1.5沙眼衣原體重組融合蛋白鑒定
[0054]1.5.1純度和分子量的測(cè)定:經(jīng)SDS — PAGE電泳檢測(cè)(蛋白上樣量10 μ g)，為單一區(qū)帶，薄層掃描鑒定純度為97.2%。分子量約為29Kd，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)附圖3。
[0055]1.4.2濃度測(cè)定:經(jīng)Folin-酚法測(cè)定，以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)參比品，抗原蛋白濃度為 4.3±0.15mg/mL。
[0056]1.4.3 重組蛋白 Western-blot 驗(yàn)證
[0057]為驗(yàn)證重組PGP3-D型蛋白質(zhì)與抗CT抗血清反應(yīng)性及重組目的基因獲得表達(dá)并具有抗原性，用Western-blot法進(jìn)行了測(cè)試。陽(yáng)性血清為:10份兔抗CT抗體陽(yáng)性血清(購(gòu)自北京百安天地醫(yī)藥科技有限公司)和30份人抗CTIgM抗體陽(yáng)性血清(經(jīng)ELISA法檢測(cè)證實(shí))。陰性血清為:10份對(duì)照正常兔血清和30份人抗CTIgM抗體陰性血清(經(jīng)ELISA法檢測(cè)證實(shí))。結(jié)果如表1。
[0058]表1重組蛋白Western-blot驗(yàn)證結(jié)果
[0059]
【權(quán)利要求】
1.一種編碼沙眼衣原體的重組DNA，如SEQ ID N0.1所示。
2.一種沙眼衣原體蛋白，其特征在于它由權(quán)利要求1所述的重組DNA編碼，其氨基酸序列如SEQ ID N0.2所示。
3.包含權(quán)利要求1所述的沙眼衣原體蛋白的表達(dá)載體，其特征在于它是將權(quán)利要求1所述的重組DNA插入到質(zhì)粒pET-21a上得到的重組質(zhì)粒pET_21a-PGP3_D。
4.一種表達(dá)沙眼衣原體蛋白的工程菌株，其特征在于它含有權(quán)利要求3所述的表達(dá)載體pET-21a-PGP3-D，宿主菌為大腸桿菌，保藏編號(hào)為CGMCC N0.8894。
5.一種重組沙眼衣原體蛋白的制備方法，其特征在于步驟如下: 1)獲得具有SEQID N0.1所示的重組DNA ； 2)用所述重組DNA導(dǎo)入質(zhì)粒，構(gòu)建重組表達(dá)載體； 3)將所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入原核宿主細(xì)胞； 4)培養(yǎng)所述原核宿主細(xì)胞； 5)回收、純化及復(fù)性所表達(dá)的重組蛋白。
6.一種檢測(cè)沙眼衣原體感染的試劑盒，其特征在于其組分中的抗原是根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙眼衣原體蛋白。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于所述抗原是以膠體金標(biāo)記的。`
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于鼠抗人IgM單克隆抗體劃線(xiàn)包被濃度為1.0mg/ml，沙眼衣原體抗原膠體金結(jié)合物噴點(diǎn)量為60.Ομ L/cm2 ;兔抗沙眼衣原體抗體包被量為1.0 μ 1/cm,包被濃度為5.0mg/ml。
9.根據(jù)權(quán)利要求6所述的試劑盒，其特征在于用鼠抗人IgM單克隆抗體包被硝酸纖維素膜。
10.根據(jù)權(quán)利要求2所述的沙眼衣原體蛋白在制備用于檢測(cè)沙眼衣原體感染試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N1/21GK103820471SQ201410097858
【公開(kāi)日】2014年5月28日 申請(qǐng)日期:2014年3月17日 優(yōu)先權(quán)日:2014年3月17日
【發(fā)明者】張曉剛, 張秀杰, 華艷 申請(qǐng)人:英諾特（唐山）生物技術(shù)有限公司